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Engineering

Assemblage des navettes moléculaires propulsés par réversiblement attaché kinésines

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons un protocole pour construire des navettes moléculaires, où les protéines motrices kinésine adhère à la surface de propulsent marqué au colorant de microtubules. Les interactions faibles des kinésines avec la surface permet leur fixation réversible pour elle. Cela crée un système d’échelle nanométrique qui présente l’assembly dynamique et le démontage de ses composants tout en conservant sa fonctionnalité.

Abstract

Ce protocole décrit comment créer des navettes moléculaires kinésine-propulsé avec un attachement faible et réversible de la kinésines à la surface. Contrairement aux précédents protocoles, dans ce système, les microtubules recrutent des protéines motrices kinésine de solution et placent sur une surface. Les kinésines, à son tour, facilite le glissement des microtubules le long de la surface avant de désorption dans la solution en vrac, ce qui en fait disponible à recruter à nouveau. Cette Assemblée permanente et le démontage conduit à la substitution, comportement dynamique du système, tels que la formation de kinésine temporaire pistes de glisse des microtubules.

Plusieurs méthodes expérimentales seront décrites tout au long de cette expérience : spectrophotométrie UV-visible servira à déterminer la concentration des solutions mères de réactifs, lamelles couvre-objet sera tout d’abord l’ozone et aux ultraviolets (UV) traités puis silanisée avant d’être monté dans les cellules de flux et la fluorescence de la réflexion totale interne microscopie (FRBR) servira d’image simultanément la kinésine moteurs et les filaments de microtubules.

Introduction

Les interactions qui régissent le comportement des nanosystèmes active ont toujours été caractérisées par des liaisons longue, presque irréversible1,2,3,4,5,6 ,7,8. Un exemple bien étudié est le système de microtubules-kinésine, où glisse microtubules sont propulsés par la kinésine irréversiblement surface-bondissent moteurs1,2,3,4, 5. Les systèmes dont les composants sont réversible reliés entre eux ont été étudié théoriquement9,10 et réalisés à l’échelle macroscopique11,12, mais la mise à l’échelle de ces systèmes vers le bas pour la Nanoscale a été difficile. Une des principales raisons pour cela est que rupture et réformer les liaisons entre les composants souvent nécessite un grand changement dans les conditions environnementales. Même si ces changements ont eu lieu dans le passé13,14,15, ils ferait appel à modifier le système lui-même plutôt que de les adapter à son environnement. Conception de systèmes d’échelle moléculaire dans lequel composants continuellement assemblent et réorganiser les structures sans perturber l’environnement global dans lequel les expériences se déroulent ouvrira la porte à l’exploration d’un large éventail de comportements dynamiques 16 , 17.

Nous décrivons ici et démontrer le protocole détaillé pour créer une dynamique montage et démontage système fonctionnant à l’échelle nanométrique. Le système et son comportement général a été introduite plus tôt18: filaments de microtubules sont propulsés par des voies ferrées de façon réversible de surface-bondissent kinésine-1 moteurs. Ces protéines motrices kinésine sont recrutés dans la solution pour aider à propulser vers l’avant, les microtubules avant désorption à nouveau peu de temps après. Une fois en solution, ils peuvent être recrutées à nouveau pour propulser un microtubule nouvel. Dans le passé de13,14,15, la rupture et réforme des liaisons nécessaires modifications environnementales ; en revanche, l’environnement de notre cellule de flux reste inchangée, alors que les moteurs de la kinésine interagissent avec la surface.

Ce protocole aidera les chercheurs intéressés à (1) visualiser toutes les étapes du protocole et (2) aider avec ce type de dosage de dépannage. Il s’inspire des procédures décrites dans Howard et al. 199319.

Protocol

1. préparation de la solution

Attention : Trois des réactifs utilisés dans le présent protocole (toluène, diméthyldichlorosilane et le dithiothréitol) sont très toxiques. S’il vous plaît consulter les pertinente fiches signalétiques (FS) avant utilisation. Par ailleurs, certaines parties de ce protocole doivent être assujettis à un niveau plus élevé de protection, portant des lunettes de sécurité et deux paires de gants de protection comme indiqué. Sauf avis contraire, les expériences peuvent être réalisées sur des bancs de laboratoire en utilisant tous le personnel équipement de protection approprié (lunettes, gants, blouse, pleine longueur pantalons et chaussures fermées).

Remarque : Les concentrations de l’ATP, la kinésine et microtubules qui sont utilisés dans le présent protocole peuvent être modifiées compte tenu des besoins de chaque expérience. Toutefois, si modifié, veuillez vous assurer que les concentrations finales des autres réactifs restent le même comme indiqué ci-dessous. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante, (~ 25 ° C).

  1. Préparation des solutions mères
    NOTE : Préparer et aliquote les solutions suivantes au préalable. Toutes les parties aliquotes peuvent être préparés à la température ambiante (environ 25 ° C).
    1. BRB80 tampon
      Remarque : La mémoire tampon pour la plupart des solutions utilisées dans le présent protocole est BRB80. BRB80 peut être préparé en grande quantité et stocké dans un congélateur à-20 ° C.
      1. Dissoudre 24,2 g de pipérazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (tuyaux) et 3,1 g d’hydroxyde de potassium (KOH) dans 800 mL d’eau désionisée faire 800 mL de tuyaux de 100 mM. Ajouter 100 mL 10 mM chlorure de magnésium (MgCl2) et 100 mL d’acide tétraacétique de 10 mM l’éthylène glycol (EGTA) pour obtenir un volume final de 1 L. Elévation du pH à 8 avec l’hydroxyde de potassium (KOH) peut aider à la dissolution des tuyaux et l’EGTA.
        Remarque : Les concentrations finales des produits chimiques dans le tampon de BRB80 sont des tuyaux de 80 mM, 1 mM MgCl2et 1 mM EGTA.
      2. Ajuster le pH de la mémoire tampon à 6,9 à l’aide de KOH et acide chlorhydrique (HCl).
    2. ATP
      1. Préparer une solution de 1 mL de 100 mM ATP dans l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-80 ° C.
    3. GTP
      1. Préparer une solution de 500 μL de 25 mM GTP dans de l’eau ultrapure. Pipette de la solution en 5 aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-80 ° C.
    4. MgCl2
      1. Préparer une solution de 1 mL de 100 mM MgCl2 dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    5. Caséine
      1. Peser 1 g de caséine sèche et transférez-le dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Ajouter 35 mL de tampon de BRB80 dans le tube pour dissoudre la poudre de caséine.
      2. Placer la solution dans un verre dans une chambre froide pour dissoudre toute la nuit. À ce stade, la solution se penchera épais et visqueux.
      3. Maintenir le tube verticalement dans un réfrigérateur de 4 ° C pour permettre toute grosses touffes non dissous à régler. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
      4. Tourner le tube dans une centrifugeuse à 1 000 x g pour granuler des précipités plus. Une fois de plus, transférer le surnageant dans un nouveau tube.
      5. À plusieurs reprises, filtrer la solution à l’aide de 0,2 μm (7 bar pression maximale) filtres. La solution étant épais, beaucoup de filtres se colmatera, alors Répétez cette étape jusqu'à ce que le filtre soit clair et débarrassé.
      6. Déterminer la concentration de caséine dans la solution obtenue à l’aide de spectrophotométrie UV/visible, à l’aide du coefficient d’extinction de caséine de 19 mM-1∙cm-1 à 280 nm20. En supposant que le poids moléculaire 23 kDa pour la caséine, diluer la solution à une concentration de 20 mg∙mL-1 dans BRB80.
      7. Pipette de la solution en 20 parties aliquotes μL et stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    6. D-Glucose
      1. Préparer une solution de 1 mL de 2 M de D-glucose dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    7. Glucose oxydase
      1. Préparer une solution de 1 mL de 20 mg∙mL-1 glucose oxydase dans BRB80. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    8. Catalase
      1. Préparer une solution de 1 mL de 0,8 catalase-1 de mg∙mL en BRB80. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    9. Dithiothréitol (DTT)
      Remarque : Étant donné que TNT est légèrement volatil et toxique, s’il vous plaît effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante.
      1. Préparer une solution de 1 mL de 1 M DTT dilué dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    10. Paclitaxel
      1. Préparer une solution de 1 mL de 1 mM de paclitaxel diluée dans le DMSO. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    11. Le diméthylsulfoxyde (DMSO)
      Remarque : Le DMSO utilisé dans ces expériences est pur.
      1. Pipette 1 mL de DMSO pur en 10 aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    12. Créatine phosphate
      1. Préparer un 1 mL de solution de phosphate de créatine 0,2 M dans l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    13. Créatine phosphokinase
      1. Préparer une solution de 1 mL de 200 units· L-1 créatine phosphokinase dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C.
    14. Sulfate de nickel (II)
      1. Préparer 500 mL d’une solution de sulfate de nickel (II) de 50 mM dans de l’eau ultrapure. Conserver la solution à température ambiante (environ 25 ° C).
    15. Poly(ethylene glycol)-bloc-poly(propylene glycol)-bloc-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) solution
      1. Peser 2 mg de PEG-PPG-PEG (masse moléculaire moyenne en nombre : 14 600 g∙mol-1)-poudre NTA sur papier de pesage. PEG-PPG-PEG-NTA est le copolymère tribloc fonctionnalisé avec un groupe de (NTA) acide nitrilotriacétique. Se référer à la Table des matières pour plus de détails sur le PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Transférer la poudre dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de la solution mère de sulfate de nickel (II) dans le tube. Vortex jusqu'à ce que la poudre se dissout et aucun touffes visibles demeurent.
      3. Magasin pour jusqu'à un mois à température ambiante.
  2. Avant de commencer une expérience
    1. Remplissez un seau de glace.
    2. Prendre une partie aliquote provenant de chacune des 13 réactifs décrites aux points 1.1.1 à 1.1.13 au-dessus et ajoutez-les dans le seau, les gardant ainsi sur la glace. Décongeler à chacun des réactifs avant utilisation.
  3. Préparation de microtubules
    Remarque : Les Microtubules étaient polymérisés d’une portion de 20 μg de tubuline lyophilisée marqués au colorant. La longueur d’onde d’excitation du colorant est de 647 nm.
    1. Préparation de la mémoire tampon la croissance microtubule
      1. Pipette 21,8 μL de tampon de BRB80 dans une microcentrifugeuse petite (0,6 mL) tube. Ajouter 1 μL de la solution mère de MgCl2 1 μL de la solution mère de GTP et 1,2 μL de la solution mère de DMSO.
        Remarque : Ainsi, les concentrations finales des réactifs dans le tampon de BRB80 sont 4 mM MgCl2, 1 mM GTP et diméthylsulfoxyde 5 % (v/v).
    2. Polymérisation des microtubules
      1. Ajouter 6,25 μL de tampon de croissance de microtubules directement dans une portion de 20 μg de tubuline lyophilisée étiquetée. Vortex l’aliquote de 5 s à 30 rps.
      2. Refroidir l’aliquote sur glace pendant 5 min avant l’incubation à 37 ° C pendant 45 min et passez à la section 1.3.3.
    3. Stabilisation des microtubules
      1. Ajouter 5 μl de solution aliquotés de paclitaxel à 490 μL de tampon de BRB80. Vortex la solution pendant 10 s à 30 rps.
      2. Une fois le 45 min d’incubation pour les microtubules sont en hausse, ajouter 5 μl de solution polymérisé microtubules à la solution BRB80/paclitaxel.
        NOTE : Cette solution de 100 fois les microtubules dilué, stabilisé, va être dénommée MT100. Il peut être utilisé jusqu'à 5 jours, et elle peut être diluée pour obtenir la densité voulue des microtubules pour chaque expérience.
  4. Solution de mobilité
    1. ATP, ATP à régénération et antifade enzymatique
      1. Ajouter 9,0 μL de la solution de la caséine aliquotés à 291 μL de tampon de BRB80.
      2. Si la concentration d’ATP désirée pour l’expérience est inférieure à 1 mM, pipette 83 μL de la solution BRB80/caséine dans un nouveau tube de microcentrifuge de 0,6 mL. Sinon, pipette 85 μL de la solution dans un nouveau tube de microcentrifuge de 0,6 mL.
      3. Ajouter 1 μL de D-glucose, 1 μL de glucose oxydase, 1 μL de catalase et 1 μL de DTT dans ce tube.
        NOTE : Ces produits chimiques constituent une enzymatique antifade cocktail21 qui réduiront le Photoblanchiment en enlevant dissous radicaux réactifs de l’oxygène et de trempe. Cela réduit la désintégration photobleaching et microtubules provoquée par l’illumination de l’excitation en fluorescence imaging22,23.
      4. Pour des expériences dans lesquelles la concentration d’ATP est choisie pour être sensiblement inférieur à 1 mM, ajouter les réactifs suivants à la solution pour créer un système qui se régénèrent ATP : 1 μL de la solution de phosphate de créatine aliquotés et 1 μL de la créatine aliquotée solution de phosphokinase.
      5. Ajoutez 1 μL de la solution mère de l’ATP à la solution de mobilité. Flick ou vortex l’aliquote de façon homogène distribuer les produits chimiques.
        Remarque : Ainsi, la concentration finale de produits chimiques dans la solution sont 10 μM paclitaxel, 0,5 µg·ml−1 caséine, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL−1 glucose oxydase, 8 μg·mL−1 catalase, dithiothréitol 10 mM, 2 mM Créatine phosphate (si ajouté), 2 units· L−1 créatine phosphokinase (si ajouté) et 1 mM d’ATP. Cette solution sera ci-après dénommée la solution de mobilité.
    2. Kinésine
      Remarque : La solution de kinésine stock utilisée dans ces expériences est préparée par G. Bachand au centre for Integrated Nanotechnologies à Sandia National Laboratories et mises à disposition sous un contrat d’utilisateur (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). le tampon utilisé ici compose de l’imidazole de 40 mM, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· Saccharose-1 L et 0,2 mM PTCE μM 50 Mg-ATP. Pour cette série d’expériences, la construction de la kinésine rkin430eGFP a été utilisée. Il s’agit d’une kinésine composé des 430 premiers acides aminés de la chaîne lourde de rat kinésine fusionnée à eGFP et une balise son C-terminal du domaine de queue24. Il a été exprimé chez Escherichia coli et purifiée en utilisant une colonne Ni−NTA. La concentration de la solution mère de GFP-kinésine est 1,8 ± 0,3 μM, telle que déterminée par spectrophotométrie UV/visible, en utilisant un coefficient d’extinction pour GFP de 55 mM-1·cm-1 489 nm25, et compte tenu que la kinésine est un dimère.
      1. Déterminer la densité de concentration ou de la surface de kinésine désiré pour l’expérience. Pour les tests typiques, cette concentration est de 20 nM. Si la concentration de kinésine doit être dilué plus d’un centuple, le diluer dans une solution de BRB80 contenant 0.5 µg·ml-1 de la caséine.
      2. Ajouter 1 µL de solution de kinésine à la solution de mobilité afin d’obtenir une concentration finale d’environ 20 nM.
    3. Microtubules
      1. Ajouter 10 μL de la solution de MT100 préparée à la section 1.3 de la solution de mobilité.
        NOTE : Cette solution de mobilité peut être utilisée jusqu'à 3 heures. Passé ce délai, le système antifade perd de son efficacité car le glucose dans la solution est appauvri par la réaction enzymatique.

2. assembler les cellules d’écoulement

  1. Les lamelles de lavage
    1. Pour les cellules du flux, utilisez une grande lamelle (dimension : 60 x 25 mm) et un petit (dimensions : 22 x 22 mm)19.
    2. Rincez toutes les lamelles couvre-objet deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec l’eau ultrapure. Laisser agir les lamelles dans de l’eau ultrapure pour 5 min. faites-les sécher dans une étuve à une température de 50 à 75 ° C.
    3. En utilisant un UV/ozone nettoyant (voir Table des matières et des instructions du fabricant), traiter un côté de chaque lamelle pendant 15 min. Effectuez cette étape peut, à la température ambiante (environ 25 ° C) et dans des conditions atmosphériques normales (pression de 1 atm).
    4. Tourner délicatement chaque lamelle couvre-objet de l’autre côté (à l’aide de la pince à épiler) et UV/ozone traiter ce côté aussi bien.
    5. Laisser agir les lamelles dans de l’eau ultrapure à nouveau pendant 5 minutes avant d’essuyer à nouveau dans le four à une température de 50 à 75 ° C.
  2. Traiter les lamelles couvre-objet pour activer la couche PEG-PPG-PEG
    Remarque : Le diméthyldichlorosilane et le toluène utilisé dans cette partie du protocole étant hautement toxique, effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante, tout en prenant les précautions suivantes : porter deux séries de gants de protection et une chemise à manches longues sous leur laboratoire manteau. Rentrez les bords des gants à l’intérieur des manches de la chemise pour qu’aucun la peau de l’avant-bras n’est directement exposée aux produits chimiques dans le cas d’un déversement. Porter des lunettes de protection.
    1. Diluer 25 mL de pur diméthyldichlorosilane dans 475 mL de toluène. Plongez chaque lamelle couvre-objet dans la solution de diméthyldichlorosilane et toluène pendant 15 secondes.
    2. Laver les lamelles deux fois dans le toluène et trois fois dans le méthanol. Sécher les lamelles à l’aide d’azote sous pression.
  3. Assemblage des lamelles couvre-objet en cellules d’écoulement
    1. Une fois que les lamelles soient secs, coupez un morceau de 2 cm x 2,5 cm de ruban adhésif double-face verticalement en bandes de deux 1 x 2,5 cm.
    2. Mettre la grande lamelle sur un essuie-glace de tâche délicate et coller les bandes de ruban adhésif sur la longueur le long des bords de la lamelle couvre-objet pour créer une zone de 1 cm x 2,5 cm entre les morceaux de ruban.
    3. Coller la petite lamelle sur le dessus les bandes de ruban adhésif pour terminer l’ensemble de cellule de flux.

3. couler les solutions dans une cellule d’écoulement

  1. Approximativement 20 μL de la solution de PEG-PPG-PEG se jettent dans la cellule de flux assemblé. Le volume qui est embarqué dans la cellule doit être assez grand pour remplir la chambre. Dans les étapes suivantes, utilisez le même volume en échangeant les solutions.
  2. Permettre la solution PEG-PPG-PEG absorber sur la surface pendant 5 minutes. Échanger la solution PEG-PPG-PEG avec le tampon BRB80 3 fois en coulant le tampon dans. La solution de mobilité se jettent dans la cellule de flux.
  3. Sceller les bords de la cellule de flux avec de la graisse pour éviter une évaporation si l’expérience prévue est plu d’une heure.
    Remarque : La cellule de flux est maintenant prête à être photographié.

4. imagerie de cellules de circulation

  1. Effectuer l’imagerie en utilisant une configuration de fluorescence (FRBR) objectif de type réflexion totale interne pour les microtubules et les moteurs de la kinésine (voir Table des matières).
    NOTE : Ici, nous avons utilisé un microscope avec un x 100 / 1,49 objectif ouverture numérique, à l’aide de deux lasers, avec une longueur d’onde de 642 nm et une puissance maximale de 140 mW et l’autre avec la longueur d’onde de 488 nm et une puissance maximale de 150 mW.
  2. Déposez une goutte d’huile à immersion sur l’objectif.
  3. Placer la cellule de flux sur la plateforme microscope et amener l’objectif jusqu'à ce qu’il y a contact entre l’huile sur l’objectif et la cellule de flux.
  4. Système de couverture pour le verrouillage du microscope permet de bloquer tous les laser lumière de s’échapper.
  5. Allumer l’appareil et se concentrer sur la surface inférieure de la cellule de flux. Les microtubules sont fluorescent étiquetés et excitées à une longueur d’onde de 647 nm. Ils sont projetés à l’aide d’un laser à 642 nm alors qu’un laser à 488 nm est utilisé pour les moteurs de GFP-kinésine.
  6. Enregistrer les images ou les vidéos d’intérêt. En général, la puissance du laser est d’environ 30 mW et un temps d’exposition de 50 ms pour les deux canaux au laser. Images peuvent être enregistrées pour tant qu’il y a la motilité dans la cellule de flux.
    Remarque : L’illumination laser est-il dangereux pour le œil nu et peut causer des dommages irréparables. Veuillez vous assurer que la surface éclairée est entièrement recouvert d’un couvercle opaque.

Representative Results

Dans ces expériences, nous avons utilisé un 1 000 fois la dilution des microtubules préparé dans la section 1.3.2. La concentration de kinésine était de 20 nM et la concentration d’ATP était de 1 mM. L’imagerie a été réalisée au microscope TIRF. Microtubules du vol à voile ont été séparément imagés des kinésine motors : microtubules étaient visibles lors d’excitation avec un 647 nm laser (Figure 1, rouge), et la kinésine-GFP était visible lorsqu’il est excité avec un laser à 488 nm (Figure 1, vert). Le temps entre l’excitation avec la lumière rouge et verte a été inférieur à 1 s. Le temps entre les cadres était que 10 s. Microtubules affichent glissement stable. Les microtubules moyenne vitesse de glissement a été approximativement 800 nm/s. La densité de surface de microtubules était 400 mm-2. Les titres de kinésine (verte) semblaient s’étendre au-delà de l’extrémité arrière des microtubules (rouges) pour plusieurs micromètres.

Figure 1
Figure 1 : Gliding microtubules propulsés par des moteurs faiblement lié aux surface kinésine. Comme les microtubules aller de l’avant, ils s’accumulent kinésine moteurs de solution. Ces moteurs alternent entre deux États : single-liées à des microtubules et double à la fois les microtubules et la surface. Lorsqu’un double moteur lié atteint la fin de la microtubule, le moteur est laissé pour compte et désorbe lentement à la surface avec un taux d’arrêt d’environ 0,1 s-1. En conséquence, sentiers de kinésine moteurs restent derrière les microtubules. Rangée du haut : canal rouge (microtubules). Rangée du milieu : canal vert (kinésine). Rangée du bas : combiné rouge (microtubules) et verte (GFP-kinésine) canal. Barre d’échelle : 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans ce travail, nous présentons un système actif échelle nanométrique qui auto assemble faiblement contraignant les blocs de construction pour construire sa propre voie. Comme illustré à la Figure 1, glisse microtubules s’accumulent kinésine moteurs de solution et les déposer sur la surface. Les moteurs de la kinésine restent dans le sillage de la microtubule pendant une courte période de temps avant de revenir à la solution. Ainsi, dans cette expérience, la kinésine moteurs remplaçant entre 3 États :

(1) un état de simple lié aux microtubules : C’est quand une kinésine lie d’abord à un microtubule. Il existe en équilibre avec l’état (2).

(2) un état de la double liaison : dans ce cas, une microtubule simple liaison kinésine lie également à la surface via son His-tag. Cet état de la double liaison permet pour la propulsion de microtubules.

(3) un état de surface-bondissent unique : une double liaison la kinésine qui défile à l’extrémité de la microtubules et n’a pas encore désorbé de la surface est dans cet état. Ces moteurs peuvent être observés dans la Figure 1 (canaux combinés et vert) : ils s’étendent derrière la queue de la microtubule pour plusieurs micromètres et former son cortège décroissante.

L’étape la plus critique du présent protocole est la formation de la surface hydrophobe sur la diapositive. Non seulement faut-il utiliser des produits chimiques dangereux, mais il permet également le PEG-PPG-PEG fonctionnalisé avec le groupe NTA pour enduire la surface, ce qui permet ensuite la kinésine réversiblement lier à la surface. Une autre étape importante est la cellule de flux d’étanchéité avec de la graisse. Cela permet une imagerie prolongée sans le liquide contenu dans la cellule débit d’évaporation.

Les principales modifications à cette technique consistent en des variations de concentration de microtubules, concentration de kinésine et concentration d’ATP. Changement de concentration microtubule va changer le nombre de microtubules glisse sur la surface. Modification de kinésine concentration modifiera le nombre de molécules de kinésine qui peuvent se lier à des microtubules. Cependant, l’augmentation de la concentration de kinésine au-dessus des montants déjà définis dans cette expérience pourrait augmenter fluorescence de fond, rendant plus difficile de voir les sentiers de la kinésine laissés glisser des microtubules. Pendant ce temps, l’abaissement des concentrations d’ATP inférieures à 10 µM diminuera significativement microtubule glisse vitesse. Si cet effet est souhaité, il est nécessaire d’utiliser un ATP à régénération consistant en industrie de la construction et de la phosphatase de la créatine phosphokinase.

Une possibilité de limiter cette technique est que, en raison du contenu de grande kinésine active du système, l’ATP peut être consommé rapidement et expériences peuvent durer moins d’une heure dans certaines conditions. Par exemple, ce serait le cas si on a utilisé une double concentration kinésine et concentration microtubule cinq fois supérieure à ce qui est présenté dans le présent protocole.

Dans nos précédents travaux18, nous avons étudié la distribution spatiale des moteurs de la kinésine le long des microtubules, prouvant que les microtubules glisse s’accumulent kinésine moteurs de solution, résultant en une augmentation de la densité des moteurs sur toute la longueur de la microtubule. Nous avons également constaté que la stabilité de vol à voile des microtubules démontré une dépendance non linéaire sur la vitesse de concentration et les microtubules de kinésine solution.

Le protocole présenté ouvre la voie à une utilisation plus efficace des moteurs de la protéine dans les systèmes nanométriques conçu et pour complément d’enquête dans la conception des nanosystèmes active qui sont en équilibre dynamique. En outre, le caractère dynamique de ce système lui permet de servir comme système modèle pour l’étude d’autoguérison et dynamique le remplacement d’éléments moléculaires, partie de l’écart entre les structures naturelles et ingénieries de la fermeture.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le soutien financier au titre de la subvention de NSF NSF-DMR 1807514. Les auteurs remercient G. Bachand et V. Vandelinder pour fournir la protéine GFP-la kinésine. Ce travail a été réalisé, en partie, au Center for Integrated Nanotechnologies, un bureau de Science utilisateur installation exploitée pour le bureau de la Science nous Department of Energy (DOE) par le laboratoire National de Los Alamos (contrat no. DE-AC52-06NA25396) et Sandia National Laboratories (con-tract n° 97 DE-AC04-94AL85000). Les auteurs remercient Dr Jennifer Neff et vasculaires AllVivo pour leur don de PEG-PPG-PEG fonctionnalisé avec NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

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References

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Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

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