Summary
מחקר זה מפרט את תהליך gavaging כמויות מדויקות של פרוביוטיקה לעכברים neonatal. הסידור ניסיוני אופטימלי כדי לכלול, אך אינה מוגבלת פרוביוטיקה מינון, שיטות ניהול, כימות של חיידקים במעיים.
Abstract
מודלים העכבר למבוגרים היה בשימוש נרחב כדי להבין את המנגנון מאחורי התקדמות המחלה אצל בני אדם. תחולתה של מחקרים במודלים של העכבר למבוגרים מחלות neonatal הוא מוגבל. כדי להבין טוב יותר את התקדמות המחלה, המארח תגובות וההשפעה לטווח ארוך של התערבויות בתחום neonates, מודל העכבר neonatal סביר היא התאמה טובה יותר. השימוש העכבר neonatal מודלים דליל בחלקו ניתן לייחס את בעיות טכניות של עבודה עם חיות קטנות אלה. דגם העכבר neonatal פותחה כדי לקבוע את ההשפעות של פרוביוטיקה המינהל בחיים מוקדם, במיוחד להעריך את היכולת להקים מושבת העיכול העכבר היילוד. באופן ספציפי, כדי להעריך פרוביוטיקה קולוניזציה העכבר neonatal, לקטובצילוס plantarum (LP) נמסרה ישירות לתוך מערכת העיכול העכבר neonatal. לשם כך, LP היה מנוהל לעכברים מאכילים דרך הוושט-"אינטרה" gavage (IE). שיטה ישימה במיוחד פותחה כדי לתקנן את התהליך של IE gavage המאפשר ניהול מדויק של פרוביוטיקה במינונים תוך מזעור טראומה, היבט חשוב במיוחד בהתחשב השבריריות של עכברים היילוד. מגבלות של תהליך זה כולל אפשרויות של גירוי הוושט או נזק ואת השאיפה אם gavaged באופן שגוי. גישה זו מייצג שיפור על נוהלי הנוכחי כי IE gavage לתוך הוושט דיסטלי ומצמצמת את השאיפה. בעקבות gavage, לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה היה לעקוב אחריו באמצעות כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA שחולץ מעיים עם תחל ספציפי LP. הגדרות המלטה שונים וטכניקות ניהול כלוב שימשו כדי להעריך את פוטנציאל קולוניזציה הכפולה. הפרוטוקול מפרט המורכבות של IE העכבר neonatal gavage ו קולוניזציה עוקבות כימות עם LP.
Introduction
אצל תינוקות, שחשיפה מוקדמת פרוביוטיקה היה קשור עם אפקטים immunomodulatory שמוביל שכיחות מופחתת של מחלות כמו שדעתו enterocolitis, דלקת עור אטופית, אלח דם1,2,3, 4 , 5. עם זאת, המנגנון מאחורי תגובה immunomodulatory זו הוא מאתגר לחקור נתון המגבלה דגימה בניסויים בבני אדם הנולד (קרי, לקחת דם סדרתית, ביופסיות). מודלים neonatal העכבר יכול לעזור ללמוד מנגנון הפעולה המעורבים בוויסות המערכת החיסונית neonatal המשויך פרוביוטיקה לשימוש ושינויים microbiota מעיים. למרבה הצער, רוב הדגמים העכבר עבור מוצרי פרוביוטיקה התמקדו בעיקר על עכברים בוגרים; עם זאת, ההשפעה של פרוביוטיקה סביר להיות הגבוה ביותר בשלב מוקדם בחיים, מציע דגמים ספציפיים עבור קבוצת גיל זו תהיה שימושית3,6. בנוסף, העכבר neonatal מודלים מתאימים יותר ללמוד מחלות והתערבויות מיועדת עבור יישום בחיים מוקדם של תינוקות אנושיים הם צפויים לחקות באופן הדוק יותר בפיתוח מערכת החיסון ומערכת מיקרוביאלי7,8 9, ,10. המטרה הייתה לבחון במידה ואת דפוסי פרוביוטיקה מושבת עכברים neonatal עם דגש על האינטראקציה מכניסטית בין המארח לבין microbiome שלה. לא נמצאו מתאימים תיאורים של היילוד דגמים בספרות, ובכך צורך לפיתוח שיטה סטנדרטית ועמיד היה מיועד.
שיטות הוקמה מינהל אוראלי של תרכובות שונות לעכברים היילוד כוללות העברת אימהי של תרכובות הרצויה דרך חלב בטיפול מקור המים סכרים בהריון11 או באמצעות מחטים האכלה כדי להקל על הניהול של תרכובות הרצוי לתוך oropharynx12. שיטות אלה שימושיים עבור ניסויים שאין להן דרישות מינון מדויק, איפה הטיפול ברצון בליעתו על ידי העכבר הנמען. פרוביוטיקה ניתנת לעתים קרובות בשילוב עם prebiotic כגון galactooligosaccharide ו- fructooligosaccharide (פוס) המשמשים כמקור תזונה עבור חיידקים פרוביוטיים; תרכובות אלו מוספים להפוך את הפתרון צמיגה ומאתגר לנהל באמצעות למתודולוגיות הנ. להמציא שיטה לנהל כמויות מדויקות של פרוביוטיקה ו prebiotics עכברים היילוד מתחיל מוקדם היום הראשון של החיים (בארבי כוכ) שהיו נחוצות. פיתוח הטכניקה gavage, האפשרות של מושבת-התפשטות (כפי שנצפה במחקרים אחרים פרוביוטיקה בין הטיפול את בקרת נשק13,14,15,16) נבדקה שפע יחסי של להפקר plantarum לקטובצילוס (LP) במעיים של הגורים עם לוחות זמנים שונים gavage היה להעריך. הכנת פרוביוטיקה המשמשים את הניסויים כללה 109 המושבה יוצרי יחידות (CFU) לכל gavage של LP (בקרת האוויר-202195 זן), מעורבב עם פוס (prebiotic), מלטודקסטרין (excipient) כפי שמתואר הניסיון האנושי3האחרונים. המשלוח פרוביוטיקה הושג באמצעות IE gavage, התהליך זה מפורט להלן בפרוטוקול. לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה הוערך באמצעות הגברה בזמן אמת של DNA שחולצו מן המעיים שלם באמצעות תחל ספציפי LP.
Protocol
כל ההליכים בוצעו הנוגעים ההנחיות שנקבעו על-ידי צוות התמיכה יחידת הטיפול ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה החיה, כל ההליכים אושרו על ידי ועדת אכפת UBC חיה.
1. כימות של פרוביוטיקה מנוהל
הערה: השלב זה מומלץ לקבוע את הכמות המדויקת של פרוביוטיקה CFU זה יכולה להינתן מנה אחת. הכמות של פרוביוטיקה, הרכב (פוס, מלטודקסטרין) לקבוע את התנאים הרוויה של הפתרון. מניסיון, לא יותר מ 30 µL (~ 20 מ לכל ק ג) של נוזל יכול להינתן לעכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום כמו כל אמצעי אחסון גדול יותר מגביר את הסיכון של השאיפה.
- להכין 6 צינורות microcentrifuge 1.5 mL דילולים סדרתי עם כל שפופרת המכילה µL 180 תמיסת דקסטרוז 5% סטרילי.
- שוקלים aliquot 0.2 גרם תערובת פרוביוטיקה-prebiotic להמיס ב 1 מ"ל תמיסת דקסטרוז 5% באופן סטרילי.
- מערבולת 30 שניות, פיפטה לפרוץ גושים. חזור עד אין גושים גלויים מובחנות.
הערה: מלטודקסטרין הופך את הפתרון צמיגה ולתרום פתרון רוויה. - מבצע לדילול סדרתי באמצעות צינורות המוכנים בשלב 1.1. מערבולת לערבב.
- צלחת µL 40 של כל דילול אל רביע עם תוויות ברורות של צלחת אגר גברת. צלחת כל דילול ב כפילויות.
- דגירה תחת אנאירובית (או microaerophilic) תנאים ב 37 מעלות צלזיוס 48 שעות בתוך צנצנת ואקום באמצעות ערכת גז.
- לספור כל צלחת בטווח של 20-70 מושבות לכל רביע. צלחת הממוצע נחשב עם הדילול באותו ולחשב בחזרה אל היחידות הרצוי.
2. הכנה של פרוביוטיקה ו prebiotics gavage
הערה: פירוק תקין של פרוביוטיקה, prebiotic יש צורך להבטיח את הזריקה חלקה של נוזל דרך המחט האכלה במהלך gavage.
- משלבים את הכמות הנדרשת של האורגניזם פרוביוטיקה lyophilized הסכום הרצוי של prebiotics ואת הרכב צינור microcentrifuge סטרילי.
- להוסיף כמויות מתאימות של הממס (תמיסת דקסטרוז 5%) כדי להמיס את התערובת פרוביוטיקה-prebiotic.
הערה: הקיבולת של התפרקות היא מוגבלת על ידי prebiotic ואת הרכב בשימוש. מניסיון, הצירוף synbiotic (עם פוס, מלטודקסטרין) להגיע הרוויה כ 0.3 g/mL, תוך המסת צינור microcentrifuge 2 mL באמצעות 1 מ"ל של הממס. - מערבולת לערבב עד מוצקים כל הם התפרקה. השתמש pipet כדי לשבור את צבע של חלקיקי המוצק של הממס על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
- דגירה הפתרון באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
הערה: שלב זה יכול להיות דילג אם הפתרון פרוביוטיקה-prebiotic נוצר מתרבות בשידור חי. - צלחת סדרה 5 דילול 10-fold על פלטות אגר גברת לפני gavage לכמת במדויק את פרוביוטיקה מנוהל על הגורים. שלב זה יכול יבוצע אם הרוזן CFU מדויק לא נחוצה.
3. הכנת אבטחה בארון
- השתמש ארון אבטחה בעת עבודה עם פרוביוטיקה כדי לשמור על הטכניקה aseptic. הגדר את הכלוב עם סכרים ואת הגורים על שמיכת חימום (מוגדר כ 38 ° C) על אחד חצי של השמיכה. במקום כלוב חיות נקי, ריק על החצי השני של השמיכה חימום.
- המקום בעל כושר ספיגה חיטוי או סטרילי, כרית חימום השמיכה כדי לטפל בעכבר במהלך gavage.
- לאסוף חומר קינון עבור הגורים מהחלק העליון של הקן קיימת, שנוצרו על-ידי סכר וליצור ספל חדש הקינון חרוט באמצעות ידיים בכפפות, חיטוי באמצעות אתנול 70% ומייבשים. המקום הזה קן חדש בכלוב החזקה נקי, ריק. זה מקל על העברת לריח של הקן לידי בכפפה, ובכך מצמצם את המבוא של ריחות אחרים על הכלבלב תוך כדי לטפל בהם במהלך התהליך, לצמצם את הסיכון של קניבליזציה.
- להעביר את הגורים אל הקן חרוט מחזיק כלוב ולהסיר את הכלוב עם הסכר הקבינט. פעולה זו מפחיתה את הלחץ של הסכר ע י מניעת לשמוע את הגורים במהלך ההליך.
הערה: אם פרוביוטיקה הקולוניאליסט הידוע של המעיים מאתר, התנאים הטיפול חייבים להיות מופרדים על-ידי כלובים או אבטחה שונים אפילו ארונות כדי למנוע את האפשרות של צלב קולוניזציה.
4. אינטרה-הוושט gavage של העכבר neonatal
- פתח את האריזה מזרק לגישה נוחה. פתח את האריזה של המחט באופן סטרילי וצרפם לראשו של המזרק. לשטוף את המחט עם 70% אתנול וביו -החיטוי לפני ההליך. להשתמש ערכות שונות של מחטים עבור הטיפול וקבוצת הבקרה כדי למנוע זיהום.
- למשוך קצת יותר הסכום הרצוי של פתרון פרוביוטיקה-צבע לתוך המזרק. החזק את המזרק פונה כלפי מעלה. לאחר מכן לנתץ נוספת, קפיצי עם האצבע כדי לסלק בועות ולדחוף על הבוכנה לגרש בועות ואת אמצעי האחסון תוספת נוזלי עד לנפח הרצוי. פעולה זו מבטיחה כי יש את המרחב האווירי אין המחט. עבור העכבר 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום, עוצמת הקול של gavage אינו יכול לחרוג 30 µL.
- מקם את הגור על גבי משטח סטרילי סופג על גבי כרית החימום. השתמש את המחט האכלה (מד 24, 1" אורך המחט, 1.25 מ"מ קוטר הכדור) מבחוץ כדי למדוד את האורך של הוושט על ידי הצבת הכדור של המחט מתחת הסרעפת (הקצה התחתון של עצם החזה). סמן את המחט ברמה של החוטם לציין את הגבול של החדרת המחט (איור 1). להתבונן הכלבלב לסימני בריאות, הכוללים לנשום רגיל ורוד הגיוון של העור.
- טובלים את קצה המחט הממס טבילה (תמיסת דקסטרוז 5% או - המדיום בשימוש כדי להמיס את פרוביוטיקה ו פרה-ביוטי) לשמן את המשטחים החיצוניים של המחט האכלה. זה מקל על הערך חלקה של המחט לתוך הוושט של העכבר.
- הרם את הגור הזה. או על-ידי בעדינות החזקת הראש והגוף בין האגודל לאצבע. להבטיח את הראש, הצוואר, הגוף מוחזקים במצב ישר. לא להחזיק הכלבלב הזה. במשך יותר מ 60 s שם הוא סיכון של חסימה של קנה הנשימה המוביל סאפאקיישן. ודא שהכלבלב יכול לנשום. סימנים של scruffing קשה מדי יכולים לכלול חוסר יכולת לנשום, מתנשף משמעותי ואת הלשון הרחיב את הפה. לפקח על נשימה במהלך ההליך כולו וצבע של הגורים.
- הכנס את הנורה של המחט לתוך מרכז הפה של הכלבלב בזווית של 45° למטוס של הגוף עד שהוא מגיע האחורי של הגרון.
- בעדינות לשנות את הזווית של המחט הציר על הנורה של המחט והוא עובר את המזרק הרחק מן האדם gavaging (לכיוון הצד הגבי של הכלבלב) עד שהוא מקביל למישור עמוד השדרה של הכלבלב. Scruffing הכלבלב מסייעת לשמור את המחט במקום בחלק האחורי של הגרון, ומונע גם העכבר להתפתל. ודא הכדור של המחט לא לקדם או לחצים כלשהם נגד האחורי של הגרון במהלך השינוי בזווית.
- אם העכבר מנסה לבלוע את המחט, לאפשר את באופן טבעי להחליק מטה, לעצור את התנועה כאשר הסימונים על המחט יתיישר עם החוטם. המזרק ואת המחט הם בדרך כלל כבדים מספיק כדי להחליק במורד תאריך היעד לכוח המשיכה. תמיכה המשקל של המחט כל הזמן אז המחט מחליק בקלות במורד הוושט עם בלי לחץ כלפי מטה מהאדם ביצוע של gavage.
- אם המחט פוגשת התנגדות בחלק האחורי של הגרון, למשוך המחט gavage מעט להוציא את הכדור של המחט, זווית מחדש את המחט בתוך הפה לכיוון השמאלי של העכבר (של המטפל מימין) לאט במרווחים 1 מ"מ קטנים. המחט צריך להתחיל להחליק בקלות הוושט.
- אם המחט נפסק לפני הסימונים על המחט מגיע לפה, לא להזריק את הפתרון.
- אל תשמור את המחט מוכנס במשך יותר מ-20 s. במקרה זה, תמשוך את המחט באיטיות תוך שמירה על המזרק במקביל הגוף ולתת את הגור לנוח על מגבת הנייר ב-30 s כדי מינימלית 1 gavaging לנסות שוב אחרי שימון על המשטח החיצוני של המחט עם הממס.
הערה: הרדמה לא משמש עבור ההליך כמו התגובה של העכבר יש צורך למדוד את ההצלחה של gavage.
- כאשר הסימונים על המחט האכלה היא מעל החוטם, מיושר עם קצה החוטם, אל תיתן את המחט להעביר או להתקדם כל עוד. לאט לאט להחדיר האחסון הרצוי של נוזל. אם הנוזל aspirated או שנצפה בועה דרך האף, עצרו את הזריקה מיד, לאט. משכי את המחט.
- מניחים את הכלבלב זקופה על מגבת הנייר על כרית חימום כדי לסייע בהתאוששות שלו. לפקח מקרוב על בעיות נשימה המשך או שינוי צבע של הכלבלב המציינת השאיפה. המתת חסד הגורים זה יש aspirated מיד.
- לאחר gavage תושלם, לסגת בעדינות את המחט האכלה באותה הזווית שהיא הוכנסה. במקום הכלבלב על מגבת הנייר על כרית חימום ומחוממת. חכה 10 s עבור הגורים להשיב מפעילות רגילה ודפוס נשימה. גוון ורוד בריא צריך מופיעים מעל גופו של הכלבלב, לצבוע יהיה גלוי רק בתא הקיבה. . זוז אחורה, לכלוב עם הגורים אחרים
הערה: צבע מאכל כחול Gavaging היא דרך מצוינת כדי לתרגל את ההליך שפורטו לעיל. אם gavage מוצלח, הבטן של העכבר יהיה גלוי כמו גוון כחול. אם הצבע הכחול נמצא מחוץ לבטן של הכלבלב (הצוואר, החזה או אזור בית השחי), החיה צריך בצורה הומאנית המתה (בהתאם לחוקים טיפול בבעלי חיים), כי זה מצביע על קרע של הוושט או שאיפה.
5. אוסף של intestional דוגמאות לניתוח קולוניזציה
- במהלך ניטור עוקבות או gavaging, לאסוף דגימות צואה microbiome הגורים.
הערה: הכלבלב לעתים קרובות משתין, ומפריש כאשר gavaged, הפעם יכול לשמש כהזדמנות כדי לאסוף דגימות צואה לניתוח microbiome. - עבור סיום של ניסויים, לאסוף את המעיים התריסריון אל הרקטום לאחר המתת חסד של הגורים. להפיל את הכלבלב ללוח כירורגי, לחטא את העור עם 70% אתנול. לחתוך את העור לתוך ארבעת הרבעים ללא פגיעה בשכבת הצפק באמצעות כלים לעקר עם אתנול 70% ועיקור חרוז חם ב- 250 מעלות צלזיוס.
- השתמש סט שונה של כלי סטרילי כדי לחתוך את הצפק ארבעת הרבעים והעברתו מהמרכז בצורה האיברים הקרביים הם חשופים.
- לאתר הקיבה ולהשתמש מלחציים כדי לצבוט מתחת את שריר הסוגר מולדת, בקצה של פי הטבעת. הפעל את אורך המעי באמצעות כלי קהה או מלקחיים כדי לשחרר אותו מן רקמת חיבור רקמת מצע המעי העליון ולייעל את המעי. פעם אחת לכל אורכו של המעי שפונו של רקמת חיבור, גזור בקצוות בחוזקה.
- לסמן את רדיד אלומיניום עם הכיוון של המעי, לעטוף באופן בטוח ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: הליך הפקת דנ א יכול להתבצע בנקודה זו ללא הקפאה. צבען כחול נראתה גם לעבור דרך המעי מעל 24 שעות, אוסף של דוגמאות עבור ניתוח קולוניזציה הוא הטוב ביותר כאשר המעיים נאספים לפחות 24 שעות לפרסם את gavage האחרון. אותות אולי הגברה לפני זה timepoint על ידי חיידקים שאינם דבקה transiently עוברים התערובת gavage.
6. DNA החילוץ של המעיים לניתוח קולוניזציה
הערה: הפקת דנ א נעשית באמצעות ערכת מסחרי עם אופטימיזציה של השינויים שנעשו בפרוטוקול להפקת DNA במעי. ודא מנגנון חימום מוגדר לטמפרטורה הרצויה הפתרונות צריכים שינויים או מראש ההתחממות מוכנים כראוי.
- הכנת מאגר פירוק אנזימטי (ELB) כדלקמן: להפוך את פתרון עם EDTA נתרן 2 מ מ, 20 מ מ טריס-Cl, 1.2% X-100 טריטון. להתאים את ה-pH ל 8.0. מייד לפני השימוש ELB, להוסיף ליזוזים ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל.
- מראש לשקול הצינורות חרוז גארנט ביתרה האנליטי עם caps הוסר.
הערה: זה נעשה כך אם המשקל הנדרש הוא מסוגל לירות, קל להסיר את תוכן המעי. - לחתוך את המעיים למקטעים קטנים באמצעות אזמל חד פעמי סטרילי ולאסוף המקטעים הרצויים לתוך הצינורות חרוז גארנט שנשקל מראש.
הערה: הקפד לשנות ואזמלי מנתחים בין כל מדגם כמו ה-DNA נמצא בכל מקום והוא יכול להשפיע על תוצאות ה-PCR. - להוסיף 1 מ"ל של ELB עם ליזוזים (מתוך שלב 6.1) כדי כל שפופרת, במקום על הישנה חרוז vortexing ולרוץ בהגדרה המרבית (14) למשך 5 דקות.
- ברגע הרקמה מופרת, העברת הצינורות לאמבטיה מים 37° C ו תקופת דגירה של 30 דקות.
הערה: שלב זה מתבצעת כדי להפעיל ליזוזים, זירוז פירוט של פפטידוגליקן דופן התא של חיידקים גראם חיוביים. - להכין צינורות עם 20 µL של Proteinase K עבור כל דגימה-ריכוז של מאו 600 לכל mL.
- Centrifuge הצינורות ב x 400 גרם ל-10 דקות. Lysate אמור להיראות ברורה עם שאריות רקמת על החרוזים.
- להעביר µL 180 של תגובת שיקוע (השלב העליון) לתוך שפופרת המכילה Proteinase K ולאחר מכן להוסיף 200 µL AL מאגר ברכבת התחתית. מערבולת 15 s לערבב.
- במקום צינורות על הבלוק חימום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להוסיף 200 µL של 100% אתנול הצינור ומערבבים על ידי vortexing עבור 15 s.
- להוסיף כ 600 µL של lysate על העמודה ספין (קיט).
- צנטריפוגה במשך דקה אחת ב x 8000 g. למחוק את הזרימה.
- חזור על שלב 6.12 עד כל lysate כבר נמשך דרך העמודה.
- מקם את העמודה בשפופרת אוסף חדש. להוסיף 500 µL של מאגר AW1, צנטריפוגה ב x 8000 g במשך דקה אחת.
- למחוק את הזרימה. להוסיף 500 µL של מאגר AW2, צנטריפוגה ב x 8000 g למשך 3 דקות.
- למחוק את הזרימה, centrifuge העמודה שפופרת ריק אוסף ב- 8,000 x g למשך 3 דקות.
- להעביר את העמודה שפופרת • תנאי ה-DNA. להוסיף 60 µL של מים הנדסה גנטית של כיתה ה-PCR ישירות על גבי הקרום, תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- השתמש המים • תנאי קדם ומחוממת ב 37 ° C כדי elute. • תנאי ניתן לעשות פעמיים על-ידי שימוש לחצי מנפח • תנאי הסופי וצעד חוזרות 6.15 פעמיים כדי להגדיל את התשואה.
- צנטריפוגה במשך דקה אחת ב x 8000 g כדי elute דנ א.
- למדוד את הריכוז של ה-DNA eluted באמצעות השיטה הרצויה כמת. התשואות תהליך החילוץ הם בטווח של 10-40 ng/µL ה-DNA.
- מאגר ה-DNA eluted ב-20 ° C.
7. qPCR ההתקנה
- תנאי ה-PCR
- להפעיל את המכונה וטען את התוכנית בטבלה 1 למכונת qPCR בזמן אמת.
- לולאה השלבים 3 עד 5 ב טבלה 1 40 מחזורים והחזק את הדגימה ב 4 ° C בסוף התגובה.
- הגדרת הניסוי PCR
- השתמש תחל טמפרטורה המופיעים בטבלה 2. השתמש ריכוזים תנאי ריאקציה שנמצאו בטבלה3. להגדיר את כל התגובה שהפקידים לפקד עבור וריאציה פרוצדורלי.
- מקם את תגובת ה-PCR הצינורות/הצלחת במערכת qPCR, הפעל התוכנית נטענת מערכת מהשלב 7.1.
- הסר את הצינור בסוף המרוץ, להניח אותה על 4 ° C ולהתכונן ג'ל טעינה.
8. כימות של LP קולוניזציה
- להכין תערובות qPCR 10 µL או 20 תגובות µL על פי טבלה 3.
- LP גנומית DNA עיקול רגיל 107 עותקים1 10/µL...
הערה: מאז להיות מצופה µL 4 של כל דילול, 107 עותקים ב 4 µL או 2.5 x 106 עותקים בכל µL נדרש המניות המוצא. השתמש אותו עיקרון למשך שארית העקומה.- להכין לדילול 1:4:107 עותקים בכל µL ב 50 µL.
µL 3.147 LPDNA + µL 46.85 של dH2O = 2.5 x 106 עותקים לכל µL - באופן סדרתי לדלל 10-fold: להוסיף 5 µL 45 µL dH2O ב 1.25 x עותקים5 10/µL....
- צלחת µL 4 לכל דילול לכל טוב.
- להכין לדילול 1:4:107 עותקים בכל µL ב 50 µL.
- ויזואליזציה של LP amplicons
- להשתמש agarose 2% ג'ל כדי להגיע הפרדה ברורה של ~ קטע מוגבר LP bp 197.
- לטעון µL 9 של כל מוצר ה-PCR הג'ל.
- הפעל את הג'ל במשך 30 דקות-120 V.
Representative Results
הייחוד של שיטה זו נח שלה עיבוד של הטכניקה gavaging לגודל, חולשה של עכבר neonatal. בסעיף הקודם תיאר את השלבים חשוב בביצוע הליך gavage מוצלח עם העכבר 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום. כדי ליצור מידה טובה כמת, עיקול רגיל נוצר באמצעות דנ א טהור LP עם משכפל טכני 3 (איור 2). העקומה הסטנדרטי מספק טווח דינמי של זיהוי ה-dna LP באמצעות תחל. הטווח הדינמי היה בין 7 ו- 28 מחזורים היכן טווח של 101 עד 107 עותקים של ה-DNA LP זוהה. מדרון יציב של העקומה סטנדרטי ייצג את היעילות ואת המדרגיות של התגובה.
ההליך של IE gavage שימש בעכברים בוגרים בקלות יחסית. עם זאת, מערכת העיכול העליונה של עכבר neonatal שביר, נדרש מכוילת תנועות של gavage מחט במהלך ההליך. Gavages חוזרות ונשנות יכול להגדיל את הסיכוי של גירוי הוושט-"אינטרה", פציעה, כשל או דחייה על ידי הסכר עקב הטיפול. לפיכך, נבדקו שני לוחות זמנים שונים gavaging, הקולוניזציה מעיים היה לכמת באמצעות ה-DNA של כל המעי homogenates. עכברים היו gavaged עוד לא יודעיםעליהם כלום 2 עד 8 עוד לא יודעיםעליהם כלום עם פרוביוטיקה מנוהל כל יום או כל יומיים (איור 3). כל מדגם הכיל שכפול טכני אחד והיה כל תנאי משכפל ביולוגית לפחות שני. הגורים gavaged כל יום עם מינונים 7 היה בסביבות 103 עותקים של LP ואילו הגורים gavaged בכל יומיים עם מינונים 4 היה בסביבות 105 עותקים. מרקם של תוצאות בין משכפל להוסיף אשראי הדיוק של טכניקה. היה יותר LP זוהה במעיים של הגורים gavaged בכל יומיים בהשוואה הגורים היו gavaged כל יום. כך, הניסויים הבאים היו להגדיר עם לוח זמנים gavage בכל יום כמו זה גם מפחית את הלחץ על הגורים.
חשוב להימנע אינטרה-המלטה פרוביוטיקה לחצות זיהום בעת עבודה עם פרוביוטיקה. Microbiome הארנבונים מאותה היה צפוי להיות דומה כפי שהם חולקים את אותה אמא ואת הסביבה הקינון. זה מוכיח בעיה ללימודי פרוביוטיקה אם התנאים טיפול ובקרה נכחו בתוך הפסולת אותו כמו האורגניזם פרוביוטיקה יש פוטנציאל להפוך לחלק microbiota ("קולוניזציה התפשטה '). כדי לקבוע אם פרוביוטיקה לזהם, לישוב הארנבונים מאותה לא מטופל, מחצית המליטה gavaged כמו לעיל, המעיים נאספו עבור qPCR. ניתוח מעיים qPCR של 10 בארבי כוכ עכברים הראו הגברה הצפוי של ה-DNA LP בעכברים gavaged אבל גם, במידה פחותה יותר, הארנבונים מאותה הלא-gavaged (איור 4). המעיים של העכברים בארבי כוכ אותו מהכלוב מטופל הראה ללא הגברה או הגברה מינימלית-מחזורים יותר מ 32. זה סיפק ראיות שיתוף קהילתי microbiome בתוך בהמלטה בכלוב. לפיכך, עבור ניסויים עם פרוביוטיקה להפרידם הקבוצות טיפול על ידי כלובי לפקד על השתנות דרך לחצות זיהום. השימוש של סכרים פוסטר יכול להיחשב אם ניסוי היא להקים בתוך סביבה המלטה, אבל בלבול אפקטים כמו טיפול מופחתת מהסכר פוסטר, דחייה צריך להיות מוערכים והותאמו במיוחד. כאשר עכברים gavaged עד 8 בארבי כוכ נותרו לא מטופל במשך שישה ימים, ה-DNA מעיים היה מנותח בגיל 14 עוד לא יודעיםעליהם כלום, נמצאו כ 10 עותקים של LP (איור 5). לפיכך, הקולוניזציה של LP נמצאה להיות ארעית, האוכלוסיה לזיהוי פחתה במשך הזמן.
איור 1 . מדידת אורך בין הסרעפת (הקצה הנמוך של עצם החזה) את החוטם כדי להפוך ההכנסה המרבית סימון המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . עיקול רגיל הוקמה באמצעות תחל LP ו- DNA LP בקרת האוויר. לדילול טורי של ה-DNA LP בקרת האוויר היה עשוי לקבוע את טווח לזיהוי דינמי עבור תחל השתמשו במחקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . LP הגברה של DNA מעיים 10 בארבי כוכ הגורים טיפל בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 gavages מתוזמנת כל יום (7 מנות), בכל יום אחר (4 מנות). Gavaging בכל יום אחר הראה LP מעיים גבוהה יותר בהשוואה gavaging כל יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . LP הגברה של DNA מעיים 10 בארבי כוכ הגורים עם 2 מטופלים ו- 2 לא מטופל בהמלטה 4 גורים. Gavage היה בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 ב gavages מתוזמנת כל יום (7 מינונים). פרוביוטיקה שני מטופלים הגורים הצג הפרופיל ההגברה הצפויה. הגורים לא מטופלת להראות הגברה משתנה של LP המציין שיתוף קהילתי של האורגניזם פרוביוטיקה בתוך בהמלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . LP הגברה של DNA מעיים בארבי כוכ 14 הגורים טיפל בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 gavages מתוזמנת כל יום (7 מנות), בכל יום אחר (4 מנות). הטיפות עומס LP להלן מחזור 28 סיווג אנלוגיים של LP במשך 6 ימים פוסט האחרון gavage פרוביוטיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב | טמפרטורה | זמן |
| 1 | 50 ° C | 2 דקות |
| 2 | 95 ° C | 3 דקות |
| 3 | 95 ° C | 30 שניות |
| 4 | 58 ° C | 30 שניות |
| 5 | 72 ° C | 30 שניות |
טבלה 1. תנאים הגברה qPCR. טמפרטורה, מספר תנאים מחזור התגובה ה-PCR.
| היעד | אזור מרווח intergenic 16-23S |
| גודל המקטע הצפוי | 144 bp |
| פריימר Tm | 58˚C |
| פריימר לפנים (FP) | מעשי-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| פריימר הפוכה (RP) | מעשי-2: חתול CGG TTT TGT TCT תאת גה AAA אתא |
בטבלה 2. הפרטים של רכיבי התגובה qPCR. הפרטים על תחל שלהם טמפרטורה מחזק וגודל פרגמנט הצפוי בעקבות תגובות PCR.
| ריכוז | תגובה 10 µL | התגובה 20 µL | |
| תבנית ה-DNA | עמוד 200/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| מיקס מאסטר SYBR | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 מיקרומטר | 0.3 ΜL | 0.6 ΜL |
| RP | 10 מיקרומטר | 0.3 ΜL | 0.6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8.8 ΜL |
בטבלה 3. לפי התגובה כרכים וריכוזי. הריכוז של ריאגנטים ואמצעי אחסון לתגובות.
Discussion
ההליך של IE gavage פותחה בבטחה לתת מינון מסוים של פרוביוטיקה עכברים neonatal. כמויות קטנות של נוזל מועברות של מערכת העיכול העליונה באמצעות מחט האכלה כדי למנוע שאיפה תוך הקפדה על המסירה של המינון ביטחון. המעיים של העכברים שנאספו לשם קולוניזציה ניתוח שני ורשום שישה ימים gavage. ההליך להפקת DNA שונה כדי להבטיח תשואה גבוהה של האורגניזם גראם חיוביים פרוביוטיקה. ניתוח qPCR של ה-DNA חילצה יומיים פוסט האחרון gavage הראה גבוהים יחסית התיישבות LP בעכברים gavaged בכל יומיים לעומת עכברים gavaged כל יום בין בארבי כוכ 2-8. היה שם גם ירידה בכמות LP במשך שישה ימים, מציג זה פרוביוטיקה להיות אורגניזם ארעי במעיים של העכבר. התוצאות של ניסויים אלה נקבעו תנאים לערוך מחקר עם הקפדה גבוהה בקבוצת גיל זו.
כדי לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של פרוביוטיקה בעכברים neonatal, זה היה מנוהל לעכברים neonatal 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום; מועד התחלה דומה הצבע המשפט האנושי. האכלה הלוע התחתון של עכברים neonatal בעבר מתואר בספרות, בוצעה רק לאחר12,עוד לא יודעיםעליהם כלום 5-817 כאשר הסיכון של השאיפה הוא נמוך יותר בשל מכניקה הבליעה מפותח. עם זאת, האכלה הלוע התחתון אינה מתאימה עבור עכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום כפי שיעור גבוה יותר של שאיפה נצפו במחקר פיילוט (נתונים לא מוצג). הטבע צמיגה של פרוביוטיקה, פתרון prebiotic הוסיף את הסיכון של השאיפה. בעקבות ההליך gavaging ' ב- IE ' למזער את הסיכון של השאיפה בעכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום תוך אספקת לנפח הרצוי באופן ישיר מערכת העיכול העליונה. ההצלחה של הפרוצדורה אומתה תחילה באמצעות צבע מאכל חדורים פרוביוטיקה gavage. מאכל פועל כסמן הגלוי דרך העור של הכלבלב. אין השפעות שליליות נצפו עכברים gavaged עם צבע מאכל, מומלץ לאמת את ההליך gavaging באופן זה לפני התחלת ניסויים בקנה מידה גדול. פתרון מהיר gavage פוסט ראית רפלקס בקול מתנשף יכול לשמש גם מהווים אינדיקציה נוספת gavage מוצלח. ברגע העכבר מושם על השמיכה חימום פוסט-gavage, רפלקס בקול מתנשף יהיה להתפוגג ואתם עלייה בשכיחות נשימה יתקיימו בתוך 20 שניות. המשך רפלקס בקול מתנשף במשך יותר מ-30 שניות מציין gavage נכשל. Gavage מוצלחת תלויה גם המתאים החדרת המחט האכלה עם הנורה יושב מעל הפתח של הטבעת הלב של הקיבה. זה ניתן להקל על-ידי הבטחת כי הסימונים על המחט מדידת האורך בין הסרעפת קצה החוטם, לא לעבור החוטם של העכבר במהלך gavage. פעולה זו מקטינה את הסיכוי לפגיעה העכבר. התדירות של gavage יכול יש השפעה משמעותית על תוצאות הניסוי. Gavaging בתדירות גבוהה גם יכול ליצור יותר לחץ על הגורים והאם בשל ההפרעות מתמדת של הכלוב ואת הקן. ז gavage האופטימלי ביותר הוא כאשר gavages לפחות בתדירות גבוהה ומעל משך קצר יותר של זמן מבלי לאבד את האפקט הצפוי במערכת. כדי להבטיח את הבטיחות ואת עקרות של ההליך gavage את המחט חייב להיות מחוטא ע י כביסה ושימוש autoclaving שביניהם. כביסה בקפדנות על שימוש חיצוני קרצוף מבפנים על-ידי אילוץ מים דרך המחט באמצעות מזרק לפני autoclaving הכרחי כמו כל שאריות של חלקיקים יכול משובצים המחט במהלך autoclaving ואני יכול להתערב עם ההליך gavaging.
קולוניזציה LP גבוה יותר נצפתה ב הגורים היו gavaged כל יום בהשוואה הגורים gavaged כל יום. זה יכול להיות בגלל הלחץ מופחת על הגורים gavaged בכל יום נוספים ואפשרות של פרוביוטיקה מקבל חומרים מזינים יותר דרך החלב יחסית יותר על ידי הגורים. התלות במינון של פרוביוטיקה לטיפול נחקרה בעבר העכבר מודלים18,19 , ולכן חשוב הממשל של המינון הנכון. הפתרון פרוביוטיקה מוכן הוא מצופה לפני כל gavage כדי ספירה מדויקת של CFU מנוהל. אם האורגניזם פרוביוטיקה אנאירובית, חשוב לראות אם יש הבדל CFU כאשר תרבותי aerobically או anaerobically. מאחר LP אובליגטוריים עיצוב גבות, זה היה תרבותי באמצעות שתי השיטות, אין הבדל CFU נצפתה.
פוסט gavage מעיים LP עומס הניתוח בוצע באמצעות דגימות DNA qPCR, באיכות גבוהה. כדי לצמצם זיהום LP DNA בין הטיפול את קבוצות שליטה, שונה האכלה מחטים, ארונות אבטחה ציוד כירורגי שימשו כדי להבטיח דגימות באיכות הגבוהה ביותר. מדידת מדויק פרוביוטיקה במעי נדרש שיטת מיצוי DNA ממוטבת. השיטה היעילה ביותר להפקת DNA של צואה כרוך במספר חרוז להכות צעדים20,21,22. שיטה זו הייתה מאומצת על החילוץ של חיידקים במעיים באמצעות מכות חרוז והנצפית ייצוג מופחתת (< 10 עותקים2 התאושש) של LP ב הפקת דנ א כל המעי. כמו LP הוא אורגניזם גראם חיוביים עם כמות משמעותית של פפטידוגליקן בקיר התא, הפרוטוקול היה מותאם עם שלב ההמסה פפטידוגליקן באמצעות ליזוזים23,24 שנוספו למאגר פירוק אנזימטי. זה עלה הייצוג של LP במדגם מעיים אותו-גדול מכפולה. הטיפול ליזוזים מבטיח פירוק השכבה החיצונית בעוד החרוז להכות שלב מקלה את פירוק של האורגניזם. אופטימיזציה של כמות הרקמה, את סוג חרוז גארנט ואת משך הזמן של הפרעה באמצעות החרוזים הוא הכרחי עבור קבלת מוצרים DNA אופטימלית לערוך ניתוח ה-PCR.
ההשפעה החיובית של פרוביוטיקה מנוהל כמו טיפול מונע או טיפול ב neonates מראש טווח, המונח הוא שמעידים האחרונות מחקרים25,26,27,28. הקמת מודל ראוי העכבר neonatal פרוביוטיקה היא מוצדקת כדי לפרוק את ההשפעה המגנה של פרוביוטיקה. פרוטוקול זה שמפורטות כאן מייצג מדריך עבור חוקרים לא מוכר עם העכבר neonatal עבודה בעזרת פרוביוטיקה. על אף הבעיות עם מכרסמים microbiota תוך כדי לימוד מחלה ובריאות האדם, שיטה זו ניתן להרחיב את המחקר התמקד להבין את השינויים של microbiome עקב פרוביוטיקה. מודל זה מספק גם פלטפורמה ללמוד מארח-חיידק אינטראקציה, תגובות מערכת החיסון במהלך שלבים התפתחותיים שונים.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
תודה לצוות יחידת הטיפול חיה ו הוטרינרים UBC עבור הדרכה ועזרה העכבר עובד במכון מחקר לפנה ס לילדים החולים. הודות אוניברסיטת בריטיש קולומביה במחלקה לרפואה ניסויית למימון המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
