Summary
여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.
Abstract
인간의 본질적인 microbiota 인간의 건강과 질병에 중요 한 역할을 한다. Vivo에서 모델을 사용 하 여 본질적인 microbiota 공부, 복잡 한 자연, 및 포유류 구성 요소와의 다양 한 연결 어렵습니다. 이 프로토콜의 목표는 본질적인 microbiota 생체 외에서, 본질적인 microbiota 역학의 연구에 대 한 포유류 환경의 기여를 고려 하지 않고 수 있는 문화 이다. 체 외에서 배양 기술을 사용 하 여, 위장 장 관의 생리 상태는 시뮬레이션, pH, 온도, anaerobiosis, 운송 시간 등의 매개 변수를 포함 하 여. 결 장의 표면 mucin 코팅 사업자를 추가 하 고, 점 막 단계를 만드는 추가 차원을 추가 하 여 시뮬레이션 됩니다. 본질적인 microbiota 인간의 배설물 소재 접종에 의해 소개 된다. 박테리아의이 복잡 한 혼합 접종 시 특정 미생물 풍성 하 게는 다른 경도 (오름차순, 가로 및 내림차순 콜론) 및 생체 외에서 모델의 횡단 (luminal 및 점 막) 환경. 그것은 있는 지역 사회와 대사 산물 생산 안정적으로 유지 하는 정상 상태에 도달 하는 게 중요 합니다. 이 원고에서 실험 결과 시간이 지남에 접종된 본질적인 microbiota 커뮤니티 안정적인 커뮤니티로 개발 하는 방법을 보여 줍니다. 정상 상태 달성 되 면 세균성 상호 작용 및 지역 사회 기능을 분석 하거나 음식, 음식 구성 요소, 의약품 등 본질적인 microbiota에 어떤 첨가물의 효과 테스트 하는 시스템을 사용할 수 있습니다.
Introduction
본질적인 microbiota 인간의 위장 지역 (GIT)에 있는 미생물의 커뮤니티입니다. 이 커뮤니티는 콜론 콜론 환경1,2공생에 살고 있는 500-1000 종에서 1013-10-14 박테리아를 추정 되는 최대 농도 도달 합니다. 본질적인 microbiota의 기능과 구성2,3,,45distally 발견 대부분 다양성 지역 특정 커뮤니티를 형성 하는 GIT 따라 공간적으로 변경 합니다. 각 해 부 지역에 대 한 별도 미생물 지역 사회 거주 루멘에와 점 막 라이닝6에. 루멘 커뮤니티 기판 이동 luminal 구획7영양소에 대 한 직접적인 액세스를 있다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 박테리아는 mucin 에너지 소스1,,58로 결 장 세포에 의해 생산을 활용 하 여 점액 층에 우선적으로 상주 합니다. Luminal 및 점 막 단계 microenvironments에 차이 위상 특정 커뮤니티의 개발에 결과. 함께, 이러한 커뮤니티 영양소 대사와 비타민, 생산 등의 신진 대사 기능 및 인간 병원 체1,3, 의 식민을 방지 하는 등 면역 기능 제공 9. 본질적인 microbiota 또한 인간의 콜론 셀3활용에 기능적으로 작동.
인간의 GIT의 중요 한 부분으로 그것은 놀라운 본질적인 microbiota 두 호스트 건강 및 질병 상태3,9,10,,1112을 알려져 있다. 창 자 미생물 인구 변화 장 장 질병 (IBD)와 장 창 자 증후군 (IBS), 뿐만 아니라 비만, 순환기 질환, 자폐증 등 다른 질병 처럼 GIT 질환 등 여러 인간의 질병와 연결 되어 3 , 9 , 10 , 11 , 12. 본질적인 microbiota에서 생산 하는 대사 산물 용기12,13까지 위치를 도달 글로벌 효과 있다. 예를 들어 창 자 뇌 축14불안과 우울증 같은 정신 질환에 연결 됩니다. 따라서, 본질적인 microbiota을 공부, 연구의 여러 분야에 중요 한 이며 심지어 그는 GIT와 자주 관련 된 많은 질병에 적용 됩니다.
그것은 널리 인정 본질적인 microbiota을 공부 하 고 중요 한, 그것은 복잡 한 노력입니다. 여러 동물 모델 원숭이 돼지15-19같은 큰 것 zebrafish, 쥐, 및 쥐 같은 작은 동물에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 인간의 본질적인 microbiota 측면에서이 동물의 응용 하지 간단 때문이 동물에 독특한 세균성 지역 사회 진화 환경에 다이어트, 따라 그리고 그들은 해부학 다른 인간20 , 21. 인체를 사용 하 여 관련성의 질문 제거 아직 도전의 또 다른 세트를 소개 합니다. 인간 연구는 비싼, 시간이 소모 되 고 윤리적 제한11. 또한, 혼동 요인 나이 또는 발달 단계, 환경, 다이어트, 약물 치료, 그리고 유전적 요인2,,422를 포함 하 여 인간 연구에서 본질적인 microbiota 영향. 인 간에, 테스트할 수 있습니다 그리고 어떤 유형의 샘플4번에서 무엇을 수확 수 있습니다에 대 한 제한도 있습니다.
본질적인 microbiota 공부을 vivo에서 시스템을 사용 하 여 1 개의 중요 한 불리는 포유류 부품의 존재입니다. 본질적인 microbiota와 인간 세포 서로, 상호 작용 그리고 vivo에서 설정, 그것은 둘을 구별할 수 있습니다. 본질적인 microbiota에 의해 생산 하는 대사는 촬영 결 장 세포에 의해 측정 정밀도로 산출 될 수 없습니다. 따라서, 모든 기계 연구 끝점 측정11를 제한 해야 합니다. Vivo에서 학문에 대 한 또 다른 주요 단점은 경도 GIT의 다른 지역에서 샘플을 수확 하는 무 능력은23. 이 시간12에 콜론의 microenvironments에서 발생할 수 있는 변경의 평가 대 한 허용 하지 않습니다. 많은 비보에 연구, 인간 연구, 본질적인 microbiota12변경 내용을 감지 하 배설물 샘플의 분석에 의존 합니다. 그러나이 유익, GIT에서 본질적인 microbiota에 데이터를 제공 하지 않습니다 그것과 luminal 및 점 막 커뮤니티5,6,,78을 구분 하지 않습니다.
본질적인 microbiota 포유류 구성 요소에서 간섭 없이 세균성 지역 사회의 역학을 공부 하는 체 외에서 방법의 응용 프로그램이 필요 합니다. 생체 외에서 메서드를 사용 하 여 환경 조건10, 동시에 여러 개의 매개 변수 테스트 및 경도, 샘플 수의 꽉 컨트롤 큰 볼륨11에 대 한 수 있습니다. 때문에 생체 외에서 메서드 사용 기계 장치 및 호스트 하지, 아니 고려 나이, 환경, 다이어트, 또는 유전 배경 필요 하다. 이러한 시스템 전체 본질적인 microbiota 커뮤니티 테스트를 사용할 수 있는, 유기 체, 또는 심지어 단일 종자만 선택. 중요 한 것은, 생체 외에서 결과 재현할, 아직 vivo에서 연구11,22에 비해 다양성의 수준을 유지.
문제의 가설 및 원하는 결과 따라 in vitro 연구는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 그들은 단일 선박 시스템 및 배설물 homogenate24 샘플 잠복기 또는 24-48 h25의 과정을 통해 단일 일괄 처리 문화 등 간단한 방법을 활용할 수 있습니다. 그들은 또한 단일 선박 시스템 및 생산 안정 창 자 미생물 커뮤니티11chemostat 시스템을 사용 하 여 더 복잡 한 메서드를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 단일 반응 기를 사용 하 여 지나치게 단순화할 수 microbiota12 만 콜론의 한 부분을 대표 하기 때문 결 가로, 오름차순, 내림차순 영역의 구성에 불구.
본질적인 microbiota 커뮤니티 콜론 (오름차순, 내림차순 가로, 지역)의 다른 지역에서 개발 하 고, 공부 하기 위하여 복잡 하 고 다단 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 시스템에서 여러 용기 오름차순, 내림차순 가로, 지역의 본질적인 microbiota 독립적으로 재배 하지 않습니다 콜론의 다른 지구를 모방 하 설치 된다. 순서 대로 오름차순 내림차순 콜론 지역에 통과에서 기판 이동 펌프를 사용 하 여, GIT 통해 영양분의 흐름을 흉내 낸 이러한 혈관 연결 됩니다.
이 연구의 목적은 5 단계 생체 외에서 문화 시스템 ( 재료의 표참조) 사용 하는 방법을 본질적인 microbiota 커뮤니티 육성에 있고 안정성 및 구성 지역 사회 역학을 설명 했다. 이 시스템에서는, 한 그릇 위 나타내고 하나 소장을 나타냅니다. 결 각 지역26를 대표 하는 한 그릇으로 (가로 오름차순, 내림차순), 3 개의 지역으로 분할 된다. 이 실험적인 체제에서 두 개의 완전 한 시스템을 동시에 실행 했다, 단위 1 점 막 표면 및 아무 mucin 사업자를 포함 하는 단위 2 나타냅니다 mucin 캐리어를 포함 하. 각 지역의 luminal 및 점 막 단계에서 개발 커뮤니티 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 SCFA 분석을 사용 하 여 시간이 지남에 지저분한 inoculum을 서로 비교 했다. 제시 결과 커뮤니티, 구성 및 기능, 생체 시스템의이 종류에서 생성 될 수 있다 둘 다의 종류를 보여 줍니다.
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Protocol
1. 재료 및 준비
참고: 정의 된 중간 파우더로 구입 ( 재료의 표참조). G/L에서 정의 된 매체의 구성은 다음: 포도 당 (0.4), 효 모 추출 물 (3.0), 특별 한 펩 (1.0), Mucin (2.0), L-시스테인-HCl (0.2), Xylan (0.5), 펙 틴 (2.0), Arabinogalactan (1.2).
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정의 된 매체 준비
- 두 배 증류수, 이온을 제거 된 물 2 l 4 L 플라스 크를 채우십시오.
- 정의 된 중간 분말의 29.2 g 물에 추가 하 고 혼합 단위 완전 한 무 균.
- 자기 활동가 추가 하 고 느슨하게 뚜껑에 나사.
- 30 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
- 냉각 후, 일정 한 동요 (자력)와 4 ° C에서 냉장고에 준비 된 정의 된 매체를 저장 합니다.
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췌 장 주스를 준비
- 압력솥 추가 활동가 바와 5 리터 용기에 증류수, 이온을 제거 된 물 2 L, 30 분 동안 121 ° C에서.
- 압력가 마로 소독, 후 실내 온도에 냉각 하 물 허용.
- 12.5 g NaHCO3, 6 g 담 즙 및 0.9 g pancreatin를 추가 합니다. 혼합 자력에 놓습니다.
참고: 췌 장 주스 2-3 일 마다 신선한 준비 하 고 그것을 만든 후 동요와 함께 냉장 해야 합니다.
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인산 염 버퍼
- 장소는 자력에 자력 bar가 포함 된 1 L 플라스 크. 증류수, 이온을 제거 된 물 0.5 L을 추가 하 고 동요를 켭니다.
- 다음, 6.8 g KH2포4, 8.8 g K2HPO4, 그리고 0.1 g 나트륨 thioglycolate를 추가 합니다. 물 1 l.의 최종 볼륨을 위로합니다
- 구성 요소는 완전히 해산 후 NaOH를 사용 하 여 7.0에 pH를 조정 합니다.
- 느슨하게 그리고 단단히 폐쇄 하는 스크류 캡 뚜껑 및 뚜껑에 망 30 분 확인 위한 121 ° C에서 압력솥 2 L 용기로 한 버퍼를 붓는 다.
- 오토 클레이 브에서 제거한 후 실내 온도에 냉각 솔루션을 수 있습니다. 2까지 주 동안 실내 온도에 버퍼를 저장 합니다.
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준비 하는 Mucin agar 캐리어
- 압력솥 플라스틱 mucin 사업자 ( 재료의 표참조), 집게, 플라스틱 메쉬 (관 모양), 그리고 30 분 131 ° C에서 우편 넥타이.
- 압력솥의 더블 300 mL 소 주, 드 이온 수 131 ° C 실 온에서 30 분이 게에서 사용까지.
- Biosafety 층 류 캐비닛에 접시 살 균 소독 집게를 사용 하 여 플라스틱 mucin 사업자 채워 놓습니다.
참고: Mucin 캐리어는 mucin agar로 채워지는 빈 플라스틱 원. 뚜껑 위에 놓일 수 있다, 일단 고이 따로 있습니다. - Mucin agar를 준비 하려면 3g 세균성 agar의 돼지 mucin의 15 g 압력가 물 300 mL를 추가 합니다.
- 증기 두건에서이 솔루션을 끓여 야 다음 열 소스에서 제거 하 고 끓는 및 총 3 번에 대 한 냉각을 반복 하는 1 분에 대 한 시원한 수 있습니다.
- 일단 mucin agar 솔루션을 포함 하는 유리 그릇을 만지고 충분히 멋지다, biosafety 층 류 캐비닛으로 이동 합니다.
- 층 류 캐비닛 biosafety에 액체 mucin agar 배양 접시에 배치 했다 플라스틱 mucin 사업자 붓는 다. 모든 항공사 mucin agar와 완전히 가득 확인 합니다.
- 페 트리 접시에 다시 뚜껑을 배치 하 고 층 류 아래 시원한 수 있도록.
- Mucin 운반대를, 압력가 플라스틱 그물에 걸릴 하 고 소독 집게를 사용 하 여 배양 접시에서 응고 mucin agar를 포함 하는 mucin 사업자를 삽입 합니다.
- 우편 넥타이 사용 하 여 메시의 끝을. 이런식으로 mucin 사업자를 포함 하도록 net 기능 mucin agar 가득 합니다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.
2. 설정, 접종, 그리고 시스템의 실행
- 자란 시스템의 설정
참고: 인간 장내 미생물 생태계의 트윈 시뮬레이터가이 연구를 위해 사용 되었다.- 장소 10 생물 반응 기 교 반기 자석 교 반기에 막대를 포함 하 고 동요를 켭니다.
참고: 각 단위는 2 대 10 bioreactors 필요 합니다 5 bioreactors의 구성 됩니다. - 5 bioreactors 실리콘 튜브 연동 펌프 (그림 1)의 방법으로 순서 대로 사용 하 여 서로 연결 합니다. 사용 하 여 가로를 펌프 유체 내용을 한 생물에서 다음.
- 다음 순서로 bioreactors 라벨: 위, 소장, 오름차순 콜론, 가로 장, 위장의 순서를 나타내는 콜론 내림차순.
참고: 생물 반응 기 모두 수 동일, 또는 위장과 소장 bioreactors 비교 될 수 있다 작은 콜론 bioreactors 이후 그들은 더 적은 볼륨을 개최 한다. 이 방법으로 bioreactors 설정 의미 오름차순 콜론 지역 소장에서 영양분을 받고, 가로 콜론 지역 오름차순 콜론 지역에서 양분을 받는 내림차순 콜론 지역 수신에서 영양분은 가로 영역입니다. 이 방법으로 시스템은 위장 기관을 통해 양분의 순차적 움직임 흉내 낸. - 자석 교 반기를 사용 하 여 일정 한 동요와 4 ° C에서 냉장고에 정의 된 매체 및 췌 장 주스를 두십시오. 실리콘 튜브를 사용 하 여 정의 된 매체 연동 펌프를 통해 위 생물 하 고 연결 췌 장 주스 연동 펌프를 통해 소장 하.
- 소변 배수 가방에 응고 에이전트를 추가 합니다. 연동 펌프를 통해 소변 배수 가방에 하강 콜론을 연결 합니다. 폐기는 응고의 실험 기간 동안 생물학 낭비로.
- 실리콘 튜브를 사용 하 여, 순서 대로, 각 선박의 물 재킷 고 회람 물 목욕을 각 끝을 연결. 증류수 (이 금액은 회람 물 목욕 사용의 유형에 따라 달라 집니다)와 37 ° c.로 설정 회람 물 목욕을 채우십시오
- 실리콘 튜브를 사용 하 여, 산과 기본 연동 펌프를 통해 각 그릇의 뚜껑을 연결 합니다. 권장된 농도 0.5 M HCl 0.5 M NaOH.
- 뚜껑에 지정 된 포트를 통해 각 선박에 pH 프로브를 삽입 합니다. 이 포트는 pH 프로브와 나사 뚜껑 (그림 1)에 설계 되었습니다. 각 지역에 대 한 pH를 다음과 같이 설정: 위, pH = 2; 소장, pH 6.7-6.9; = 오름차순 콜론, pH = 5.6-5.9; 가로 결 장, pH = 6.15-6.4; 하강 콜론, pH = 6.6 6.9.
참고: 초기 단계는 지역 사회 지역 pH 값에 차이에 따라 차별화 됩니다. 그러나, 일단 먹이 주기 시작, 지역 사회 더 영양 입력의 차이에 따라 성숙 됩니다. - 지정 된 포트를 사용 하 여 각 그릇의 뚜껑에 실리콘 튜브를 사용 하 여 질소 선을 연결 합니다. 질소 선 다음 순서로 흐름 해야: 가로 콜론 콜론 내림차순, 오름차순 콜론, 소장, 위장. 각 단위는 그것의 자신의 flush 상호 오염 방지를 확인 합니다.
참고: 질소는 시스템에서 제거 된 산소를 사용 하 고 실험 기간 동안 anaerobiosis를 유지 합니다. - 지정 된 포트를 사용 하 여 각 생물의 뚜껑을 통해 금속 샘플 튜브를 삽입 합니다. 금속 튜브는 생물에 아래로 확장 하 고 액체 샘플을 수집 하는 데 사용 됩니다.
- 샘플 튜브의 맨 끝에 실리콘 튜브의 작은 조각을 추가 하 고 허용 하기 위해 주사기를 사용 하 여 샘플링 동안 Luer 잠금 연결.
- 장소 10 생물 반응 기 교 반기 자석 교 반기에 막대를 포함 하 고 동요를 켭니다.
- 시스템의 접종
- 다음 볼륨을 사용 하 여 정의 된 매체와 콜론 영역 채우기: 오름차순 콜론에 500 mL, 가로 결에서 800 mL 및 하강 콜론에서 600 mL.
- 원자로의 볼륨에 비례 금액에서 콜론 지역에 mucin agar 사업자를 추가 합니다. 이 실험에 대 한 반응 기 당 60 캐리어 사용 되었다.
- 이후는 생물 반응 기에 있는 액체의 수준을 제기 사업자 추가 샘플 튜브와 주사기를 사용 하 여 모든 초과 정의 된 매체를 제거 합니다.
- 컴퓨터를 사용 하 여 각 반응 기에 pH를 조정 하는 pH 프로브를 켭니다.
- 20 분 동안 질소 플러시를 켭니다.
참고: 분 변 homogenate 접종에 대 한 사용은 10% 글리세롤 용액에 무 균 10% 배설물으로 구입 ( 재료의 표참조). 분 변 샘플은 다음과 같은 기준으로 기증자의 수영장에서 무작위로 선정: 미국 무료는 평균 체 질량 지 수 (18.5-24.9)와 1 년 이상에 대 한 전형적인 서쪽 규정식 (철저 한 채식주의자 또는 채식주의), 21-45 세 나이, 항생제의 소비 . 이 프로토콜에 대 한 하나의 기증자만 사용 됩니다. 그러나,이 실험 설계 변경 될 수 있습니다. - 이전에 접종, 제조업체의 지침에 따라 지저분한 homogenate 녹여.
- 5% (25 mL 오름차순 콜론, 가로 콜론 내림차순 콜론에 대 한 30 mL 40 mL에 대 한) 60 mL 주사기를 사용 하 여 샘플 포트를 통해 원자로 볼륨의 동일한 금액에서 배설물 homogenate를 추가 하 여 각 콜론 원자로 예방.
- PH 제어와 하룻밤 bioreactors에서 문화를 성장.
- 밤새 성장 후 각 콜론 지역 아래 섹션 3에서에서 luminal 액체의 샘플을 수확. 샘플링을 완료 후 수 유 하려면 컴퓨터 프로그램 설정.
- 매일 먹이 주기
참고: 매일 먹이 주기는 자동 컴퓨터.- 하루에 세 번 위 생물에 정의 된 매체의 140 mL를 펌프 하 고 1 시간에 대 한 품 어 수 있습니다.
- 1 h 부 화 후 소장으로 복 부의 내용을 펌프. 동시에 소장으로 췌 장 주스의 60 mL를 펌프.
- 작은 창 자에서 pH 6.7-6.9에 산도 조정에 바뀌고 90 분 동안 품 어 혼합물 허용. 부 화를 하는 동안 10 분의 총에 대 한 각 시스템에 대 한 질소 플러시를 켭니다.
- 90 분 부 화 후 오름차순 콜론, 가로 장, 폐기물을 내림차순 콜론 내림차순 콜론을 가로 콜론을 오름차순 콜론을 작은 창 자에서 펌프에 동시에 설정.
- 실험 일정
참고: 는 길이에서 약 8 주 동안 지속적인 패션 여기 사용 하는 생체 외에서 시스템 운영. 그러나 아래 권장된 실험 일정은,,이 요구 사항 및 실험의 목적에 따라 수정할 수 있습니다.- 다음 단계는 단계 2.1에에서 나열 된 시스템을 설정 합니다.
- 하룻밤 성장 아래 프로토콜을 다음에서 베스트 샘플. 매일 주기, 먹이 하루에 세 번 다음 위의 프로토콜을 시작 합니다.
- 총 안정화에 박테리아 수 있도록 2 주에 대 한 실험을 실행 합니다.
참고: 시스템 실행 의미 pH 유지, 매일 먹이 주기는 하루에 세 번 다음 점 막 사업자 각 2-3 시간 변경 됩니다 주. - 안정화, 후 제어 기간으로 2 주 동안 실험을 실행 합니다.
- 제어 기간 후 다른 구성 요소 또는 치료 기간으로 알려진 변수를 테스트 하는 시스템을 사용 합니다.
- 치료 기간 후 추가 구성 요소 또는 변수를 중지 하 고 조건 정상으로 반환 합니다. 이 워시 아웃 기간 간주 되며 사회 변화는 영구 여부를 결정 하는 데 사용.
3. 샘플 시스템에서 수확
참고: 실험 기간 동안 샘플 수확 수 있습니다 언제 든 지, 어떤 영역의 luminal 또는 점 막 단계에서 다음에 지침 아래.
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수확 luminal 샘플
- 문화 액체의 중간에 확장 샘플 포트를 통해 luminal 액체 샘플을 수확. 70% 에탄올 또는 작은 알코올 패드 샘플 포트에 Luer 잠금 청소 하 여 시작 하 고 건조를 허용 합니다.
- 모든 공기 30 mL 주사기에서 제거 됩니다 확인 하 고 샘플 포트에 연결. 그리기를 위아래로 3-5 회 선박 부품의 적절 한 혼합을 보장. 후, 문화의 30 mL의 총을 그립니다.
- 약 수로 luminal 샘플 메 마른 팔 콘 튜브와 얼음에 저장소에 필요한. 샘플링 완료-80 ° C 냉동 고에 전송 합니다.
- SCFA 분석용 luminal 샘플의 15 mL는 4 ° C, 10 분 동안 5000 x g 에서 회전 된다. 상쾌한 주사기 PES 0.2 μ M 필터를 사용 하 여 필터링입니다. -80 ° c.에 필터링 된 상쾌한 저장
- DNA 분석, 스핀 4 ° C에서 luminal 액체의 1 mL, 10 분에 대 한 5000 x g 는 상쾌한 삭제 하 고-80 ° c.에 펠 릿을 저장
- 백업으로 대부분 실험-80 ° C에서 luminal 액체의 10 mL를 저장 합니다.
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점 막 샘플 채취
참고: 변경 점 막 사업자 마다 2-3 일.- 제거 하 고 냉장고에서 준비 mucin 운반대 밖으로 내 보일.
- 질소 플러시를 켜고 신속 하 게 원자로 뚜껑을 엽니다. Mucin 사업자의 50%를 제거 하 고 새로운 것 들을 추가.
- 신속 하 게 뚜껑을 밀봉 하 고 또 다른 20 분에 대 한 플러시에 질소를 유지.
- DNA 추출, aliquot 0.25-0.5 g 2 mL 튜브에 agar의-80 ° C까지 필요에 저장.
4. DNA 추출, 시퀀싱, 및 분석
참고: DNA는 연기 후드29물리적 균질와 CTAB DNA 추출 방법을 사용 하 여 추출 됩니다. 추출, 다음 한 분 광 광도 계는 각 샘플에서 DNA의 양을 계량 하는 데 사용 됩니다.
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준비 하는 CTAB 버퍼
- 4.2 g K2HPO4 와 4.09 g NaCl 이온, 증 류 물, 다음 30 분 동안 121 ° C에 고압의 200 mL에 용 해.
- 실내 온도에 냉각 솔루션을 수 있습니다.
- 동요와 60 ° C에 Hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드 (CTAB)와 열 10 g를 추가 합니다.
- 모든 CTAB 해산 후 실내 온도에 열과 멋진 솔루션을 제거 합니다.
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못-6000 솔루션 준비
- 폴 리 에틸렌 글리콜 6000 및 93.5 g 이온, 증 류 된 물 1 L에 NaCl의 300 g을 분해.
- 후에 모든 입자는 해산, 압력솥 30 분 동안 121 ° C에서 솔루션.
- 압력가 마로 소독, 후 솔루션을 사용 하기 전에 실내 온도에 냉각 한다.
-
DNA 추출
- 2 mL 샘플 튜브를 균질을 소용돌이 CTAB 버퍼의 500 μ와 페 놀-클로 프롬-Isoamyl 알콜의 500 μ를 추가 합니다.
- 0.1 m m 물리적 조직 관 ( 재료의 표참조)을 샘플 튜브의 전체 내용을 전송 합니다.
- 균질 20 튜브는 가장 높은 설정 두 번, 물리적 균질 화기를 사용 하 여 사이 20 s 일시 중지와 함께 s ( 재료의 표참조).
- 5 분 동안 3000 x g 에서 무 균된 튜브 원심
- 깨끗 한, 1.7 mL 튜브에는 상쾌한의 300 μ를 전송 하 고 추가 500 μ CTAB 버퍼의 원래 튜브.
- 다시 방법을 사용 하 여는 단계 4.3.2-4.3.3와 원심 분리기 3000 x g 에서 5 분이이 튜브 균질
- 원심, 후 지금 600 μ를 포함 하는 새로운 튜브에 상쾌한의 또 다른 300 μ를 전송.
- 600 μ는 상쾌한의 포함 된 튜브에 600 μ 클로 프롬 Isoamyl 알콜의 총을 추가 합니다.
- 혼합, 및 다음 짧게 원심 튜브 반전. 깨끗 한 1.7 mL 튜브에 상위 단계의 500 μ를 전송. 최고 단계만을 확인 합니다.
- 다음, 추가 말뚝-6000 솔루션의 1000 μ, 혼합, 및 다음 2 시간에 대 한 실 온에서 품 어 튜브 반전.
- 부 화, 후 원심 18200 x g, 4 ° C, 10 분에 관.
- 삭제는 상쾌한 고 얼음 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 청소.
- 10 분 삭제는 상쾌한 고 수 층 류에서 biosafety 내각을 펠 릿 18200 x g, 4 ° C에서 다시 튜브를 원심.
- 펠 릿 건조 후 각 튜브를 무료 RNAse, DNAse 무료, 메 마른 물 75 μ를 추가 합니다.
- Resuspended DNA는 분 광 광도 계에 의해 측정 하 고 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 대 한 그것을 밖으로 보낼.
5. 짧은 사슬 지방산 (SCFA) 탐지 및 분석
- 30 분 동안 40 ° C에서 냉동된 샘플을 해 동 하 고 2:1 (v: v) 비율로 diethyl 에테르를 사용 하 여 짧은 사슬 지방산을 추출.
- 전송 열, 30 m, 0.25 m m를 장착 하는 GC/MS ( 재료의 표참조)을 유기 단계 ID, 0.25 µ m ( 재료의 표참조) 10 µ L 주입 됩니다.
- 주입 포트 온도 및 설정 초기 열 온도 260 ° C 및 125 ° C에 각각. 1 분에 대 한 초기 온도 누른 다음 250 ° C, 1 mL/min의 열 유량과 11.5 분 이상이 증가 합니다.
참고: 이온 소스에 대 한 MS 온도 220 ° C, 250 ° C 인터페이스에 대 한. - 내부 표준으로 표준 곡선 및 2 methylhexanoic 산을 사용 하 여 각 SCFA의 양을 계량.
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Representative Results
위의 프로토콜 설정을, 접종, 그리고 콜론의 본질적인 microbiota 공부 5 단계 생체 시스템의 실행에 설명 합니다. DNA 추출, 다음 아래, 데이터를 생성 하 V1V2 지역의 16S rRNA 마커 유전자 DNA 시퀀싱 미생물 센터 아 이들의 병원에 (예:, MiSeq Illumina 플랫폼)을 시퀀싱 하는 높은 처리량을 사용 하 여 수행 했다 필라델피아27의 QIIME (양적 통찰력 미생물 생태학) 버전 1.928 시퀀싱 데이터를 처리 하는 데 사용 했다 하 고 통계 분석 통계 컴퓨팅29R 환경에서 수행 되었다. 분류학 할당 Greengenes 16 참조 데이터베이스30,31를 사용 하 여 생성 되었다. OTU 관계 되는 풍부 값은 OTU 읽을 수 읽기 샘플에서의 총 수로 나누어 계산 했다. SCFA 수준은 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여 정량 했다.
는 생체 외에서 지역 사회 정상 상태 균형 달성
본질적인 microbiota 및 짧은 사슬 지방산 (SCFA) 생산에서 체 외에서 다단계 시스템 연구 수 미생물 지역 사회 정상 상태에 도달 해야 합니다. 이 경우 접종 후는 taxa 그들의 틈새에서 설립 되 고 지역 사회와 그들의 대사 산물의 구성 이상 변동 됩니다. 정상 상태에서 지역 사회와 그 제품 그대로 시간이 지남에. 생체 외에서 본질적인 microbiota 연구, 안정성은 주요 요구 사항; 안정성, 없이 관찰 된 변화 실험 조건으로 인해 발생 하는 여부 또는 그들은 변형 때문 인지 확인할 수 아니다. 어떤은 문학에서 제시 되었다에 따라 커뮤니티 여겨질 수 있다 안정 시간 포인트32사이 80% 유사성 있을 때.
16S rRNA 마커 유전자 시퀀싱의 결과 사용 하 여, 주 좌표 분석 (PCoA) 플롯 unweighted 및가 중 UniFrac 거리에 따라 사회 시간 (그림 2)에 시스템의 각 지역에 개발에 대 한 생성 되었다. Unweighted 분석 종의 존재/부재의 관점에서 사회 비교합니다. 가중치 분석 뿐만 아니라 종의 존재/부재에 따라 그들을 비교 하지만, 또한 그들의 풍부를 고려. 단위 1이 둘 다 luminal 및 점 막 단계, 포함 및 단위 2만 luminal 단계. 이 분석에 따라, 지역 사회 일 1과 7 사이 평가할 수 있 변화 관찰 되었다. 그러나, 실험의 끝까지 하루 11 게시물 접종에서 샘플 PCoA 공간의 작은 지역을 점령 했다. 이것은 샘플 샘플 거리 점수 OTU 존재-부재 (그림 2A) 나 OTU 풍부 (그림 2B)에 기반에 대 한 사실 이었다. 따라서, 그것은, 11 일 후, 풍부 하 고 박테리아의 유형을 했다 다음 한 샘플 포인트에서 안정적인 관찰 되었다. 이 패턴은 단위 1의 모든 3 개의 콜론 지역 및 단위 2의 luminal 단계 luminal 및 점 막 단계에 대 한 관찰 되었다. 이 결과 그림 luminal 및 점 막 단계 안정성을 도달 하 고이 동시에 발생 했습니다.
시스템 안정성 또한 시간이 지남에 따라 짧은 사슬 지방산 (SCFAs)의 생산을 분석 하 여 조사 했다. 세 가지 가장 눈에 띄는 SCFAs (프로 산, butanoic 산 그리고 아세트산)38 가스 크로마토그래피 GC/MS를 사용 하 여 실험의 과정을 통해 각 샘플에서 측정 되었다. 이러한 측정을 프로 산과 butanoic 산, 초 산 요동 실험의 시작에서 하루 15 게시물 접종 (그림 3A-C)까지 밝혔다. 15 일 후 이러한 SCFAs의 금액 (그림 3A-C) 실험의 끝까지 발생 하는 최소한의 변경만와 일정, 남아 각 콜론 지역에서 생산. 시간 점 사이의 차이점은 프로 산 6.8%, 7.2% 초 산, 대 한, butanoic 산 8.02%의 평균. 이 유사한 지역 사회에, 사회의 변화 속성 입력 정상 상태, 시간이 지남에 안정 양의 SCFAs의 생산에 의해 표시 된 대로 나왔다. 유닛 1과 유닛 2 둘 사이의 큰 차이 없이 비슷한 양의 SCFAs, 생산 (p > 0.05). 이 SCFAs의 생산 점 막 커뮤니티의 유무에 의해 영향을 받지는 것을 나타냅니다. 이 실험에서 결정 하는 안정성의 요점은 이전 보고와 유사한, 그것은 명시 했다 5 단계 생체 외에서 시스템에 있는 지역 사회 안정화 발생 약 2 주 게시물 접종33, 주목 해야 한다 34,35.
는 지역 사회 개발에 생체 외에서 시스템은 inoculum 비슷합니다
두 번째 필수 요소는 생체 외에서 본질적인 microbiota 실험에 대 한 모델에서 개발 커뮤니티 지저분한 inoculum의 미생물 다양성을 보존. 이후이 실험에 사용 되는 시스템 제공 3 가지 콜론 지역에 대 한 어떤 한 지역 수 정확 하 게 지저분한 inoculum 동일 예상 수 없습니다. 그러나, 각 커뮤니티의 구성원 지저분한 inoculum에서 파생 되 고 모두 함께 inoculum 다양성의 유사한 수준을 유지 전망 이다.
16S rRNA 마커 유전자 시퀀싱의 결과에 따라, 각 결 장 지역의 luminal 및 점 막 단계에 대 한 평균, 안정적인 커뮤니티 결정된 (일 15-28 게시물 접종) 이었고 지저분한 inoculum (그림 4A)의 지역 사회에 비해. 이 결과 생체 외에서 시스템의 개별 콜론 지역에 개발 지역 사회 구성에 지저분한 inoculum을 유사 했다 보여줍니다. 반응 기, Clostridiales 및 Bacteroidales에 두 개의 가장 눈에 띄는 주문 그는 inoculum에 일치 합니다. 그러나, 콜론 지역에 몇 가지 낮은 풍부 세균성 주문 주문 Burkholderiales 와 Synergistales (그림 4A)의 가장 눈에 띄는 차이와 inoculum에서 달랐다.
생체 외에서 시스템에 대 한 알파 다양성 안정화 후 사회 구조의 또 다른 조치로 inoculum와 비교 되었다. 시간이 지남에, 각 지역에 대 한 계산 섀 넌 인덱스 상승 지역 (그림 4B)에서 luminal 샘플 제외한 모든 지역의 inoculum 다양성의 비슷한 수준에 도달. 함께 찍은, 이러한 결과 생체 외에서 문화 시스템은 지저분한 inoculum 구성와 다양성 (그림 4A-B)에 비해 커뮤니티를 생산할 수 있게 보여줍니다.
를 사용 하는 생체 외에서 시스템 지역 개발 단계 특정 커뮤니티에 대 한 허용
이 시스템에서 세 가지 콜론 지역 다른 pH 값에 유지 하 고 다른 영양소 공급을 받을. (이 프로토콜 섹션에서 언급 했다). 이에 따라,이 지역에서 지역 사회 33을 차별화 예상 된다. 유닛 1과 유닛 2에서 안정적인 (15-28 일) luminal 지역 사회 가족 수준에서 결정 되었고 상대적 풍요 (그림 5)에 따라 플롯. 특정 taxa의 풍부한 점에서 3 콜론 지역 간의 차이가 각 지역 고유 지역 사회를 개발 하는 방법을 보여 줍니다. 이 그림 2 와 그림 4A의 결과 의해 지원 됩니다. 그림 2에서는 각 지역에서 개발 된 성숙한 사회 PCoA 차트에서 서로 다른 위치에 클러스터. 그림 4A, 각 콜론 지역에 지역 사회는 지배적인 순서 일원의 비율에서 달랐다.
이 실험에 대 한 단위 1 단위 2 아무 mucin 사업자 했다 점 막 통신 사업자와 함께 제공 되었다. 이 실험적인 디자인을 바탕으로, 점 막 표면에의 기여를 검사 수 있습니다. 비교 목적으로, 단위 1, 가족 수준에서의 안정 된 (15-28 일) luminal 및 점 막 커뮤니티 상대적 풍요 (그림 6)에 따라 함께 구성 했다. 그것은 모든 3 개의 콜론에 대 한 점 막 luminal 커뮤니티의 구성 일부 taxa, 가장 눈에 띄는 되 고 Lachnospiraceae 의 풍부에 차이가 분명 하 고 Bacteroidaceae. 이러한 결과 또한 3 개의 지역에서 점 막 사회는 서로 다른 다는 것을 보여줍니다. 예를 들어 Clostridiaceae 하강 및 가로 영역의 점 막 커뮤니티에서 풍성 하 게 그리고 Veillonellaceae 는 오름차순 콜론 하지만 가로 또는 내림차순 콜론 지역 점 막 단계에서 더 높은. 함께 찍은, 이러한 수치에 결과 표시 각 단계에서 지역 사회와 지역 간의 구성은 유사에 차이 보여주는 몇몇 taxa에 대 한 각 영역 간의 명확한 차이 풍부입니다.
DNA 시퀀싱의 분석 결과 지역별 커뮤니티의 개발, 비록 지역 간의 SCFAs의 생산에 명백한 차이가 있다. 초 산의 평균 비율: 프로 산: 안정적인 커뮤니티 (15-28 일) Butanoic 산 각 지역 (그림 7A)에 대 한 계산 되었다. 다른 SCFA 비율이 상당히 유사한 동안, SCFAs 가로 오름차순, 내림차순 지역 상부 하강 지역 (그림 7B)에서 발견 된 생산의 총 금액에서 증가 이다. 이것은 유닛 1과 유닛 2에 대 한 사실 이었다.
그림 1: 5 단계, 체 외 실험 디자인의 그림. 완전 한 시스템 다음 구성 요소로 구성 됩니다: 한 순환 물 목욕, 질소 흐름, 유리 bioreactors의 집합, 자력 바 및 자석 교 반기, pH 프로브, 컴퓨터 제어 콘솔 40 연동 펌프를 포함 하는 컴퓨터 모니터, 그리고 냉장고입니다. 주요 시스템은 위장, 소장, 고 가로, 오름차순, 내림차순 콜론 지역 흉내 낸 bioreactors의 일련의 구성 됩니다. 두 명의 완전 한 단위 병렬로 실행 하는 실험 및 컨트롤 그룹에 대 한 제공 설정 됩니다. 즉, 10 bioreactors, 10 pH 프로브 및 10 자석 교 반기는이 실험에 필요한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 체 외 커뮤니티 하루 11 게시물 접종 하 여 안정화. PCoA 분석에 따라 Unweighted (A)와 (B)가 중 Unifrac 거리 시간이 지남에 따라 각 지역의 luminal 및 점 막 단계에 대 한 단위 1 단위 2의 luminal 단계에 대 한. 줄거리는 PCoA 축 계산 후 구성 요소에 다양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 하루 15 게시물 접종에 의해 생체 외에서 시스템에 의해 SCFAs의 생산 안정화. 측량 프로 산과 Butanoic 산, 초 산의 (A) 오름차순 콜론 (B) 가로 결 장 및 (C)에 대 한 시간이 지남에 콜론 내림차순. 실험 3 중에서 수행 되었다. 결과 묘사 표준 편차 오차 막대와 3 개의 독립적인 측정의 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 지저분한 inoculum 생체 외에서 시스템에서 안정 된 사회의 비교. (A)는 안정적인 커뮤니티 (D15-28), 주문 수준에서 평균 되었고 각 결 장 지역의 점 막 및 luminal 단계 및 배설물 inoculum 원형 차트 서식이 지정 된. (B)는 논 각 콜론의 지저분한 inoculum (검은 점선)에 비해 점 막 및 luminal 단계에 대 한 다양성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: luminal 및 점 막 단계 각 콜론 지역에 고유한 커뮤니티의 성장을 촉진. Luminal 및 점 막 단계 및 inoculum, 안정적인 커뮤니티 (D15-28)에 대 한 가족 수준에서 평균 상대적 풍요, 계산 하 고 각 콜론 지역에 대해 함께 꾸몄다 했다. 오차 막대는 timepoints 사이 표준 편차를 나타냅니다. AC1 오름차순 콜론 단위 1; = TC1 = 가로 장 단위 1; D c 1 콜론 단위 1; 내림차순 = AC2 = 오름차순 콜론 유닛 2; TC2 = 가로 장 단위 2; D c 2 = 내림차순 콜론 단위 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 체 외 시스템의 각 콜론 지역 고유 지역 사회 개발. 각 콜론 지역에 지저분한 inoculum 안정적인 커뮤니티 (D15-28)에 대 한 가족 수준에서 평균 상대적 풍요, 계산 되었고 함께 꾸몄다. 실험 3 중에서 수행 되었다. 결과 묘사 표준 편차 오차 막대와 3 개의 독립적인 측정의 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 초 산의 비율: 프로 산: Butanoic 산 비슷합니다 각 콜론 지역에 대 한. (A) 아세트산, 프로, 산과 butanoic 산 각 콜론 지역의 안정적인 커뮤니티 (D15-28)에 대 한 금액 계산 되었고 비율로 변환. (B)는 비율 각 콜론 지역에 대 한 백분율로 표시 했다. 오차 막대는 timepoints 사이 표준 편차를 나타냅니다. AC1 오름차순 콜론 단위 1; = TC1 = 가로 장 단위 1; D c 1 콜론 단위 1; 내림차순 = AC2 = 오름차순 콜론 유닛 2; TC2 = 가로 장 단위 2; D c 2 = 내림차순 콜론 단위 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
생체 외에서 자란 시스템 장의 본질적인 microbiota 연구 개발 되었습니다. 그들은 콜론33의 각 지역에 대 한 성숙한 본질적인 미생물 커뮤니티의 성장을 촉진 위장 장 관의 생리 상태를 시뮬레이션 하도록 설계 된 기구를 사용 합니다. 개념은 논리적이 고 이해할 수 있는, 본질적인 microbiota 공부를 생체 외에서 자란 시스템의 실제 실행 정밀 이해와 무엇을 요구 하 고 신뢰할 수 있는 결과 생산할 것으로 예상 합니다.
생체 외에서 본질적인 microbiota 실험에 대 한 필수 요소는 지역 사회 접종 후 안정성을 도달 해야 하 고 지저분한 inoculum의 미생물 다양성을 유지 해야 합니다. 실험 제대로 실행 하는 경우이 두 개의 필수 요소는 쉽게 하 고 예상 대로 달성 된다. 시스템의 안정성과 다양성에 영향을 미칠 것입니다 프로토콜의 중요 한 단계는 다음: 정의 된 매체와 췌 장 주스의 준비, 정확 해야 합니다 및 배달이이 기판의 일관성이 있어야 합니다. 혐 기성 조건 실험 기간 동안 유지 되어야 합니다. 각 장 지역의 pH는 시간이 지남에 따라 정확 하 게 유지 되어야 합니다. 인구 변동 및 가변 대사 산물 생산 실험 기간 동안 이러한 세 개의 매개 변수에서 변경 될 수 있습니다.
다단 생체 시스템의이 유형을 사용 하 여 여러 가지 장점이 있습니다. 특히, 그들은 콜론의 다른 영역을 시뮬레이션합니다. 그들은 또한 상단 GIT, 타 액, 그리고 pancreatin 및 담 즙의 추가에서 효소 구성 요소를 포함 하 여 식품의 체 외 소화 시뮬레이션을 디자인할 수 있습니다. 점 막 단계 추가 추가 복잡성8각 콜론 원자로에 통합할 수 있습니다. 이 지역와 개별적으로 분석 하 고 비교할 수 있는 위상 특정 미생물 커뮤니티의 개발에 결과. 시스템의 이러한 유형의 수 있습니다 쉽게 조작할 수, 물리적 재구성, pH, 온도, 또는 운송 시간, 같은 생리 적 매개 변수 변경 통해 실험적인 디자인에 따라 또는 특정 지저분한 접종 샘플26 . 중요 한 것은, 연구는 이러한 생체 시스템에서 개발 하는 지역 사회 대표 창 자 미생물 커뮤니티11,,2634설명 했습니다.
다단 생체 외에서 체계를 사용 하 여 mechanistically 본질적인 microbiota 공부를 사용할 수 있는, 그들은 제한 하지 않아도 됩니다. 첫째, 생리 적 조건이 프로그래밍 가능, 하는 동안 그들은 따라서 일반 사람을 나타내는 특정 평균 값을 사용 하 여 고정 됩니다. 이것은 상당한 간 개별 variatiability12,23이므로 단순화 이다. 둘째, 포유류 부품의 부족 한 생체 외에서 시스템을 사용 하는 이유 중 하나 이지만, 그것은 또한 고려 되어야 한다 제한. 면역 시스템 같은 포유류 특정 부품의 부족 체 외 모델 및 해당 vivo에서 microenvironment12,23사이의 차이에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 이러한 제한 값과 mechanistically 본질적인 microbiota 공부를 생체 외에서 시스템을 사용 하 여 얻을 수 있는 통찰력에서 손상 하지 않습니다. 마지막으로, 문화는 물 또는 대사 산물의 흡수 없음와 유리 bioreactors에서 성장 된다. 이것은 중요 한 차이, 그리고 SCFAs SCFAs의 총 금액은 오름차순 내림차순으로 콜론 지역 (그림 7) 가로에서 증가 하는의 측정에서 효과 볼 수 있습니다. 이것은 반대로 vivo, 어디 SCFAs의 높은 농도 proximally, 상승 지역에서 있고 최저 농도 distally36에서 관찰의. 그러나, SCFAs의 순 생산은 각 지역에 대 한 것으로 간주, 다음 그것은 확인할 수 있습니다 대부분 SCFA 생산 오름차순 콜론에서 발생. 그것은 또한 언급 되어야 여기 그 세균 로드 하지이 실험에서 측정 되었다. 이 시스템에서 영역 세균성 부하 차이 SCFAs 생산의 총 금액에 영향을 있을 수 있습니다.
결론적으로, 그것은 잘 알려진 인간의 건강과 질병에 있는 역할을 담당 하는 본질적인 microbiota을 다이어트와 신진 대사 건강37,38사이 중개자로 작동으로 간주 됩니다. 여기, 본질적인 microbiota을 공부 하는 체 외에서 시스템의 응용 프로그램을 논의 하 고 안정적인 커뮤니티의 발전을 보여주는 실험 결과가 발표 됐다. 생체 외에서 시스템에는 많은 이점이 있다 고 설명된 실험에 설명 된 복잡 하 고 역동적인 커뮤니티의 발전을 촉진. 시스템의이 유형은 가장 본질적인 microbiota 지역 사회 내에서 식품 구성 요소와 의약품 등 외부 요인에 대 한 응답에서 변화와 상호 작용을 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 생체 외에서 연구의 결과 다음 함수에 대 한 깊은 이해 및 건강 및 질병에 본질적인 microbiota의 vivo에서 연구와 함께 보완할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다. 상호 또는이 간행물에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.
Acknowledgments
양 오드리 토마스 Gahring 그녀의 GC/MS 작동에 대 한 인정 이다. 우리 또한 마시모 Marzorati 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
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