Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.
Abstract
המחקר של קינאז-המצע יחסים חיונית כדי להשיג הבנה מלאה של הפונקציות של אנזימים אלה ומטרות במורד הזרם שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. CK2 הוא קינאז סרין אבולוציונית שנשמרת/תראונין עם הרשימה המתארכת של מאות סובסטרטים מעורבים תהליכים תאיים מרובים. בשל תכונותיו pleiotropic, זיהוי ואפיון ערכה מקיפה של סובסטרטים CK2 כבר מאתגר במיוחד, נשאר משוכה במחקר של אנזים חשוב זה. כדי לטפל באתגר זה, אנו פיתחו אסטרטגיה ניסיוני רב תכליתי המאפשר את העשרה יישוב וזיהוי של בשם דיאלקטריים CK2. פרוטוקול זה מנצל יחודיות ייחודי מצע משותף כפול של CK2 ומאפשר thiophosphorylation ספציפיים של סובסטרטים שלו בתא או רקמות lysate. חלבונים אלו המצע לאחר מכן alkylated, immunoprecipitated, ו המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). השתמשנו בעבר גישה זו בהצלחה לזהות CK2 סובסטרטים מן השחלות דרוזופילה ולהרחיב כאן אנחנו היישום של פרוטוקול זה לתאים אנושיים גליובלסטומה, הממחישות את יכולת ההתאמה של שיטה זו לחקור התפקיד הביולוגי של קינאז דגם אורגניזמים שונים, מערכות ניסויות.
Introduction
חלבונים kinases הם רכיבי מפתח של האות התמרה חושית cascades. זרחון של חלבונים המצע על ידי אנזימים אלה מעורר תגובות ביולוגיות להסדיר אירועים קריטיים שליטה חלוקת התא, חילוף החומרים, בידול, בין היתר. CK2 הוא קינאז ביטוי ubiquitously, acidophilic סרין/טראונין זה חוק של שמרים לבני אדם, זה ממלא תפקידים חשובים רבים תהליכים תאיים ועד תקנה תעתיק מחזור התא התקדמות אפופטוזיס1 ,2,3. האנזים הוא heterotetramer המורכב שני α קטליטי (או α') subunits וβ רגולטוריות שני subunits4. בנוסף להיותו מאוד pleiotropic, CK2 מוצגים שני יוצא דופן מאפיינים אחרים זה לסבך את הניתוח שלה, כלומר פעילות מכוננת5 ו- ירידה לפרטים מצע משותף כפול6. המאפיין האחרון הזה מעניק CK2 עם היכולת להשתמש GTP, כמו גם ATP עבור זרחון של חלבונים המצע.
מחיקת גנטי subunits קטליטי או תקניות של CK2 בעכברים גורמת lethality עובריים המציין כי זה משחק תפקיד מכריע במהלך פיתוח ו-7,organogenesis8. CK2 הוא overexpressed גם כמה סוגים של סרטן ומייצגת ובכך מבטיח מטרה טיפולית9,10,11. אכן, ספציפית מעכבי פעילות קינאז CK2 את היעד הם כעת תחת חקירה זו מטרה12,13,14. בעוד עיכוב של CK2 היא אפשרות מעשית, בהתחשב באופי pleiotropic שלה, חלופה אולי גישה יותר הגיוני יהיה היעד קריטית סובסטרטים CK2 העומדים בבסיס את התקדמות סרטן מסוימים. לכן, מקיף זיהוי ואפיון של חלבונים המצע CK2 יהיה של יתרון משמעותי עבור שחקרתי את function(s) ספציפיים של קינאז בתוך סוג הרקמה או גידול מסוים.
כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית רב-תכליתי לזיהוי CK2 סובסטרטים מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תאים או רקמות lysate. פרוטוקול זה מנצל יחודיות כפול מצע משותף של CK2 על-ידי שימוש אנלוגי GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) guanosine שלא kinases אנדוגני אחרים יכולים להשתמש. דבר זה מאפשר ביעילות את קינאז "לסמן" שלה מצעים בתוך את הדוגמית הזו. עבור הבאים בידוד וזיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ודא כי החומרים הדרושים הם זמינים הוכנו כראוי (ראה טבלה של חומרים).
1. הכנה
- מכנית lyse דגימת הרקמות (1-2 מ ג של רקמות µL 100 פירוק מאגר, טבלה 1) או תרבותי תאים (10 ס מ זה 80-90% confluent ב µL 350 מאגר פירוק), לוחית עם המטרה היא לאסוף סכום של 900 µL מדגם לניסוי. שימו לב כי נפח זה עודף קל של מה נדרש בשביל הניסוי המתואר להלן.
- ספין למטה הדוגמאות על ידי צנטריפוגה ב 17,500 x g במשך 3 דקות ב 4 º C. בגמר, העברה µL 270 של תגובת שיקוע כל אחד שלושה צינורות microcentrifuge החדש של 1.7 mL. יהיו כ 90 µL שנותרו. הסר µL 40 כדי לשמש של "בקרת קלט" ומקום צינור חדש. במקום כל דוגמאות על קרח.
2. קינאז assay: thiophosphorylation, אלקילציה
- תווית שלושה צינורות המכיל 270 µL כדלקמן: "rxn קינאז", "GTPγS בלבד", ו "PNBM (p-nitrobezyl מסילייט) בלבד". הכינו את התגובות קינאז.
- אל הרכבת התחתית "קינאז rxn", להוסיף µL 2.7 (שקול ל- 1,350 U) של CK2 ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS.
- אל הרכבת התחתית "GTPγS בלבד", להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS, ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 פירוק המאגר.
- כדי הרכבת התחתית "PNBM בלבד", להוסיף µL 5.4 פירוק המאגר. קפיצי לכל הצינורות כדי לערבב ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.
- דגירה כל שלושה צינורות עבור 1 דקות באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס. בעקבות דגירה, להוסיף µL 13.5 של 12 מ"ג/מ"ל PNBM כל שלושה צינורות. ' היפוך ' כדי לערבב דגימות. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לאחר תחילת הדגירה בשלב 2.2, להכין את העמודות desalting ברגע ככל האפשר התהליך נמשך כ- 45 דקות.
3. הכנת desalting עמודות
- בתחילה הכן עמודות (3 לניסוי הזה למשל) על ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי מחדש להשעות G-25 ספדקס שרף במאגר של אחסון. לאפשר שרף להתיישב על ידי הצמדת כל עמודה עמדה קלאמפ ולתת לזה לשבת ללא הפרעה במשך כ 5 דקות.
- בעקבות שיקוע של שרף ספדקס G-25, להסיר את הפקקים הן העליון והתחתון של העמודה כדי לאפשר מאגר אחסון ניקוז על ידי כוח המשיכה, יש לו צינור הממוקמת מתחת הפתח התחתון כדי לאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול.
- לאחר אחסון מאגר תיגמר, להוסיף כ- 2.7 mL פירוק המאגר כדי equilibrate את העמודות. לאסוף את הזרימה דרך וזורקים. חזור על 3 פעמים. בעקבות equilibration הסופית, העמודות מוכנים עבור שלב 4.1.
4. הסרת PNBM
- לאחר דגירה 1 h (שלב 2.2) והכנת עמודה (שלב 3) הושלמו, להחיל את הדגימות לעמודות. תווית כל עמודה כדלקמן: "קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM בלבד". לטעון את כל כל דגימה על גבי שלה העמודות בהתאמה. אוספים וזורקים את הזרימה דרך.
- רחץ דוגמאות על-ידי הוספת µL 420 פירוק מאגר כל עמודה. לאפשר פירוק המאגר לסנן באמצעות המדור ולאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול. בעקבות צעד זה לשטוף, למקם את צינורות במיקום עבור אוסף של דוגמאות.
- Elute דוגמאות על-ידי הוספת µL 500 פירוק מאגר כל עמודה. לאסוף את הזרימה דרך המכיל עכשיו thiophosphorylated ותערובות CK2 alkylated.
5. Immunoprecipitation: חלק א'
- להכין דגימות immunoprecipitation על ידי הראשון µL 80 הסרת עבור דוגמה "• תנאי קלט שליטה" מכל אחת elutions בהתאמה ("קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM רק") שנאספו בשלב 4.3. בעקבות הסרת µL 80 מ כל דגימה, יהיו כ 420 µL הנותרים עבור דגימה.
- לפצל כל מדגם 2 צינורות המכיל 200 µL. תווית כל שפופרת בהתאמה: "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר", "rxn קינאז IgG", "GTPγS אנטי-thiophosphate אסתר", "GTPγS אג", "PNBM אנטי-thiophosphate אסתר" ו- 'PNBM אג'.
- הוסף µg 2.8 של נוגדן anti-thiophosphate אסתר לכל אחד הצינורות התווית על-ידי אסתר anti-thiophosphate ואת µg 2.8 של נוגדן שליטה isotype לכל אחד הצינורות התווית על-ידי IgG. במקום צינורות על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- להתחיל הכנה של חלבון A/G חרוז במהלך 15 דקות האחרונות של הדגירה 2 h בשלב 5.2.
6. חלבון A/G agarose חרוז הכנה
- בקצרה מערבולת הצינור אחסון כדי להבטיח חרוזים הם לגמרי מחדש על תנאי. לחתוך את סוף P200 עצה פיפטה בעזרת סכין גילוח נקי כדי להגדיל את מד גודל. Pipet 100 µL של slurry חרוז לכל immunoprecipitation לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ ל. עבור דוגמה זו, סכום כולל של 6 צינורות נחוצים.
- Centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. מחדש להשעות את החרוזים ב 200 µL של פירוק מאגר, בקצרה מערבולת. חזור על הספין ולשטוף שלבים 3 פעמים.
- בעקבות בכביסה הסופי, במקום את החרוזים על הקרח עד הדגירה בשלב 5.2 תושלם.
7. Immunoprecipitation: חלק ב'
- לאחר 2 h הדגירה מהשלב 5.2, ספין למטה הדגימות ב x 17,500 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. בעקבות צנטריפוגה להוסיף 200 µL מהדגימה כל הצינורות עם החרוזים שטף. במקום הצינורות על מסובב ב 4 ° C עבור 1 h.
- בעקבות הדגירה 1 h, centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הבא להסיר כל מדגם µL 40 של תגובת שיקוע ולשמור ככל "פקד דלדול" (סה כ 6 צינורות). הסר את השארית של תגובת שיקוע, להשליך. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים.
- לשטוף את הדוגמאות על-ידי הוספת µL 200 של פירוק מאגר, vortexing בקצרה. צנטריפוגה ואז ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על לשטוף את ולסובב שלבים 3 פעמים. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים במהלך שלבים אלה.
- לאחר השלמת השלבים לשטוף, להוסיף 50 µL 2 x מדגם מאגר כל מדגם המכילה חרוזים. כל דוגמאות אחרות, הוסיפו µL 8 של 6 x מאגר מדגם: "בקרת קלט", "בקרות קלט • תנאי" ופקדים "מחסור".
- ברגע מאגר נוסף הצינורות, pipet למעלה ולמטה כדי לערבב, מחממים כל דוגמאות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני שתמשיך עם עמודים מרחביות.
8. ניתוח/אימות של תוצאות
- אמת thiophosphorylation תלויי-CK2 מוצלחת, אלקילציה.
- כדי לקבוע את היעילות של thiophosphorylation בתיווך CK2 בשלב 2.2, מבצעים מרחביות-דף סופג המערבי על-ידי הפעלת µL 15-20 של "• תנאי קלט הפקדים" אסף בשלב 5.1 על ג'ל לזיהוי 12.5%.
- בדיקה ממברנות עם נוגדנים הבאים: אנטי-thiophosphate אסתר, anti-CK2α, ו- anti-GAPDH (או פקד הטעינה מתאים אחר). אם שלב זה היה מוצלח, אות אסתר נגד משופרת-thiophosphate צריך להיות לכאורה במסלול "rxn קינאז" לעומת אחרים שני המסלולים (איור 2).
- דמיינו דיאלקטריים בשם מועשר של CK2 ולקבוע זהות החלבון.
- כדי להעריך אם המדרגות immunoprecipitation היו מוצלחות, הפעל 25-30 µL של הדגימות eluted של החרוזים בשלב 7.4 על ג'ל לזיהוי נפרד 12.5%. ודא כי כל הציוד הוא נקי, לבשו כפפות בכל עת במהלך שלב זה כדי למזער את הזיהום.
- מכתים את הג'ל עם Coomassie כחול להמחיש מהחלבונים מועשר בשלבים שונים של פרוטוקול נסיוני (איור 3). משתמש חדש razorblades, בזהירות להקות ייחודי בלו מציגים בנתיב "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר IP", וציין משקולות מולקולרית המשוער שלהם.
- להגיש את הלהקות האלה לזיהוי חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) (איור 4). אם נוגדנים נגד החלבונים מזוהה זמינים, לאשר את התוצאות של ספקטרומטר מסה מאת מרחביות-דף immunoblotting של קלט, דלה, שברים IP שנאספו במהלך הקורס של הפרוטוקול (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים כללי של ההליך ניסיוני מסופק באיור1. הבסיס כבסיס של הטכניקה היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP להעברת קבוצה phosphoryl. תוספת של holoenzyme CK2 אקסוגני יחד עם GTP אנלוגי, GTPγS, אל תא lysate גורמת thiophosphorylation של סובסטרטים CK2 אנדוגני. הטיפול הבאים של lysate עם החומר מגיב p- nitrobenzyl מסילייט (PNBM) יוצר moiety אסתר thiophosphate על חלבונים אלה סובסטרט מסוים כי אז ניתן immunoprecipitated באמצעות נוגדן anti-thiophosphate אסתר בסופו של דבר שזוהה על-ידי ספקטרומטר מסה. איור 2 מציג תוצאה חיובית בעקבות התוספת של CK2 ו GTPγS ולאחר מכן PNBM T98G (glioblastoma) תא lysate. תוצאות אלו מדגימים כי CK2 תלוית thiophosphorylation אלקילציה העוקבים היו מוצלחים. כצפוי, אות אסתר נגד משופרת-thiophosphate על-ידי סופג המערבי נצפית רק בנתיב המכיל את התגובה קינאז מלאה, ולא את GTPγS בלבד - ודוגמאות PNBM רק שטופלו. בתרשים 3 הוא ג'ל מוכתם כחול Coomassie של immunoprecipitated ו- eluted חלבונים באמצעות פקד isotype IgG או נוגדנים anti-thiophosphate אסתר ב נוכחות או היעדרות של עודף CK2 ו/או GTPγS. נתונים אלה גם להוכיח תוצאה חיובית כמו להקות ייחודי מרובים ניכרות רק בנתיב אנטי-thiophosphate אסתר IP בו lysate, נדגרה עם אקסוגני CK2 ו GTPγS. הלהקה המצוינת בכוכבית טוחנות של הג'ל, נאספו עבור זיהוי חלבונים ספקטרומטר מסה. איור 4 מדגימה נציג נתונים שהושגו על ידי המוני spectrometric ניתוח כולל זיהוי חלבונים, אחוז כיסוי ומספר של פפטידים ייחודי המזוהה לכל חלבון בתוך הלהקה. מוצגות עשרת הלהיטים מהלהקה הועלה (איור 3) ומידע בנוגע אם החלבון בעבר זוהתה כמו מצע CK215,16,17. זהותו של אחד מצעים immunoprecipitated ידוע CK2, nucleolin15, אושר על ידי מרחביות-דף immunoblotting של שברים המצוין באמצעות נוגדן anti-nucleolin.
איור 1: תרשים סכמטי של האסטרטגיה ניסיוני. תחליף GTP, GTPוγS, יחד עם עודף רקומביננטי CK2 holoenzyme מתווסף תא או רקמות lysate ומאפשר thiophosphorylation של סובסטרטים מאת CK2. אבל לא על ידי אחרים kinases אנדוגני. Thiophosphorylated מצעים הינם alkylated הבא עם PNBM, יצירת moiety אסתר thiophosphate על אלה חלבונים, אשר לאחר מכן נלכדים באמצעות immunoprecipitation (IP) עבור זיהוי עוקבות מאת (ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית LC-MS/MS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אימות של thiophosphorylation תלויי-CK2 בתא כל lysate. Lysates התא כולו מוכן מתאי T98G היו מודגרות עם GTPוγS נוכחות (קינאז התגובה) או היעדר אקסוגני holoenzyme CK2 רקומביננטי (GTPוγS בלבד). PNBM לאחר מכן נוספה לתגובות המצוין, דגימות שנפתרו על ידי מרחביות-דף ואחריו immunoblotting עם נוגדנים המצוין. סמני חלבונים משקל מולקולרי נקובים ב- kDa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Immunoprecipitation של חלבונים בשם של המצע CK2. העשרה והדמיה של סובסטרטים CK2 בשם (נתיב שלישי) מתבטא כרצועות ייחודי מרובים, בעקבות immunoprecipitation עם נוגדנים anti-thiophosphate אסתר. Immunoprecipitates שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, הג'ל היה מוכתם כחול Coomassie. הלהקה המסומנים בכוכבית טוחנות של הג'ל, נאספו עבור זיהוי חלבונים ספקטרומטר מסה. סמני חלבונים משקל מולקולרי נקובים ב- kDa. IP = immunoprecipitation. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: זיהוי ואישור חלבונים בשם דיאלקטריים של CK2 במבחנה. נתונים שהושגו באמצעות ספקטרומטר מסה מדגים כי הן בעבר מוכרים15,16,17 , כמו גם בשם דיאלקטריים CK2 הרומן זוהו באופן ניסיוני זה. מוצגות העליון 10 חלבונים מזוהה מהלהקה נכרת (למעלה). זהותו של nucleolin, מצע CK2 ידוע, אושר ע י immunoblotting של שברים המצוין באמצעות נוגדן anti-nucleolin (למטה). סמני חלבונים משקל מולקולרי נקובים ב- kDa. IP = immunoprecipitation. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ריכוז מניות ריאגנט | הריכוז הסופי של ריאגנט | דוגמה אמצעי אחסון נוסף המבוסס על ריכוזי מניות |
| 1 מ' טריס pH 7.4 | 20.0 מ מ | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20.0 מ מ | 50 ΜL |
| 20% טריטון X-100 | 0.50% | 250 ΜL |
| MgCl 1 מ'2 | 10.0 מ מ | 100 ΜL |
| DTT 1 מ' | 0.5 מ מ | 5 ΜL |
| 200 מ מ נה3VO4 | 1.0 מ מ | 50 ΜL |
| 500 מ מ NaF | 10.0 מ מ | 200 ΜL |
| פוספט β-גליצרול 500 מ מ | 10.0 מ מ | 200 ΜL |
| H2O | מ ל 8.945 | |
| + 1 להשלים מיני כרטיסיה/10 מ"ל | 1 טבליה |
טבלה 1. פירוק מאגר מתכון (10 מ"ל, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה הביוכימי פשוט יחסית לזיהוי סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיות מורכבות. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מבוססים על מאפייני אנזימטי יוצא דופן CK2 וכוללים CK2 תלוית thiophosphorylation של חלבונים ספציפיים המצע באמצעות GTPוγS ו immunoprecipitation הבאים וזיהוי שלהם. עם התוצאות האלה, הראו את השירות ואת צדדיות של גישה זו כפי שאנחנו עכשיו יישמו אסטרטגיה זו תאים אנושיים גליובלסטומה והן דרוזופילה השחלות18.
מספר מחקרים שפורסמו בעבר שימוש בגישות phosphoproteomics כמותיים אכן הוכיחו מוצלח בזיהוי הרומן CK2 סובסטרטים19,20,21,22, 23. עם זאת, חלק הללו להפוך אסטרטגיות משתמשים של המצע קיבוע מערכים, ואפשרי כי קונפורמציה החלבון קיבוע עלול להפוך אתר זרחון פוטנציאליים נגיש קינאז. בטכניקה המתוארת כאן מאפשר זירחון בתוך סביבה יותר פיזיולוגית או מקורי (קרי, תא lysate), ובכך להקטין את ההסתברות של אתר הנגישות. יתרון נוסף של אסטרטגיה זו היא כי ברגע זיהוי חלבונים נקבעת על-ידי ספקטרומטר מסה, אימות של סובסטרטים CK2 בשם ניתן בקלות לבצע הדגימות שנאספו במהלך ההליך, אם נוגדנים נגד המצע protein(s) עניין זמינים. לדוגמה, באמצעות סופג המערבי הסטנדרטי, אחד צריכה להשגיח על הפחתת רמת החלבון הרלוונטיים הדגימות מדולדל (post-IP) את נוכחותה immunoprecipitates אסתר נגד-thiophosphate כפי הראו עבור CK2 ידוע המצע nucleolin (איור 4).
מגבלה הבולט של שיטה זו הוא כי השלב הסופי של התהליך לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה מסתמך על היכולת להבחין דיסקרטית הבדלים פסי צבע דפוס על ג'ל. לכן, זה בהחלט אפשרי סובסטרטים CK2 ספציפיים עשויים לפספס אם הם השפע נמוך ולכן מתחת לגבול של זיהוי חזותי. אם אחד הוא מודאג לגבי האפשרות הזו, שיטה יותר רגישים כגון צביעת כסף ניתן להמחיש חלבונים אלה במקום להשתמש Coomassie כחול. שיקול נוסף כי יש להכיר היא כי מספר של סובסטרטים CK2 לא ניתן לזהות באמצעות אסטרטגיה זו, שכן האתרים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כבר נמצא phosphorylated ויוו. . זה קרוב לוודאי כדי להיות מקרה בהתחשב הפעילות המכונן של CK2. לבסוף, יש גם לציין כי מתודולוגיה זו מזהה רק חלבונים בשם דיאלקטריים בשם של CK2 במבחנה. מבחני הבאים כדי לאמת כי אלה סובסטרטים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של CK2 ויוו נדרשים ולרוב צריך זיהוי של אתרי זירחון CK2 תלוית והערכה אם זרחון שאריות אלו מסוים שינו בתגובה מניפולציה של פעילות קינאז CK2.
לסיכום, אסטרטגיה זו בשילוב עם הזרם גישות ניסיוניות (מיפוי אתר זרחון על ידי ניתוח חיתוך/מחיקה, מוטגנזה, מבחני חוץ גופית בתוך ו ויוו פונקציונלי, וכו ') יקל על המחקר של קינאז יוצא דופן יגדל הבנתנו התפקידים השונים שמנגן CK2 במערכות ביולוגיות מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק שיפור המחקר אוניברסלי קהיליה מחלקת פנסילבניה הבריאות T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
