Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Tripeptide-stabilisert Nanoemulsion av oljesyre

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å syntetisere et nanoemulsion av en oljesyre acids-platinum(II) konjugert stabilisert med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptide. Nanoemulsion skjemaene under mild syntetiske forhold via selvstendig montering av KYF og finne komplekskonjugerte.

Abstract

Vi beskriver en metode for å produsere en nanoemulsion består av en oljesyre acids-Pt(II) core og lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) belegg (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE omslutter Pt(II) 10 wt. %, diameteren 107 ± 27 nm og et negativt overflate. KYF-Pt-NE er stabil i vann og i serum, og er biologisk aktive. Bøyning av en fluorophore til KYF kan syntesen av et fluoreserende nanoemulsion som passer for biologiske bildebehandling. Syntese av nanoemulsion utføres i en vandig miljø og KYF-Pt-NE skjemaene via selvstendig montering av et kort KYF peptid og en oljesyre acids-platinum(II) konjugert. Den selv-montering prosess avhenger temperaturen i løsningen, molar forholdet mellom substrater og flow rate av underlaget tillegg. Avgjørende trinnene omfatter opprettholde optimal omrøring hastigheten under syntese, tillater nok tid for selvstendig montering og pre konsentrerer seg i nanoemulsion gradvis i en sentrifugal konsentrator.

Introduction

I de senere årene har det vært en økende interesse i prosjekteringen av nanopartikler for slike biomedisinsk programmer som narkotika-leveranser og bioimaging1,2,3,4. Multifunksjonalitet hydrogenion-baserte systemer nødvendiggjør ofte omfatter flere komponenter i en formulering. Byggeblokkene er basert på lipider eller polymerer ofte avviker i form av mekanisk-egenskaper samt deres biocompatibility og biologisk nedbrytbarhet, som til slutt kan påvirke funksjonen til nanostructure1, 5,6. Biologisk avledede materialer som proteiner og peptider, har lenge vært anerkjent som lovende komponenter av multifunksjonelle nanostrukturer på grunn av deres sekvens fleksibilitet7,8. Peptider selv montere i svært bestilte supramolecular arkitekturer danner spiralformede bånd9,10, fibrøs stillaser11,12og mange flere, dermed banet vei til bygningen biomolecule-baserte hybrid nanostrukturer bruke en bunn opp tilnærming13.

Peptider utforsket for programmer i medisin og bioteknologi, spesielt for anticancer terapi14 og karsykdommer15 så vel som for antibiotika utvikling16,17, metabolske lidelser18, og infeksjoner19. Det er over hundre av små-peptid therapeutics gjennomgår kliniske studier20. Peptidene er lett å endre og raskt å syntetisere til lave kostnader. Dessuten, er de biologisk nedbrytbart, som sterkt forenkler deres biologiske og farmasøytiske21,22. Bruk av peptider som strukturelle komponenter inkluderer prosjektering av forståelsesfull, peptid-baserte nanopartikler og hydrogel depoter for kontrollerte slipp23,24,25,26 , 27, peptid-baserte biosensors28,29,30,31eller bio-elektroniske enheter32,33,34. Viktigst, med korte peptider med to eller tre aminosyre rester som inkluderer fenylalanin ble funnet for å lede den selvtillit forsamlingen prosesser35,36,37 og opprette stabilisert emulsjoner38 .

Platina-baserte narkotika, på grunn av deres høy effekt, brukes i mange kreft behandlingsregimer, både alene og i kombinasjon med andre agenter39,40. Platina forbindelser indusere DNA skade ved å forme monoadducts og intrastrand eller interstrand cross-links. Pt-DNA lesjonene er anerkjent av den cellulære maskineriet og, hvis ikke repareres, føre til mobilnettet apoptose. Den viktigste mekanismen, som Pt(II) bidrar til celledød, er hemming av DNA transkripsjon41,42. Men er fordelene med platina terapi redusert med systemisk toksisitet av Pt(II) som utløser alvorlige bivirkninger. Dette fører til lavere klinisk dosering av Pt(II)43, noe som ofte resulterer i sub terapeutiske konsentrasjoner av platinum nå DNA. Som en konsekvens, bidrar DNA-reparasjon som følger til celle overlevelse og anskaffe Pt(II) motstand. Platina chemo-motstand er et stort problem i anticancer terapi og Hovedårsaken til behandling feil44,45.

Vi har utviklet en stabil nanosystem som innkapsler agenten Pt(II) gir en skjerming effekt i systemisk sirkulasjon og redusere Pt II-indusert bivirkninger. Systemet er basert på en oljesyre acids-Pt(II) core stabilisert med en KYF tripeptide til en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggesteinene i KYF-Pt-NE, aminosyrer i tripeptide samt oljesyre, har generelt anerkjent som Safe (GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE er utarbeidet ved hjelp av en nanoprecipitation metoden47. Kort sagt, oljesyre acids-Pt(II) konjugert oppløst i en organisk løsemiddel og deretter legges dropwise til en vandig KYF løsning (figur 1) på 37 ° C. Løsningen er rørt i flere timer slik at selv-montering av den KYF-Pt-NE. Nanoemulsion er konsentrert i 10 kDa sentrifugal konsentratorer og vasket tre ganger med vann. Kjemisk endring av KYF med en fluorophore kan syntesen av fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE egnet for biomedisinsk bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. syntese av Oleic Acids–Platinum(II) konjugert

  1. Aktivering av cisplatin
    1. Suspendere 50 mg (0.167 mmol) cisplatin i 4 mL vann (f.eks nanopure) på 60 ° C.
    2. Legge dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) av AgNO3 i 0,5 mL vann til løsningen av cisplatin og rør reaksjonen minst 2 h på 60 ° C. Den hvite utløse av AgCl vil danne indikerer fremdriften av reaksjonen.
    3. For å avgjøre hvis aktivisering reaksjonen er fullført, kan du utføre testen med 10% HCl etter gratis Ag+ ion i løsning. Testen skal være negative (ingen flere AgCl utløse bør danne).
    4. Sentrifuge reaksjonsblandingen 3,220 x g i 10 min og fjerne den hvite utløse av AgCl.
    5. Samle nedbryting og filtrere den via et 0.2 mm sprøyte filter. Teste nedbryting for tilstedeværelsen av platinum ved å bruke 2-3 dråper løsningen via Pasteur pipette SnCl2 krystaller. Testen er positiv hvis fargen på koordinere kompleks av tinn med platinum er mørk gul/orange.
    6. Bruk nedbryting med aktivert Pt(II) for det andre trinnet.
  2. Reaksjonen av oljesyre med aktivert Pt(II)
    1. Avbryte 94.2 mg oljesyre (0.333 mmol) 3 mL vann på 60 ° C.
    2. Legg 13,3 mg (0.333 mmol) av NaOH i 1 mL vann, og bland med løsning av aktivert Pt(II) fra trinn 1.1
    3. Rør reaksjonen for 2t på 60 ° C, og deretter i romtemperatur over natten. Råolje produktet er en fet brun/gul utløse.
    4. Sentrifuge reaksjonsblandingen 3,220 x g i 10 min og fjerne nedbryting. Tørr råolje produktet ved 25 ° C med en roterende fordamperen. Rense produktet av flere vasker med acetonitrile. Den endelige fargen på ren oljesyre acids–Pt(II) konjugert lysegult.

2. syntese av KYF-Pt-NE, og den FITC-merket Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Syntese av KYF tripeptide og den fluorescently merket tripeptide FITC-KYF
    1. Syntetisere KYF bruker standard SSD peptid kjemi. Bruk følgende standard kobling forhold for å koble hver aminosyre: Wang harpiks (2.19 mmol), Fmoc beskyttet aminosyre (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4,38 mmol) og diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Oppløse aminosyrer med TBTU i vannistedenfor (DMF) og DIPEA.
    2. Suge 5.7 g Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alkohol harpiks (0.382 meq/g) i 25 mL DMF for 1 h før bruk.
    3. Deprotect Amin gruppen av aminosyren L-fenylalanin med 15 mL 20% piperidine/DMF løsning 5 min, forkaste løsemiddelet og gjenta vask med 20 min syklus.
    4. Vask harpiks for 1 min med følgende løsemidlene: DMF, isopropylalkohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Kaste løsemiddelet etter hver vask.
    5. Utføre Kaiser-test for å fastslå tilstedeværelsen av gratis NH2 gruppe på harpiks (se undertrinn) og positiv (harpiks frø er lilla), legge til aminosyren Fmoc-L-Tyrosin og utføre koplingen overnatting.
      1. Forberede Kaiser test løsninger i separate flasker.
      2. Oppløse 5 g av ninhydrin i 100 mL av etanol.
      3. Oppløse 80 g av fenol i 20 mL av etanol.
      4. Bland 2 mL 0,001 M vandig løsning av kalium cyanid med
        98 mL av pyridine.
      5. Legge til 2-3 dråper hver Kaiser teste løsninger for å prøve og varme i kokende vann i 5 min.
    6. Etter vellykket koblingen av andre aminosyre, utføre Kaiser testen og hvis negativ fortsetter med deprotection protokollen (trinn 2.1.3 til 2.1.5). Gjenta prosessen med Fmoc-fenylalanin aminosyren.
      1. Ved kobling av alle aminosyrer, vask harpiks for 1 min med 5 mL DMF, IPA, DMF, metanol, diklormetan og diethyl Eter, etter hver vask kaste løsemiddelet. Lagre harpiks for videre behandling.
      2. Bruk halvparten av harpiks for de neste trinnene (2.1.7-2.1.9) for å endre peptid med FITC. For å få endret KYF tripeptide, følg prosedyren starter på 2.1.10.
    7. Endre N-terminal aminosyren av KYF til KYF-N3 med 6-azidohexanoic syre. Dette omgås 1 g (0.382 mmol) KYF Wang harpiks og 120.1 mg (0.764 mmol) av 6-azidohexanoic syre 245.2 mg (0.764 mmol) av TBTU og 197.1 mg (1.528 mmol) av DIPEA i 30 mL DMF. Rør reaksjonen over natten i romtemperatur.
    8. Hente KYF-FITC syntese av KYF-N3 med propargyl fluorescein via en klikk reaksjon. Dette omgås 253 mg (0.097 mmol) av KYF-N3 Wang harpiks 3.78 mg (0.019 mmol) CuI solid 71.9 mg (0.193 mmol) av propargyl fluorescein og 2.24 mg (0.017 mmol) av DIPEA. Reaksjonen bør endre farge fra grønt til brun.
    9. 24 h, vaskes harpiks for 1 min vekselvis med 5 mL DMF og IPA fem ganger, metanol og vann tre ganger, DMF og vann tre ganger, og med diklormetan og diethyl Eter tre ganger. Kaste løsemiddelet etter hver vask.
    10. Holde seg til KYF-FITC eller KYF peptid fra harpiks med en løsning av trifluoroacetic syre (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) /H2O på forholdet mellom 95/2.5/2.5 over 3 timer.
    11. Utløse den rå peptid i en kald diethyl Eter, vask thrice med kaldt Eter, og deretter tørr under vakuum.
  2. Syntese av FITC-KYF-stabilisert nanoemulsion med Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) og KYF-Pt-NE
    1. Oppløse 10 mg (0.0126 mmol) av oleic acids–Pt(II) konjugert i 1,5 mL isopropanol og plass i en 5 mL sprøyte.
    2. Plasser sprøyten med oljesyre acids–Pt(II) konjugert i en sprøytepumpe og angi flyten til 0,1 mL/min.
    3. For å syntetisere den FITC-KYF-Pt-NE, oppløse 1 mg (0.00105 mmol) av FITC-KYF og 1 mg (0.00219 mmol) av KYF (1:2 molar forholdet mellom FITC-KYF:KYF) i 20 mL vann og justere temperaturen i løsning på 37 ° C. Dekk veggene i beholderen med aluminiumsfolie for å unngå photobleaching av FITC fluorophore. For å syntetisere KYF-Pt-NE, løses 2 mg (0.0044 mmol) av KYF tripeptide i 20 mL vann og justere temperaturen på løsningen på 37 ° C.
    4. Legge til oljesyre acids–Pt(II) konjugert dropwise i løsning av FITC-KYF/KYF eller KYF tripeptide. Utføre dette trinnet under panseret.
    5. Rør løsningen over natten i romtemperatur å fordampe organiske løsemidler og å tillate den selv-montering av FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE.
    6. Konsentrere det FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE i en sentrifugal konsentrator (10k MWCO), og vask thrice med 4 mL nanopure vann.
    7. Lagre vandige løsninger KYF-Pt-NE og FITC-KYF-Pt-NE på 4 ° C.
    8. Analysere for platinum innhold ved hjelp av atomic absorpsjon spektroskopi (AAS) etter produsentens guide48.
      1. Forberede platina standarder i 10% HCl løsning kalibreringskurven (effektiv rekkevidde for AAS er mellom 100 til 1200 ppb (parts per milliard)).
      2. Oppløse 50 µL KYF-Pt-NE løsning fra trinn 2.2 i 100 µL av Kongevann (kombinasjon 3:1 konsentrert saltsyre og salpetersyre) og la ved romtemperatur over natten. Legge til 850 µL av vann til å nå et siste eksempel volum 1 ml. Analysere eksempel bruker AAS. Siste syre konsentrasjonen bør være 10% i alle analyserte prøver.
      3. Registrere lesing Pt konsentrasjon i ppb og beregne det endelige platina innholdet i utvalget (konto for eksempel fortynning og første volum av nanoemulsion).

3. AC confocal avbildning av mobilnettet opptaket av FITC-KYF-Pt-NE

  1. Frø 6 eggstokkreft linjer (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G og ES2), til 4 vel-kammer AC confocal retter på tettheten av 4.7 x 104 celler per kammer og pre kultur over natten på 37 ° C.
  2. 24 h, vaskes cellene tre ganger med fosfat buffer saltvann (PBS) og Inkuber med FITC-KYF-Pt-NE i celle kultur medium (se trinn 6.1 for celle linje spesifikke detaljer) i 15 min på 37 ° C.
  3. Etter inkubasjon fjerne media og vask cellene tre ganger med PBS.
  4. Fastsette cellene med kaldt metanol i 5 min på 20 ° C og vaskes tre ganger med 1 mL av PBS.
  5. Permeabilize cellene med 1 mL av 0,1% Triton-X for 10 min ved romtemperatur og vask tre ganger med 1 mL av PBS.
  6. Inkuber celler for 90 min med LAMP1 antistoffer konjugert med Alexa Fluor 647 (1 mL) på 1:50 fortynning i PBS ved romtemperatur. Deretter vaskes cellene 3 ganger med PBS.
  7. Fortynn DAPI lager løsning (1 mg/mL) 1 mg/mL i PBS. Deretter legge 1 mL av utvannet løsningen til hvert kammer og ruge i 15 min ved romtemperatur. Vask cellene 3 ganger med PBS.
  8. Montere coverslips på et lysbilde ved hjelp av montering medium.
  9. Bilde cellene med levende celle AC confocal mikroskopet på eksitasjon bølgelengden til 405 nm, 488 nm og 633 nm. Angi parametere for oppdagelsen som følger: laser makt fra 0,2% og mer enn 1%, Pinole 1 luftige enhet, få master 650-750, Digital offset 0.
  10. Åpne bildet i bildebehandlingsprogrammer. Velg grafikk under visningsbildet, og velg Sett inn skala Bar, sette inn feltet skala til bildet.

4. stoff utgivelsen studier

  1. Utføre medikament utgivelsen studier i PBS. Justere pH-verdier av tre PBS buffere 7.4, 6.8 og 5.0 henholdsvis.
  2. Fortynne 5 μL KYF-Pt-NE i 180 μL riktig pH PBS buffer, overføre til 3,5 kDa MWCO mini dialyse cup og ruge på 37 ° C i PBS.
  3. Fjerner bufferen fra hvert tre mini dialyse rør på 2, 4, 6, 24, 48 og 140 h og måle platina konsentrasjonen av AAS. Forberede alle prøver etter trinn 2.2.8 men justere det siste bindet prøve å 500 µL.

5. celle kultur metoder

  1. Kultur cellen linjer A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 i celle kultur medium (DMEM) supplert med 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) eller med 15% (TOV - 21G, OV-90) fetal bovin serum (FBS), L-glutamin og penicillin/streptomycin. Vokse alle celler i en 5% CO2, vann mettet atmosfære på 37 ° C.
  2. Frø 3 x 105 cellene i hver 96-brønns plate og pre kultur over natten for i vitro inkubasjon eksperimenter. Forberede KYF-Pt-NE, cisplatin og carboplatin løsninger i vann. Justere konsentrasjonen av Pt(II) i KYF-Pt-NE å matche konsentrasjonen av carboplatin og cisplatin for hver celle linje. Inkuber i 72 timer på 37 ° C.
  3. Etter inkubasjon evaluere mobilnettet levedyktigheten bruker en kolorimetrisk analysen (MTT celle spredning analysen). Kort, fjerne middels og legge til 110 μL 10% MTT i medium til hver godt og ruge 2 h på 37 ° C. Deretter tilsett 100 μL vaskemiddel hver brønn og Inkuber 5 h på 37 ° C.
  4. Sjekk absorbans ved 570 nm ved hjelp av platen leseren. Analysere resultatene med statistisk analyse med Z-test og P-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant TEM bilde av KYF-Pt-NE tilberedt med denne protokollen er vist i figur 2A. KYF-Pt-ne er sfærisk i morfologi, godt spredt, og jevn i størrelse. Kjernen diameteren på KYF-Pt-ne, målt direkte fra tre TEM bilder med minimum 200 målinger gjort, er 107 ± 27 nm. Etter diameteren på KYF-Pt-NE, analysert ved hjelp av dynamiske lys spektroskopi (DLS), ble funnet for å være 240 nm med polydispersity indeks av 0.156. Zeta potensialet i KYF-Pt-NE i vann ble fastslått for tre uavhengige synteser med gjennomsnittlig verdi av-60.1 mV. Høy omfanget av potensialet angir god kolloidalt stabilitet av utformingen, og negativ overflaten ladning tilskrives ionisert COO- overflaten grupper av oleic syrer. Den isoelectric point KYF er 8.59, og derfor er det positivt ladede på nøytral pH.

Evne til nanoemulsions å krysse mobilnettet membranen ble undersøkt ved hjelp av de fluorescently merket FITC-KYF-Pt-NE og eggstokkreft kreftcelle linjene. Resultatene presenteres i figur 2B. Det kan være tydelig sett at FITC-KYF-Pt-ne (grønn) er fordelt i stoffer, men ennå ikke var tilknyttet lysosomer (rød). Dette resultatet viser at KYF-Pt-ne angi celler og kan tjene som intracellulær stoffet levering kjøretøy.

Stabiliteten av KYF-Pt-NE og FITC-KYF-Pt-ne ble vurdert med Distribusjonslister. Diameteren på nanoemulsions i vann ble målt over flere måneder, og resultatene vises i Figur 3. Etter diameteren på begge formuleringer sakte økt i løpet av 4 måneder i lagring, til 320 nm (KYF-Pt-NE) og 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), men nanoskala dimensjonene ble bevart. Dette resultatet antyder at KYF tripeptide effektivt stabiliserer nanoemulsions over lengre tid.

Pt(II) innkapsling effektivitet og frigjøring fra nanoemulsion ble målt med AAS. Pt(II) konsentrasjonen i KYF-Pt-NE etablert for å være 10 wt.%. Pt(II) utgivelse fra KYF-Pt-NE ved pH 7,4 (fysiologiske), 6.8 (stoffet interstitium)49og 5.0 (endosomal)50 vises i figur 4A. Den Pt(II) versjonen er den tregeste ved pH 7.4 med bare 20.8% av Pt(II) utgitt etter 4 h, mens ved pH 6.8 og 5.0 utgivelsen var 32.8% av og 47.5%, henholdsvis. Den samme trenden fortsatte etter 24 timer og etter 6 dager. Resultatet indikerer at Pt(II) fra KYF-Pt-NE er pH avhengige, og det kan være forsinket i systemisk sirkulasjon, og akselerert når nanoemulsions translocate i svulst.

Den biologiske aktiviteten til KYF-Pt-NE ble etablert i vitro bruker samme eggstokkreft cellelinjer som imaging studier. Cellene ble inkubert med KYF-Pt-NE for 72 h, på KYF-Pt-NE konsentrasjoner tilsvarer IC50 for hver celle linje. Levedyktigheten ble vurdert ved hjelp av MTT analysen og resultatene var sammenlignet bare celler, KYF-NE, oljesyre acids-Pt(II) konjugert, carboplatin og cisplatin. Resultatene av biologiske aktiviteten til KYF-Pt-NE er vist i figur 4B. KYF-Pt-NE redusert levedyktighet av isogenic cellelinjer A2780 (Pt følsom) og CP70 (Pt motstandsdyktig) av 44,3% og 46.2% henholdsvis. Carboplatin, klinisk relevante analog, redusert levedyktighet av 18,5% (A2780) og 9.6% (CP70) bare. Den samme trenden med større KYF-Pt-NE effekt på celledød ble observert over andre linjer også. Levedyktigheten til Pt(II) følsom TOV - 21G celler ble redusert med 55.9% etter inkubasjon med KYF-Pt-NE, mens carboplatin resulterte i senke levedyktighet av bare 16,5%. I OV-90 celler med middels Pt(II) motstand, ble levedyktigheten senket av 55.3% (KYF-Pt-NE) og 23,9% (carboplatin). De to motstandsdyktig kreftcelle linjene, ES-2 og SKOV-3, viste reduksjon i levedyktighet av 45.9% og 54.3%, henholdsvis for KYF-Pt-NE, og 10,3% (ES-2) og 16,8% (SKOV-3) for carboplatin.

Den biologiske aktiviteten til KYF-Pt-NE versus cisplatin ble også sammenlignet. Cisplatin er den Pt II-baserte agenten for første generasjonen som ikke lenger foretrukket i klinikken på grunn av sin toksisitet profil51. I to cellelinjer, SKOV-3 og TOV - 21G, var levedyktighet reduksjon større med 15% og 40%, henholdsvis for KYF-Pt-NE enn for cisplatin. I de resterende cellelinjer, aktiviteten til KYF-Pt-NE var sammenlignbar med cisplatin (A2780, CP70, OV-90) eller lavere litt (ES-2). Oljesyre acids-Pt(II) konjugert ble også funnet for å være biologisk aktive. Men viste KYF-Pt-NE høyere reduksjon levedyktigheten enn konjugert i fleste cellelinjer testet, angir betydningen av nanoformulation Pt(II) aktivitet.

De biologiske programmene nanoparticulate systemer krever stabilitet i biologisk relevante medier, dermed stabiliteten i KYF-Pt-NE ble evaluert i 20% fosterets bovin serum (FBS) og resultatene presenteres i figur 4C. Vi fant bevis for KYF-Pt-NE opsonization i serum etter en dag med inkubering.

Figure 1
Figur 1. Komponenter av nanoemulsions (øverst) og skjematisk av nanoemulsion utarbeidelse (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. TEM bilde av KYF-Pt-NE (A) og AC confocal mikroskop bilder av FITC-KYF-Pt-NE (grønn) opptak av eggstokkreft celler (kjerner er blå og lysosomer er røde) (B). Skala barer er 10 μm. Dette tallet har blitt tilpasset med tillatelse fra Bioconjugate kjemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Stabilitet KYF-Pt-NE og FITC-KYF-Pt-NE i vann. Hvert punkt representerer gjennomsnittet og standardavviket for N = 3 og p <0.005. Dette tallet har blitt tilpasset med tillatelse fra Bioconjugate kjemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. KYF-Pt-NE stabilitet og biologisk aktivitet. (A) Pt(II) utgivelse fra KYF-Pt-NE i PBS buffer ved ulike pHs (PBS, 37 ° C). Mobilnettet levedyktigheten til forskjellige eggstokkreft linjer etter 72 h inkubasjon med KYF-Pt-NE (B). Hver kolonne representerer gjennomsnittet og standardavviket for N = 3 og p <0.005. Konsentrasjonen er konstant i hver celle linje og er som følger: 4.92 mM (A2780), 8.80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9,84 mM (SKOV3), 7.38 mM (ES-2), være 19.7 mM (OV-90). Konsentrasjonen av KYF-Pt-NE og oleic acids–Pt(II) konjugert ble justert med hensyn til Pt(II) innhold målt ved AAS. Forkortelser: "Carbpt"-carboplatin; «KYF-NE"-KYF tripeptide-belagt nanoemulsion; «KYF-Pt-NE"-KYF tripeptide-belagt nanoemulsion som inneholder Pt(II); Cispt-cisplatin; PT-oljesyre-oljesyre acids–Pt(II) konjugert. (C) KYF-Pt-NE stabilitet i serum. Dette tallet har blitt tilpasset med tillatelse fra Bioconjugate kjemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avgjørende skritt i nanoemulsion syntese inkluderer justere molar forholdet mellom substrater, opprettholde temperaturen og flyt kontroll under oljesyre acids–Pt(II) tillegg, gir tilstrekkelig tid for selvstendig montering og rense produktet ved hjelp av en sentrifugalpumper konsentrator kolonne. Disse parameterne påvirke størrelse og morfologi av KYF-Pt-NE; Dermed er det spesielt viktig å opprettholde riktig molar forholdet og justere syntetiske betingelsene riktig.

Forholdet mellom substrater under nanoemulsion syntese (trinn 3) er avgjørende for den selv-montering prosess og bestemmer den endelige størrelsen på produktet. KYF oljesyre acid-Pt(II) molar forhold er 1:3, og optimale konsentrasjonen av KYF tripepide i vann er 0.2 mM. I tillegg har organisk løsemiddelet brukes å oppløse oljesyre acid-Pt(II) konjugert i trinn 3.1 blandbar med vann, kompatibel med filtreringssystem, og fordamping enkelt ved romtemperatur.

En av de viktige trinnene er dropwise oljesyre acid-Pt(II) konjugert til KYF løsning (trinn 3.4). Flyten bør ikke være lavere enn 0,1 mL/min og ikke raskere enn 0,2 mL/min, fordi en sub-optimal hastighet kan indusere nedbør av nanoemulsion. Også bør oljesyre acids–Pt(II) konjugert legges til KYF løsning på 37 ° C mens du rører i blandingen på et rør plate 600 RPM. Når alle de oljesyre acid-Pt(II) har lagt, bør løsningen holdes i romtemperatur og omrøring hastigheten reduseres til 150 rpm. 3.5 trinn skal utføres ved romtemperatur. Det optimale tidspunktet for den selv-montering av den KYF-Pt-NE (trinn 3,5) er 24 timer.

Det er en risiko for at produktet kan utløse mens nanoemulsion blir pre konsentrert. Derfor anbefales det at nanoemulsion være fortynnet med vann før blir sentrifugeres i en sentrifugal konsentrator og spunnet ingen raskere enn 2,465 x g. Utvannet nanoemulsions skal legges til sentrifugal presisjonstørking på dele mellom spinnene, og nanoemulsion skal blandes i filteret før den neste delen legges.

Muligheten til å skjemaet nanoemulsions med fettsyrer derivater enn oljesyre har ikke blitt testet og er ennå ikke fastslås. Framtidige applikasjoner kan omfatte bruk av ulike peptider å lette co samlingen med oljesyre. Oljesyre conjugates med ikke-platinum-baserte stoffer kan også brukes som potensielle kjerner av nanoemulsions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke en interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner takknemlig støtte fra National Cancer Institute, gi SC2CA206194. Ingen konkurrerende økonomiske interesser er deklarert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Bioteknologi problemet 144 Nanoemulsion oljesyre tripeptide anticancer terapi biologiske bildebehandling narkotika-leveranser
En Tripeptide-stabilisert Nanoemulsion av oljesyre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter