Summary
L'obiettivo del presente protocollo è di etichettare, arricchire e identificare i substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso come un lysate delle cellule o del tessuto omogeneizzato. Questo metodo sfrutta gli aspetti unici di CK2 biologia per questo scopo.
Abstract
Lo studio delle relazioni di chinasi-substrato è essenziale per ottenere una comprensione completa delle funzioni di questi enzimi e ai loro obiettivi a valle negli Stati sia fisiologici che patologici. CK2 è un'evolutivamente conservati serina/treonina chinasi con un crescente elenco di centinaia di substrati coinvolti in molteplici processi cellulari. Grazie alle sue proprietà pleiotropici, identificare e caratterizzare una serie completa di CK2 substrati è stato particolarmente impegnativo e rimane un ostacolo nello studio di questo importante enzima. Per affrontare questa sfida, abbiamo messo a punto una strategia sperimentale versatile che consente l'arricchimento mirato e l'identificazione di presunti CK2 substrati. Questo protocollo si avvale della specificità unica dual co-substrato di CK2 permettendo per specifici thiophosphorylation dei suoi substrati in una cellula o tessuto lisato. Queste proteine del substrato sono successivamente alchilati, immunoprecipitated e identificati mediante spettrometria di massa tandem/cromatografia liquida (LC-MS/MS). In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per identificare con successo CK2 substrati dalle ovaie di Drosophila e qui abbiamo estendere l'applicazione del presente protocollo alle cellule di glioblastoma umano, illustrando l'adattabilità di questo metodo per indagare il ruoli biologici di questa chinasi in vari organismi modello e sistemi sperimentali.
Introduction
Chinasi di proteina sono componenti chiave delle cascate di trasduzione del segnale. La fosforilazione delle proteine substrato da questi enzimi suscita risposte biologiche che regolano gli eventi critici, controllo della divisione cellulare, il metabolismo e differenziazione, tra gli altri. CK2 è un'espressa ubiquitariamente, acidofilico serina/treonina chinasi che è conservata dal lievito all'uomo e che svolge i ruoli importanti in molti processi cellulari che vanno dalla regolazione trascrizionale di progressione del ciclo cellulare per apoptosi1 ,2,3. L'enzima è un heterotetramer composto da due α catalitico (o α') subunità e due di subunità β regolamentazione4. Oltre ad essere altamente pleiotropico, CK2 esibisce due altre caratteristiche insolite che complicano la sua analisi, vale a dire attività costitutiva5 e dual co-substrato specificità6. Quest'ultima proprietà dota CK2 con la possibilità di utilizzare GTP nonché ATP per fosforilazione delle proteine substrato.
Delezione genica delle subunità catalitica o regolamentazione di CK2 in topi provoca mortalità embrionale che indica che esso gioca un ruolo cruciale durante lo sviluppo e l'organogenesi7,8. CK2 anche overexpressed in diversi tipi di cancro e quindi rappresenta un promettente bersaglio terapeutico9,10,11. Infatti, inibitori specifici che attività di chinasi CK2 destinazione sono attualmente sotto inchiesta per questo scopo12,13,14. Mentre l'inibizione di CK2 è una valida opzione, data la sua natura pleiotropica, un'alternativa e forse più razionale approccio sarebbe target critici substrati CK2 che sottendono la progressione di alcuni tumori. Pertanto, la completa identificazione e caratterizzazione di proteine substrato CK2 sarebbe di beneficio significativo per delucidare le funzioni specifiche di questa chinasi all'interno di un particolare tipo di tessuto o del tumore.
Qui, descriviamo un metodo versatile biochimico per l'identificazione dei substrati di CK2 da un campione biologico complesso come una cellula o tessuto lisato. Questo protocollo sfrutta la specificità di co-substrato dual di CK2 dall'uso dell'analogo GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) che non è possibile utilizzare altre chinasi endogene. Questo permette efficacemente la chinasi ad "etichettare" suoi substrati all'interno di questo campione per identificazione e isolamento successivo.
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Protocol
Nota: Assicurarsi che i materiali necessari sono disponibili e adeguatamente preparati (Vedi Tabella materiali).
1. preparazione
- Meccanicamente lisare il campione di tessuto (1-2 mg di tessuto in 100 µ l di tampone di Lisi, tabella 1) o cellule (piastra di 10 cm che è 80-90% confluenti in 350 µ l di tampone di lisi), coltivate con l'obiettivo di raccogliere un totale di 900 µ l di campione per l'esperimento. Si noti che questo volume è in leggero eccesso di ciò che è richiesto per l'esperimento descritto di seguito.
- Rotazione verso il basso i campioni mediante centrifugazione a 17.500 x g per 3 minuti a 4 ° C. Al termine, è possibile trasferire 270 µ l del surnatante in ciascuna delle tre nuove microcentrifuga 1,7 mL. Ci saranno circa 90 µ l restanti. Rimuovere 40 µ l per essere utilizzato come un "controllo di input" e posto in un nuovo tubo. Mettere tutti i campioni sul ghiaccio.
2. analisi della chinasi di: thiophosphorylation e alchilazione
- Etichettare le tre provette contenenti 270 µ l ciascuna come segue: "chinasi rxn", "Solo GTPγS", e "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) solo". Preparare le reazioni di chinasi.
- Per il tubo "rxn chinasi", aggiungere 2,7 µ l (equivalente a 1.350 U) di CK2, quindi aggiungere 2,7 µ l di 2,5 mM GTPγS.
- Per il tubo "Solo GTPγS", aggiungere 2,7 µ l di 2,5 mM GTPγS e quindi aggiungere 2,7 µ l di tampone di lisi.
- Per il tubo "Solo PNBM", aggiungere 5,4 µ l di tampone di lisi. Scorri tutte le provette per mescolare e quindi collocare immediatamente sul ghiaccio.
- Incubare tutte le tre provette per 1 min in un bagno di acqua 30 ° C. A seguito di incubazione, è necessario aggiungere 13,5 µ l di 12 mg/mL PNBM a tutte le tre provette. Inverti per miscelare i campioni. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 1 h.
- Dopo aver avviato l'incubazione nel passaggio 2.2, preparare le colonne dissalazione più presto possibile, come il processo richiede circa 45 minuti.
3. preparazione di colonne di desalificazione
- Inizialmente preparare colonne (3 per questo esperimento di esempio) invertendo ogni colonna più volte per risospendere il Sephadex G-25 resina nel buffer di archiviazione. Lasciare che la resina a stabilirsi attaccando ogni colonna a un morsetto e lasciarlo riposare per circa 5 min.
- Dopo assestamento della resina Sephadex G-25, togliere i tappi dalla parte superiore e la parte inferiore della colonna per permettere al tampone di deposito di scarico per gravità e hanno un tubo posto sotto l'apertura inferiore per raccogliere il flusso continuo per l'eliminazione.
- Una volta che il buffer di memoria è esaurita, è possibile aggiungere circa 2,7 mL di tampone di lisi per equilibrare le colonne. Raccogliere il flusso continuo e scartare. Ripetere 3 volte. In seguito l'equilibratura finale, le colonne sono pronte per passo 4.1.
4. rimozione del PNBM
- Dopo l'incubazione di 1 h (punto 2.2) e preparazione della colonna (passaggio 3) sono state completate, è possibile applicare i campioni per le colonne. Etichetta ogni colonna come segue: "rxn chinasi", "Solo GTPγS" e "Solo PNBM". Carica tutti di ogni campione sulla sua rispettiva colonna. Raccogliere e gettare il flusso continuo.
- Lavare campioni aggiungendo 420 µ l di tampone di lisi per ogni colonna. Consentire il tampone di lisi filtrare attraverso la colonna e raccogliere il flusso continuo per l'eliminazione. A seguito di questo passaggio di lavaggio, è necessario inserire le provette in posizione per prelievo di campioni.
- Eluire campioni aggiungendo 500 µ l di tampone di lisi per ogni colonna. Raccogliere il flusso continuo che ora contiene thiophosphorylated e alchilati substrati di CK2.
5. immunoprecipitazione: Parte I
- Preparare i campioni per immunoprecipitazione prima rimozione µ l 80 per un campione di "controllo di input di eluizione" da ciascuno dei rispettivi eluizioni ("rxn chinasi", "Solo GTPγS" e "Solo PNBM") raccolti al punto 4.3. A seguito di rimozione di 80 µ l di ogni campione, ci saranno circa 420 µ l restanti per campione.
- Dividere ogni campione in 2 provette contenenti 200 µ l. Etichettare ogni rispettiva provetta: "estere di anti-thiophosphate rxn chinasi", "chinasi rxn IgG", "Ester anti-tiofosfato GTPγS", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" e "PNBM IgG".
- Aggiungere 2,8 µ g di anticorpo estere anti-thiophosphate a ciascuno dei tubi anti-thiophosphate estere-etichettati e 2,8 µ g di isotipo dell'anticorpo di controllo per ciascuna delle provette IgG-etichettati. Inserire le provette in un rotatore a 4 ° C per 2 h.
- Iniziare la preparazione del branello di proteina A/G durante gli ultimi 15 minuti dell'incubazione 2 h al punto 5.2.
6. preparazione della perla dell'agarosi A/G di proteine
- Brevemente il vortice il tubo di storage per garantire perline sono completamente ri-sospensione. Tagliare l'estremità di un P200 puntale utilizzando una lama di rasoio pulita al fine di aumentare il calibro dimensione. Pipettare 100 µ l del liquame perlina per immunoprecipitazione in un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL. In questo esempio, sono necessari un totale di 6 tubi.
- Centrifugare le provette a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e scartare. Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di lisi e brevemente vortice. Ripetere lo spin e lavare passi 3 volte.
- Dopo il lavaggio finale, mettere le perline sul ghiaccio fino a quando l'incubazione nel passaggio 5.2 è completa.
7. immunoprecipitazione: Parte II
- Dopo l'incubazione di 2h dal punto 5.2, rallentare i campioni a 17.500 x g per 3 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione aggiungere 200 µ l di ogni campione per i tubi con le perline lavate. Posizionare i tubi sull'agitatore a 4 ° C per 1 h.
- Dopo l'incubazione di 1h, centrifugare le provette a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Successivamente rimuovere 40 µ l di supernatante da ogni campione e salvare come un "controllo di svuotamento" (totale 6 tubi). Rimuovere il resto del surnatante e scartare. Fare attenzione a non per disturbare le perline.
- Lavare i campioni con l'aggiunta di 200 µ l di tampone di lisi e Vortex brevemente. Poi Centrifugare a 17.500 x g per 1 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere il lavaggio e spin passi 3 volte. Fare attenzione a non per disturbare le perle durante questi passaggi.
- Dopo aver completato le fasi di lavaggio, aggiungere 50 µ l di tampone di campione x 2 per ogni campione contenente microsfere. Per tutti gli altri campioni, aggiungere 8 µ l di sample buffer 6x: "controllo di input", "controlli di input di eluizione" e "controlli di svuotamento".
- Una volta che viene aggiunta ai tubi, dispensare su e giù per mescolare e riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 5 minuti prima di procedere con SDS-PAGE.
8. analisi/validazione dei risultati
- Convalidare l'alchilazione e successo CK2-dipendente thiophosphorylation.
- Per determinare l'efficacia di thiophosphorylation CK2-mediata nel passaggio 2.2, eseguire SDS-PAGE e Western blotting eseguendo 15-20 µ l dei "eluizione controlli di input" raccolti nel passaggio 5.1 su un gel di poliacrilammide del 12,5%.
- Sonda di membrane con i seguenti anticorpi: anti-thiophosphate estere, anti-CK2α e anti-GAPDH (o un altro controllo caricamento appropriato). Se questo passaggio è stato completato, un segnale di ester avanzata anti-thiophosphate dovrebbe essere evidente nella corsia "chinasi rxn" rispetto alle altre due corsie (Figura 2).
- Visualizzare substrati arricchiti putativi di CK2 e determinare l'identità della proteina.
- Per valutare se i passaggi di immunoprecipitazione riuscivano, eseguire 25-30 µ l dei campioni eluiti dalle perline nel passaggio 7.4 su un gel di poliacrilammide 12,5% separato. Assicurarsi che tutte le attrezzature sono pulita e indossare guanti in qualsiasi momento durante questo passaggio per minimizzare la contaminazione.
- Il gel con Coomassie. macchia blu per visualizzare proteine arricchite dalle varie fasi del protocollo sperimentale (Figura 3). Utilizzando lamette nuove, asportare accuratamente unici bande presenti nella corsia "chinasi rxn anti-thiophosphate estere IP", notando la loro pesi molecolari approssimativi.
- Presentare queste bande per identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa tandem/cromatografia liquida (LC-MS/MS) (Figura 4). Se gli anticorpi diretti contro le proteine identificate sono disponibili, confermare i risultati della spettrometria di massa da SDS-PAGE e immunoblotting di input, impoverito e frazioni IP raccolti durante il corso del protocollo (Figura 4).
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Representative Results
Nella Figura 1viene fornito un diagramma schematico della procedura sperimentale. Alla base della tecnica è la capacità insolita di CK2 utilizzare GTP per trasferimento del gruppo fosforile. Aggiunta di esogeno CK2 holoenzyme insieme con l'analogo del GTP, GTPγS, per un lysate delle cellule provoca thiophosphorylation di substrati endogeni CK2. Il trattamento successivo del lisato con l'alchilanti reagente p- nitrobenzyl mesylate (PNBM) genera una molecola di estere tiofosfato su queste proteine substrato specifico che può essere quindi immunoprecipitati utilizzando un anticorpo di anti-thiophosphate estere e, infine, identificate mediante spettrometria di massa. Figura 2 descrive un risultato positivo dopo l'aggiunta di CK2 e GTPγS e poi PNBM a T98G lysate delle cellule (glioblastoma). Questi risultati dimostrano che CK2-dipendente thiophosphorylation e successiva alchilazione hanno avuto successo. Come previsto, un segnale di avanzata anti-thiophosphate estere mediante Western blotting è osservato solo nella corsia contenente la reazione completa della chinasi e non nei GTPγS unico - e PNBM solo-trattati nei campioni. Illustrato nella Figura 3 è un gel di tinto blu di Coomassie immunoprecipitato le proteine eluite mediante controllo isotipo IgG o gli anticorpi anti-thiophosphate estere in presenza o assenza di CK2 in eccesso e/o GTPγS. Questi dati dimostrano anche un risultato positivo come fasce uniche multiple sono evidenti solo in corsia di anti-thiophosphate estere IP in cui il lisato è stato incubato con esogeno CK2 e GTPγS. La band indicata con un asterisco è stata asportata dal gel e inserita per identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa. La figura 4 illustra dati rappresentativi ottenuti tramite analisi spettrometria di massa, inclusa l'identificazione della proteina, percentuale di copertura e numero di peptidi unici identificato per proteina all'interno della band. Vengono mostrati i successi di dieci dalla band inviato (Figura 3) e le informazioni per quanto riguarda se o non la proteina è stata identificata in precedenza come substrato di CK215,16,17. L'identità di uno dei substrati noti immunoprecipitati CK2, nucleolina15, è stata confermata da SDS-PAGE e immunoblotting delle frazioni indicate usando un anticorpo anti-nucleolina.
Figura 1: diagramma schematico della strategia sperimentale. L'analogo di GTP, GTPγS, insieme a ricombinante in eccesso CK2 holoenzyme viene aggiunto a una cella o il tessuto lisato e consente thiophosphorylation di substrati da CK2, ma non da altre chinasi endogene. Thiophosphorylated substrati successiva sono alchilati con PNBM, generando una molecola di estere tiofosfato su queste proteine, che vengono quindi acquisiti tramite immunoprecipitazione (IP) per la successiva identificazione per liquido cromatografia-spettrometria di massa ( LC-MS/MS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: convalida di CK2-dipendente thiophosphorylation in tutta la cella lysata. Lisati cellulari tutto preparati dalle cellule T98G sono state incubate con GTPγS in presenza (reazione della chinasi) o assenza (GTPγS solo) di esogena ricombinante CK2 holoenzyme. PNBM è stato aggiunto successivamente per le reazioni indicate, e i campioni sono stati risolti da SDS-PAGE seguita da immunoblotting con gli anticorpi indicati. Marcatori di peso molecolare della proteina sono indicati in kDa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immunoprecipitazione delle proteine di substrato putativi CK2. Arricchimento e la visualizzazione di putativi substrati CK2 (terza corsia) è evidente come più fasce uniche seguendo immunoprecipitazione con gli anticorpi anti-thiophosphate estere. Immunoprecipitates sono stati risolti da SDS-PAGE e il gel è stato macchiato con il blu di Coomassie. La band contrassegnata con l'asterisco è stata asportata dal gel e inserita per identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa. Marcatori di peso molecolare della proteina sono indicati in kDa. IP = immunoprecipitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione e conferma delle proteine come substrati di CK2 in vitro. I dati ottenuti mediante spettrometria di massa dimostrano che sia precedentemente noto15,16,17 , nonché nuovi CK2 putativi substrati sono stati identificati usando questo approccio sperimentale. Vengono mostrati la top dieci proteine identificate dalla band asportata (in alto). L'identità di nucleolina, un substrato di CK2 noto, è stata confermata dall'immunoblotting delle frazioni indicate usando un anticorpo anti-nucleolina (in basso). Marcatori di peso molecolare della proteina sono indicati in kDa. IP = immunoprecipitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Concentrazione dei reagenti Stock | Concentrazione finale dei reagenti | Esempio di volumi aggiunti basata su concentrazioni d'archivio |
| 1 M Tris-HCl pH 7.4 | 20,0 mM | 200 Μ l |
| 4 M di NaCl | 20,0 mM | 50 Μ l |
| 20% Triton X-100 | 0,50% | 250 Μ l |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 Μ l |
| 1 M DTT | 0,5 mM | 5 Μ l |
| 200 mM Na3VO4 | 1,0 mM | 50 Μ l |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 Μ l |
| β-glicerolo fosfato di 500 mM | 10,0 mM | 200 Μ l |
| H2O | 8,945 mL | |
| + 1 completa Mini scheda/10 mL | 1 compressa |
Tabella 1. Ricetta di buffer di lisi (10 mL, 1 X).
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Discussion
Qui, descriviamo un metodo relativamente semplice biochimico per l'identificazione dei substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso. I passaggi critici del presente protocollo si basano sull'insolita proprietà enzimatiche di CK2 e includono CK2-dipendente thiophosphorylation delle proteine substrato specifico utilizzando GTPγS e loro successiva immunoprecipitazione e identificazione. Con questi risultati, abbiamo dimostrato l'utilità e la versatilità di questo approccio come ora abbiamo applicato questa strategia in entrambe le cellule di glioblastoma umano e Drosophila ovaie18.
Una serie di studi precedentemente pubblicati utilizzando approcci quantitativi fosfoproteomica infatti si è dimostrate efficaci nell'identificare nuovi CK2 substrati19,20,21,22, 23. Tuttavia, alcune di queste strategie fanno uso delle matrici di substrato immobilizzato, ed è possibile che la conformazione di una proteina immobilizzata può rendere un potenziale sito di fosforilazione inaccessibili per la chinasi. La tecnica qui descritta consente fosforilazione all'interno di un ambiente più fisiologico o nativo (cioè, un lysate delle cellule), quindi ridurre la probabilità di inaccessibilità del sito. Un altro vantaggio di questa strategia è che una volta che l'identificazione delle proteine è determinata tramite spettrometria di massa, convalida di putativi CK2 substrati facilmente può essere eseguita su campioni raccolti nel corso del procedimento, se gli anticorpi diretti contro il substrato proteina di interesse è disponibili. Ad esempio, utilizzando standard macchiarsi occidentale, uno dovrebbe osservare una riduzione del livello di proteina rilevante nei campioni impoverito (post-IP) e la sua presenza nell'anti-thiophosphate estere immunoprecipitates come abbiamo dimostrato per il noto CK2 substrato nucleolina (Figura 4).
Una notevole limitazione di questo metodo è che il passaggio finale della procedura prima dell'analisi mediante spettrometria di massa si basa sulla capacità di discernere le differenze discrete nel reticolo su un gel di banding. Così, è certamente possibile che specifici substrati CK2 possono essere perso se sono di scarsa abbondanza e quindi inferiore al limite di rilevamento visivo. Se uno è interessato a questa possibilità, un metodo più sensibile come macchiatura d'argento può essere utilizzato per visualizzare queste proteine anziché blu di Coomassie. Un'ulteriore considerazione che dovrebbe essere riconosciuta è che un numero di CK2 substrati non può essere identificato utilizzando questa strategia, poiché i siti fisiologicamente rilevanti sarà già fosforilata in vivo. Questo è quasi certamente il caso dato l'attività costitutiva di CK2. Infine, si deve anche osservare che questa metodologia identifica solo proteine come substrati putativi di CK2 in vitro. Successive analisi per convalidare che questi sono fisiologicamente pertinenti substrati di CK2 in vivo sono richieste e dovrebbero comportare l'identificazione di siti di fosforilazione di CK2-dipendente e di valutare se la fosforilazione di questi residui particolare è modificato in risposta a manipolazione di attività della chinasi CK2.
In sintesi, questa strategia accoppiata con approcci sperimentali a valle (mappatura di sito di fosforilazione di mutagenesi sito-diretta, saggi funzionali in vitro ed in vivo , analisi di troncamento/omissione, ecc.) faciliterà lo studio di questa chinasi insolita e aumenterà la nostra comprensione dei diversi ruoli che CK2 gioca in più sistemi biologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione del Commonwealth universale ricerca Enhancement Pennsylvania dipartimento della sanità di t.i.s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
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