Summary
Этот протокол описывает эффективный метод синтеза nanoemulsion олеиновая acids-platinum(II) конъюгата, стабилизировалось с трипептид лизин тирозин фенилаланин (KYF). Nanoemulsion формы умеренный синтетических условиях через самостоятельной сборки KYF и сопряженное.
Abstract
Мы опишем способ получения nanoemulsion, состоящий из олеиновая acids-Pt(II) ядро и покрытие лизин тирозин фенилаланин (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE инкапсулирует Pt(II) на 10% веса, имеет диаметр 107 Нм ± 27 и отрицательный заряд поверхности. KYF-Pt-NE стабилен в воде и в сыворотке крови и биологически активен. Спряжение Флюорофор к KYF позволяет синтеза люминесцентных nanoemulsion, которая подходит для биологической обработки изображений. Синтез nanoemulsion проводится в водной среде и KYF-Pt-NE форм через самосборки коротких пептида KYF и олеиновая acids-platinum(II) конъюгата. Самостоятельной сборки процесс зависит от температуры раствора, молярное соотношение субстратов и скорость потока добавления субстрата. Важнейшие шаги включают поддержание оптимальной скорости перемешивания во время синтеза, разрешительные достаточное время для самостоятельной сборки и предварительно сконцентрировав nanoemulsion постепенно в центробежных концентратор.
Introduction
В последние годы наблюдается растущий интерес к инженерии наночастицы для таких биомедицинских приложений как поставки наркотиков и bioimaging1,2,3,4. Многофункциональность систем на основе наночастиц часто обусловливает необходимость включения нескольких компонентов в рамках одной разработке. Строительные блоки, которые часто основаны на липиды или полимеры отличаются с точки зрения их физико-химических свойств, а также их биосовместимости и способность к биологическому разложению, которое в конечном итоге может повлиять на функции наноструктурированных1, 5,6. Биоселективного материалы, такие как белки и пептиды, давно были признаны перспективным компоненты многофункциональных наноструктур из-за их гибкость последовательности7,8. Пептиды, самостоятельно собрать в весьма упорядоченный супрамолекулярные архитектуры, образуя цилиндрические лентами9,10, волокнистых подмостей11,12и многие другие, проложив тем самым путь к зданию снизу вверх наноструктур на основе биомолекулы гибридный подход к13.
Пептиды были изучены для приложений в области медицины и биотехнологии, особенно для противоопухолевой терапии14 и сердечно-сосудистых заболеваний15 а что касается антибиотик развития16,17, метаболический расстройства18и инфекции19. Существует более сотни малых пептид терапевтов проходят клинические испытания20. Пептиды легко изменить и быстро, чтобы синтезировать при низких затратах. Кроме того они являются биологически, что значительно облегчает их биологических и фармацевтических приложения21,22. Использование пептидов как структурных компонентов включает в себя техники реагировать, на основе пептида наночастиц и складов Гидрогель для контролируемого высвобождения23,24,25,26 , 27, биосенсоры на основе пептида28,,2930,31или био электронных устройств32,,3334. Важно отметить, что даже короткие пептиды с двумя или тремя аминокислотных остатков, которые включают фенилаланина были найдены для самостоятельной сборки процессов35,,3637 и создавать стабилизированные эмульсии38 .
Препараты на основе платины, ввиду их высокой эффективности, используются в многих схем лечения рака, как самостоятельно, так и в сочетании с другими агентами39,40. Платиновый соединений вызвать повреждение ДНК, образуя monoadducts и intrastrand или interstrand перекрестные ссылки. Pt-ДНК поражения распознаются клеточными и, если не отремонтированы, привести к сотовой апоптоз. Наиболее важный механизм, по которому Pt(II) способствует гибели клеток рака, является ингибирование транскрипции ДНК41,42. Однако преимущества платиновой терапии уменьшаются по системной токсичности Pt(II), что вызывает серьезные побочные эффекты. Это приводит к нижней клинических дозирование Pt(II)43, которая часто приводит к югу терапевтические концентрации платины, достигнув ДНК. Как следствие репарации ДНК, который следует способствует выживание клетки рака и приобретения Pt(II) сопротивления. Платиновый химио сопротивление является серьезной проблемой в противоопухолевой терапии и основной причиной неудачи лечения44,45.
Мы разработали стабильной наносистем, инкапсулирующий агент Pt(II) для того чтобы обеспечить защитный эффект в кровообращения и уменьшить побочные эффекты Pt II-индуцированной. Система основана на ядре олеиновая acids-Pt(II) стабилизированы с KYF трипептид сформировать nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Строительные блоки KYF-Pt-NE, аминокислоты, трипептид, так и олеиновой кислоты, имеют статус обычно признается как безопасное (GRAS) с продуктами питания и лекарствами (FDA). KYF-Pt-NE готовится с помощью метода nanoprecipitation47. Короче говоря олеиновая acids-Pt(II) конъюгата растворяется в органических растворителях и затем добавлены каплям водный раствор KYF (рис. 1) при 37 ° C. Раствор перемешивали за несколько часов, чтобы позволить самостоятельной сборки из KYF-Pt-NE. Nanoemulsion в основном в 10 кДа Центробежные концентраторы и три раза промывают водой. Химическая модификация KYF с Флюорофор позволяет синтеза люминесцентных FITC-KYF-Pt-NE для биомедицинских изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. синтез конъюгата олеиновая Acids–Platinum(II)
- Активация цисплатин
- Приостановить 50 мг (0,167 ммоль) цисплатина в 4 мл воды (например, nanopure) при температуре 60 ° C.
- Добавить прикапывают 55.2 mg (0.325 ммоль) AgNO3 в 0,5 мл воды в раствор цисплатина и перемешать реакции для по крайней мере 2 часа при температуре 60 ° C. Белый преципитат AgCl сформирует, указывающее ход реакции.
- Чтобы определить, завершилась ли реакции активации, выполнить тест с 10% HCl на наличие свободных ионов Ag+ в растворе. Тест должен быть отрицательным (без дополнительных AgCl осадок должен форма).
- Центрифуга реакционную смесь на 3220 x g 10 мин и удалить Белый преципитат AgCl.
- Собирать супернатант и фильтровать его через фильтр шприц 0,2 мм. Тестирование супернатант наличие платины, применяя 2-3 капли раствора через пипетку Pasteur SnCl2 кристаллов. Тест является положительным, если цвет координат комплекса олова с платиновым темно желто оранжевый.
- Используйте супернатант с активированной Pt(II) на втором шаге.
- Реакция олеиновой кислоты с активированной Pt(II)
- Приостановить 94,2 мг олеиновой кислоты (0.333 ммоль) в 3 мл воды при температуре 60 ° C.
- Добавить 13.3 мг (0.333 ммоль) NaOH в 1 мл воды и смешивают с раствором активированного Pt(II) из шага 1.1
- Перемешайте реакции на 2 ч при температуре 60 ° C и далее при комнатной температуре на ночь. Сырой продукт является жирной желто коричневый осадок.
- Центрифуга реакционную смесь на 3220 x g 10 мин и удалить супернатант. Сухие сырой продукт при 25 ° C, с помощью роторный испаритель. Очищайте продукт путем многократной стирке с ацетонитриле. Окончательный цвет чистого олеиновая acids–Pt(II) конъюгата — бледно-желтый.
2. синтез KYF-Pt-NE и FITC-меченых Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE
- Синтез KYF трипептид и дневно обозначенные трипептид FITC-KYF
- Синтезировать KYF с помощью стандартных твердотельных пептидной химии. Использовать следующие стандартные муфты условий для присоединения каждой аминокислоты: Ван смолы (2.19 ммоль), защищены Fmoc аминокислота (4.38 ммоль), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Тетрафтороборат (TBTU) (4.38 ммоль) и diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 ммоль). Распустить аминокислоты с TBTU в диметилформамиде (DMF) и DIPEA.
- Замочите 5.7 g Fmoc-L-пе 4-alkoxybenzyl спирт смолы (0,382 мг-экв/г) в 25 мл ДМФ за 1 ч до использования.
- Deprotect аминовая группа L-фенилаланина аминокислоты с 15 мл 20% раствора пиперидина/DMF для 5 мин, отказаться от растворителя и повторите мыть с циклом 20 мин.
- Вымойте смолы для 1 мин с следующие растворители: ДМФ, изопропиловый спирт (IPA), ДМФ, IPA, ДМФ, IPA, ДМФ, ДМФ. Отказаться от растворителя после каждой стирки.
- Кайзер тест для определения наличия свободной NH2 группы на смолае (см. подэтапы) и если положительный (смола семян фиолетовый), добавить Fmoc-L-тирозин аминокислоты и выполнять муфту на ночь.
- Подготовьте Кайзер тест решений в отдельных бутылок.
- Растворяют 5 g Нингидрин в 100 мл этанола.
- Растворите 80 г фенола в 20 мл этанола.
- Смешать 2 мл 0,001 М водный раствор цианистого калия с
98 мл пиридина. - Добавьте 2-3 капли каждого Кайзер тестов решения для образца и тепла в кипящую воду на 5 мин.
- После успешного соединения второй аминокислоты, выполнить тест Кайзер и если отрицательный приступить к deprotection протоколу (шаги 2.1.3 до 2.1.5). Повторите процесс с Fmoc фенилаланина аминокислоты.
- После соединения всех аминокислот, мыть смолы для 1 мин с 5 мл ДМФ, IPA, ДМФ, метанол, дихлорметана и диэтиловом эфире, после каждого мытья отказаться от растворителя. Сохраните смолы для дальнейшей обработки.
- Для изменения пептид с FITC, используйте половину смолы для последующих шагов (2.1.7-2.1.9). Для получения неизмененным KYF трипептид, следуйте процедуре, начиная 2.1.10.
- Измените N-терминальный аминокислоты KYF3 KYF-N с 6-azidohexanoic кислота. С этой целью смешайте 1 g (0,382 ммоль) Ван KYF смолы и 120,1 мг (0.764 ммоль) 6-azidohexanoic кислоты с 245.2 мг (0.764 ммоль) TBTU и 197.1 мг DIPEA в 30 мл DMF (1.528 ммоль). Перемешайте реакции на ночь при комнатной температуре.
- Получите KYF-FITC синтез KYF-N3 с Пропаргиловый флуоресцеин через реакцию нажмите. С этой целью смешивают 253 мг (0,097 ммоль) KYF-N3 Ван смолы с 3.78 мг (0,019 ммоль) Цуй твердых, 71.9 мг (0,193 ммоль) флуоресцеин Пропаргиловый и 2,24 мг (0,017 ммоль) DIPEA. Реакция должна изменить цвет от зеленого до коричневого.
- После 24 часов мыть смолы 1 мин попеременно с 5 мл DMF и IPA пять раз, метанола и воды трижды, DMF и воды трижды и дихлорметана и диэтиловый эфир трижды. Отказаться от растворителя после каждой стирки.
- Рассекающий удар KYF-FITC или KYF пептид из смолы с раствором trifluoroacetic кислоты (ТФК) / triisopropylsilane (советы) / h2O на соотношение 95/2.5/2.5 более 3 часов.
- Осадок сырой пептида в холодной диэтиловым эфиром, промыть трижды с холодной эфира, а затем сухой под вакуумом.
- Синтез FITC-KYF-стабилизированный nanoemulsion с Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) и KYF-Pt-NE
- Растворите 10 мг (0.0126 ммоль) конъюгата олеиновая acids–Pt(II) в 1,5 мл изопропанола и место в шприц 5 мл.
- Шприц с пероксидазой олеиновая acids–Pt(II) в шприцевой насос и задать направление в 0,1 мл/мин.
- Для того, чтобы синтезировать FITC-KYF-Pt-NE, растворить 1 мг (0,00105 ммоль) FITC-KYF и 1 мг (0.00219 ммоль) KYF (1:2 молярное соотношение FITC-KYF:KYF) в 20 мл воды и отрегулировать температуру раствора до 37 ° C. Покрывают стены контейнера с алюминиевой фольгой, чтобы избежать Фотообесцвечивание Флюорофор FITC. Синтезировать KYF-Pt-NE, Растворите 2 мг (0,0044 ммоль) из KYF трипептид в 20 мл воды и отрегулировать температуру раствора до 37 ° C.
- Добавьте олеиновая acids–Pt(II) конъюгата каплям решение трипептид FITC-KYF/KYF или KYF. Выполните этот шаг под капотом.
- Перемешать раствор на ночь при комнатной температуре испарения органических растворителей и позволить самостоятельной сборки из FITC-KYF-Pt-NE или KYF-Pt-NE.
- Концентрат FITC-KYF-Pt-NE или KYF-Pt-NE в центробежных концентратор (10k MWCO) и промыть трижды с 4 мл nanopure воды.
- Хранить водных растворов KYF-Pt-NE и FITC-KYF-Pt-NE при 4 ° C.
- Анализ платины содержимого с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (AAS), после производителя руководство48.
- Подготовить Платиновый стандартов в 10% HCl решение для калибровочной кривой (эффективный диапазон для ААС составляет от 100 до 1200 мкг/кг (частей на миллиард)).
- Растворяют 50 мкл раствора KYF-Pt-NE от шаг 2,2 в 100 мкл aqua regia (смесь 3:1 концентрированной соляной кислоты и азотная кислота) и оставить на ночь при комнатной температуре. 850 мкл воды для достижения окончательной выборки объемом 1 мл. Анализ образца с помощью ААС. Конечная концентрация кислоты должна быть 10% во всех проанализированных пробах.
- Запись чтение Pt концентрации в ppb и вычислить окончательное содержание платины в образце (счет для разбавления образца и первоначальный объем nanoemulsion).
3. конфокальная томография клеточного поглощения FITC-KYF-Pt-NE
- Семя 6 линий клеток рака яичников (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G и ES2), в 4 хорошо камеры конфокальные блюда на плотность 4,7 х 104 клетки на камеру и предварительно культура на ночь при 37 ° C.
- После 24 ч, вымыть клетки трижды с фосфатный буфер (PBS) и проинкубируйте с FITC-KYF-Pt-NE в среде культуры клеток (см. шаг 6.1 для клеток линии конкретных деталей) для 15 мин при температуре 37 ° C.
- После инкубации удалите средства массовой информации и вымыть клетки три раза с PBS.
- Исправьте клетки с холодной метанола для 5 мин при 20 ° C и стирать три раза с 1 мл раствора PBS.
- Разрушения клеток в 1 мл 0,1% тритон-X 10 мин при комнатной температуре и мыть три раза с 1 мл ФСБ.
- Проинкубируйте клетки для 90 минут с LAMP1 антитело проспряганное с Alexa Fluor 647 (1 мл) в 1:50 разрежения в PBS при комнатной температуре. Далее Вымойте клетки 3 раза с PBS.
- Разбавьте DAPI Стоковый раствор (1 мг/мл) до 1 мг/мл в PBS. Затем добавить 1 мл разбавленного раствора в каждой камере и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки 3 раза с PBS.
- Гора coverslips на слайде с помощью установки среды.
- Изображение клетки, с использованием живой клетки конфокального микроскопа в возбуждения волны 405 нм, 488 нм и 633 нм. Установите параметры обнаружения как следовать: мощности лазера от 0,2% и не более 1%, Pinole 1 воздушные подразделения, получить мастер 650-750, цифровой смещение 0.
- Открыть изображение в визуализации программного обеспечения. Изображение выберите графика и выберите Вставить линейку, чтобы вставить панель масштаб изображения.
4. препарат выпуска исследования
- Провести исследования выпуск препарата в PBS. Отрегулируйте значения рН три PBS буферов до 7,4, 6,8 и 5.0 соответственно.
- Разбавить 5 мкл KYF-Pt-NE в 180 мкл буфера PBS соответствующие рН, передача 3,5 кДа MWCO мини-диализа Кубок и инкубировать при 37 ° C в PBS.
- Удаление буфера из каждого три мини-диализа трубы в 2, 4, 6, 24, 48 и 140 h и измерять концентрации Платиновый ААС. Подготовить все образцы согласно шаг 2.2.8 но окончательного громкость образца до 500 мкл.
5. клетки культуры методы
- Культура клеток линии A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, ООО - 21G, ES-2 в ячейку культуры среднего (DMEM) дополнены с 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) или с 15% (ООО - 21G, OV-90) плода бычьим сывороточным (ФБС), с L-глютамина и пенициллин/стрептомицина. Расти все клетки в 5% CO2, насыщенная атмосфера воды при 37 ° C.
- Семенной 3 x 105 клеток в каждом 96-луночных пластины и предварительно культуры на ночь для экспериментов в пробирке инкубации. Подготовьте KYF-Pt-NE, цисплатина и карбоплатин решения в воде. Регулировка концентрации Pt(II) в KYF-Pt-NE соответствует концентрации карбоплатин и цисплатин для каждой ячейки строки. Инкубируйте 72 часов при 37 ° C.
- После инкубации оцените клеточной жизнеспособности, с использованием колориметрического анализа (assay пролиферации клеток МТТ). Вкратце удалите среды и добавьте 110 мкл 10% МТТ в среде каждому хорошо и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C. Затем добавьте 100 мкл моющего средства в каждой скважине и проинкубируйте втечение 5 ч при 37 ° C.
- Проверьте поглощения в 570 Нм с помощью пластины читателя. Анализировать результаты статистического анализа с помощью Z-тест и P-тест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель ТЕА изображение KYF-Pt-NE приготовленные этот протокол будет показано на рисунке 2A. KYF-Pt-нес сферических в морфологии, хорошо рассеяны и одинаковыми по размеру. Диаметр сердечника KYF-Pt-нес, измеряется непосредственно из трех изображений ТЕА с минимум 200 измерений, — 107 Нм ± 27. Гидродинамические диаметр KYF-Pt-NE, анализируются с помощью динамического света спектроскопии (DLS), было установлено 240 Нм с индексом полиизопрена 0,156. Потенциал Зета KYF-Pt-NE в воде было определено для трех независимых синтезы с среднее значение-60.1 МВ. Высокая величина потенциала показывает хорошую коллоидного стабильность формулировки, и отрицательный заряд поверхности приписывается ионизированные СОО– поверхности групп олеиновой кислот. Изоэлектрическая точка KYF является 8.59, и поэтому она положительно заряженных на нейтральном pH.
Nanoemulsions возможность пересечь клеточную мембрану рассматривался с использованием дневно обозначенные FITC-KYF-Pt-NE и яичников рак клеточных линий. Результаты представлены на рисунке 2B. Это ясно видно что FITC-KYF-Pt-NEs (зеленый) распределяются в цитозоле, но еще не были связаны с лизосом (красный). Этот результат демонстрирует, что KYF-Pt-нес ввести клетки и может служить в качестве внутриклеточного наркотиков доставки транспортного средства.
Стабильность KYF-Pt-нес и FITC-KYF-Pt-NEs была оценена с DLS. Диаметр nanoemulsions в воде была измерена в течение нескольких месяцев, и результаты представлены на рисунке 3. Гидродинамические диаметр обеих формулировок постепенно увеличилось в течение 4 месяцев в хранилище, до 320 нм (KYF-Pt-NE) и 240 Нм (FITC-KYF-Pt-NE), но наноуровне размеры были сохранены. Этот результат свидетельствует о том, что KYF трипептид эффективно стабилизирует nanoemulsions течение длительного времени.
Pt(II) эффективность инкапсуляции и освобождение от nanoemulsion были измерены с ААС. Концентрация Pt(II) в KYF-Pt-NE была создана 10 wt.%. Pt(II) освобождение от KYF-Pt-NE на рН 7,4 (физиологические), 6,8 (опухоли интерстиция)49и 5.0 (от англ)50 представлена в рисунке 4A. Релиз Pt(II) является самым медленным в рН 7,4 только с 20,8% Pt(II), освобожден после 4 ч, в то время как при pH 6.8 и 5.0 релиз был 32,8% и 47,5%, соответственно. Же тенденция сохранялась и после 24 ч и 6 дней. Этот результат означает, что релиз Pt(II) от KYF-Pt-NE — зависит от pH, и он может быть отложено в кровообращения и ускорился после nanoemulsions перемещают в опухоль.
Биологическая активность KYF-Pt-NE был создан в пробирке, используя же линии клетки рака яичников как изображений исследования. Клетки инкубировали с KYF-Pt-NE за 72 ч, при концентрации KYF-Pt-NE, соответствующие IC50 для каждой ячейки строки. Жизнеспособность была оценена с помощью анализа МТТ, и результаты были по сравнению с клетки только, KYF-NE, олеиновая acids-Pt(II) конъюгата, карбоплатин, цисплатин. Результаты биологической активности KYF-Pt-NE показаны на рисунке 4В. KYF-Pt-NE сократить жизнеспособность isogenic клеточных линий A2780 (Pt чувствительных) и CP70 (Pt устойчив), 44,3% 46,2% соответственно. Карбоплатин, клинически значимых аналог, снижение жизнеспособности на 18,5% (A2780) и 9,6% (CP70) только. Та же тенденция большего эффекта KYF-Pt-NE на гибель клеток наблюдалось через другие клеточные линии также. Жизнеспособность клеток чувствительных ООО - 21G Pt(II) был сокращен на 55,9% после инкубации с KYF-Pt-NE, в то время как карбоплатин привело к снижению жизнеспособности всего 16,5%. В клетках OV-90 с промежуточным Pt(II) сопротивления жизнеспособность был снижен 55,3% (KYF-Pt-NE) и 23,9% (карбоплатин). Две линии клеток рака устойчив, ES-2 и SKOV-3, показал снижение жизнеспособности на 45,9% и 54,3%, соответственно, для KYF-Pt-NE и 10.3% (ES-2) и 16,8% (SKOV-3) для карбоплатин.
Было также сравнение биологической активности KYF-Pt-NE против цисплатин. Цисплатин является агентом Pt II на основе первого поколения, которая больше не благоприятствования в клинику из-за своей токсичности профиля51. В двух клеточных линий, SKOV-3 и ООО - 21G, снижение жизнеспособности было больше 15% и 40%, соответственно, для KYF-Pt-NE чем для цисплатина. В остальных клеточных линий деятельность KYF-Pt-NE был сопоставим с цисплатином (A2780, CP70, OV-90), или немного ниже (ES-2). Также установлено, что конъюгата олеиновая acids-Pt(II) быть биологически активным. Однако KYF-Pt-NE показал выше снижение жизнеспособности чем конъюгат в большинстве линий клеток испытания, указав значение nanoformulation в Pt(II) деятельности.
Биологических приложений nanoparticulate систем требуют стабильности в биологически важные средства массовой информации, таким образом стабильность KYF-Pt-NE оценивалась в 20% плода бычьим сывороточным (ФБС) и результаты представлены в рисунке 4 c. Мы обнаружили никаких свидетельств opsonization KYF-Pt-NE в сыворотке после одного дня инкубации.
Рисунок 1. Компоненты nanoemulsions (вверху) и схема nanoemulsion подготовки (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. ТЕА образ KYF-Pt-NE (A) и Конфокальный микроскоп изображений FITC-KYF-Pt-NE (зеленый) поглощения клетками рака яичников (ядра являются синий и лизосом красный) (B). Масштаб гистограммы являются 10 мкм. Эта цифра была адаптирована с разрешения от Химии биоконъюгатов 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Стабильность KYF-Pt-NE и FITC-KYF-Pt-NE в воде. Каждая точка представляет среднее и стандартное отклонение N = 3 и p <0,005. Эта цифра была адаптирована с разрешения от Химии биоконъюгатов 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. KYF-Pt-NE стабильность и биологическая активность. (A) Pt(II) освобождение от KYF-Pt-NE в буфере PBS на разных pHs (PBS, 37 ° C). Клеточной жизнеспособности различных яичников рак клеточных линий после 72 ч инкубации с KYF-Pt-NE (B). Каждый столбец представляет среднее значение и стандартное отклонение N = 3 и p <0,005. Концентрации являются постоянными в каждой ячейке строки и заключаются в следующем: 4.92 мм (A2780), 8.80 (CP70), 2.46 мм (ООО - 21G), 9,84 (SKOV3), 7.38 мм (ES-2), 19,7 мм (OV-90). Концентрация KYF-Pt-NE и олеиновая acids–Pt(II) конъюгата была скорректирована в отношении содержания Pt(II), измеряется ААС. Сокращения: «Carbpt» – карбоплатин; «KYF-NE» – трипептид покрытием nanoemulsion KYF; «KYF-Pt-NE» – трипептид покрытием nanoemulsion KYF, содержащих Pt(II); Cispt – цисплатин; PT олеиновая-олеиновая acids–Pt(II) конъюгата. (C) KYF-Pt-NE стабильность в сыворотке. Эта цифра была адаптирована с разрешения от Химии биоконъюгатов 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги в синтезе nanoemulsion включают корректировки молярное соотношение субстратов, контроль температуры и потока скорость во время добавления олеиновая acids–Pt(II), предоставляя достаточное время для самостоятельной сборки и очистки продукта с помощью Центробежный концентратор столбец. Эти параметры влияют на размер и морфология KYF-Pt-NE; Таким образом это особенно важно для поддержания надлежащего молярное соотношение и правильно настроить синтетических условий.
Отношение подложек во время синтеза nanoemulsion (шаг 3) имеет решающее значение для самостоятельной сборки процесса и определяет окончательный размер продукта. KYF олеиновая acid-Pt(II) молярное соотношение составляет 1:3, и оптимальная концентрация KYF tripepide в воде составляет 0,2 мм. Кроме того органический растворитель для распустить конъюгата олеиновая acid-Pt(II) шаге 3.1 должна быть смешивается с водой, совместимый с системой фильтрации и испарений легко при комнатной температуре.
Одним из важных шагов является прикапывают добавлением олеиновой acid-Pt(II) конъюгата KYF решение (шаг 3.4). Поток должен не быть медленнее, чем 0,1 мл/мин и не быстрее чем 0,2 мл/мин, потому что оптимальными скорость может вызвать осадков nanoemulsion. Кроме того сопряженное олеиновая acids–Pt(II) следует добавить в решение KYF при 37 ° C во время перемешивания смеси на плите переполох в 600 об/мин. После того, как все олеиновая acid-Pt(II) был добавлен, решение должно храниться при комнатной температуре и перемешивания скорость снижена до 150 об/мин. Шаг 3.5 должно проводиться при комнатной температуре. Оптимальное время для самостоятельной сборки из KYF-Pt-NE (шаг 3.5) – 24 часа.
Существует опасность того, что продукт может выпадать в осадок в то время как nanoemulsion предварительно сконцентрировано. Поэтому рекомендуется, что nanoemulsion быть разбавленным с дополнительной воды перед центрифугируют в центробежных концентратор и вращаться не быстрее, чем 2465 x g. Разбавленных nanoemulsions следует добавить центробежные концентратор на аликвоты между спинами и nanoemulsion должны быть смешаны в фильтр перед добавлением следующей части.
Способность nanoemulsions формы с производных жирных кислот кроме олеиновой кислоты не тестировалась и еще предстоит определить. Будущих приложений могут включать использование различных пептидов для облегчения совместного Ассамблея с олеиновой кислоты. Кроме того олеиновая кислота конъюгаты с препаратами на основе номера платины может использоваться как потенциальные ядра nanoemulsions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликт интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы с благодарностью признаем финансовой поддержке Национального института рака, Грант SC2CA206194. Объявляются не конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
| A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
| Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
| High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
| Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
| LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
| N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
| PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
| Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
| Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
| Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
| Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
| Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
| Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
| Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
| Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
| Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
| Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
| VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |
References
- Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
- Anselmo, A. C., Mitragotri, S.
- Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
- Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
- Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
- Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
- Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
- Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
- Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
- Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
- Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
- Kumar, V. A., et al.
- Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
- Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
- Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
- McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
- Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
- Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
- Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
- Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
- Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
- Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
- Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
- Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
- Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
- Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
- Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
- Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
- Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
- Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
- Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
- Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
- Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
- Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G.
- Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
- Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
- Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
- Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V.
- Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
- Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
- Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
- Galluzzi, L., et al.
- Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
- Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
- Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
- Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
- Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
- Canton, I., Battaglia, G.
- Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).
