Summary
Denne studien detaljer prosessen med gavaging nøyaktig mengder probiotika til neonatal mus. Den eksperimentelle set-up var optimalisert for å inkludere, men er ikke begrenset til probiotiske dosering, metoder for administrasjonen og kvantifisering av bakterier i tarmen.
Abstract
Voksen musen modeller har vært mye brukt å forstå mekanismen bak sykdomsprogresjon hos mennesker. Anvendelse av studier gjort i voksen mus modeller neonatal sykdommer er begrenset. For bedre å forstå sykdomsprogresjon, vert svar og langsiktig effekt av nyfødte, er en neonatal musemodell sannsynlig en bedre passform. Sparsom bruk av neonatal musen modeller kan delvis tilskrives de tekniske vanskelighetene med å jobbe med disse små dyr. En neonatal musemodell ble utviklet å bestemme effekten av probiotiske administrasjon i tidlige liv og spesielt vurdere muligheten til å opprette kolonisering i nyfødte musen tarmkanalen. Spesielt for å vurdere probiotiske kolonisering neonatal musen, ble Lactobacillus plantarum (LP) levert direkte til neonatal musen mage-tarmkanalen. Dette ble LP administrert til mus av fôring gjennom intra-spiserøret (IE) gavage. En svært reproduserbar metode ble utviklet for å standardisere prosessen med IE gavage som gir en nøyaktig administrasjon av probiotiske doser samtidig minimere traumer, en del spesielt viktig gitt gebrekkelighet av nyfødte mus. Begrensninger av denne prosessen omfatter muligheter esophageal irritasjon eller skade og aspirasjon hvis gavaged feil. Dette representerer en forbedring på gjeldende praksis fordi IE gavage i distale spiserøret reduserer sjansene av aspirasjon. Etter gavage, kolonisering profilen probiotiske ble sporet med kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) av utdraget intestinal DNA LP bestemt primere. Ulike søppel innstillinger og bur teknikker ble brukt til å vurdere mulighetene for kolonisering oppslag. Protokollen detaljer vanskelighetene med IE neonatal mus gavage og påfølgende koloniseringen kvantifisering LP.
Introduction
Hos spedbarn, har tidlig probiotiske eksponering blitt assosiert med immunmodulerende virkninger fører til redusert forekomst av sykdommer som nekrotiserende enterokolitt, atopisk dermatitt og sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bak dette immunmodulerende svaret er utfordrende for å utforske gitt begrensningen til prøvetaking i nyfødte menneskelige studier (dvs. sekvensiell blod uavgjorte og biopsier). Neonatal musen modeller kan hjelpe studere virkningsmekanismen involvert i neonatal immun regulering forbundet med probiotiske bruk og endringer i tarmen bakterieflora. Dessverre, de fleste musen modeller for Probiotika har i stor grad fokusert på voksen mus; men er effekten av probiotika sannsynlig å være høyeste tidlig i livet, foreslå modeller som er spesifikke for denne aldersgruppen vil være nyttig3,6. I tillegg er neonatal musen modeller bedre egnet til å studere sykdommer og intervensjoner ment for programmet i tidlig liv menneskelige spedbarn som de forventes å nærmere etterligner en utvikler immunsystemet og mikrobiell7,8 ,9,10. Målet var å studere omfanget av og mønstrene av probiotiske kolonisering av neonatal mus med fokus på mekanistisk samspillet mellom verten og dens microbiome. Egnet beskrivelser av nyfødte modeller ble ikke funnet i litteraturen, og dermed behov for utvikling av robuste og standardisert metode var adressert.
Etablerte metoder av peroral administrering av ulike forbindelser til nyfødte mus inkluderer mors overføring av ønsket forbindelser gjennom melk ved behandling av vannkilde for gravide damer11 eller fôring nåler for å lette administrasjonen av ønsket forbindelser i oropharynx12. Disse metodene er nyttig for eksperimenter som ikke har presis dosering krav og hvor behandling er lett ingested av mottakeren musen. Probiotika administreres ofte sammen med prebiotiske som galactooligosaccharide og fructooligosaccharide (FOS) som fungerer som en kilde til næring for probiotiske bakterier; forbindelsene additiv gjøre løsningen tyktflytende og utfordrende å administrere via de ovennevnte metodikkene. Utarbeide en metode for presis mengder probiotika og prebiotics å nyfødte mus så tidlig som første dag av livet (DOL) var nødvendig. Holder på å utvikle gavage teknikken, muligheten for kolonisering oppslag (som observert i andre probiotiske studier mellom behandling og kontroll armene13,14,15,16) ble testet og den relative overfloden av koloniserte Lactobacillus plantarum (LP) i tarmen av pups med forskjellige gavage tidsplaner ble vurdert. Probiotiske utarbeidelse brukes i forsøkene besto av 109 colony-forming enheter (CFU) per gavage av LP (ATCC-202195 belastning), blandet med FOS (prebiotiske) og maltodekstrin (hjelpestoff) som beskrevet i den siste menneskelige prøve3. Probiotiske leveringen var dyktig bruker IE gavage og prosessen er beskrevet i protokollen nedenfor. Kolonisering profilen probiotiske ble evaluert benytter sanntid utvidelse av DNA utvunnet fra hele tarmen med LP bestemt primere.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført for retningslinjene som er fastlagt av støttepersonalet på dyr omsorg anlegget ved University of British Columbia og alle prosedyrer ble godkjent av UBC dyr omsorg komiteen.
1. kvantifisering av probiotika administrert
Merk: Dette trinnet er anbefalt å bestemme den nøyaktige mengden probiotiske CFU som kan administreres i en enkelt dose. Mengden av probiotika og kjøretøy (FOS og maltodekstrin) bestemmer metning forholdene i løsningen. Fra erfaring, kan mer enn 30 µL (~ 20 mL per kg) av væske administreres til mus på DOL 2 som noen større volum øker risikoen for aspirasjon.
- Forberede seks 1,5 mL microcentrifuge rør føljetong fortynninger med hver rør som inneholder 180 µL sterilt 5% druesukker saltoppløsning.
- Veie en 0.2 g aliquot av en probiotiske-prebiotiske blanding og oppløse den i 1 mL av 5% druesukker saltvann i et sterilt måte.
- Vortex 30 sekunder og pipette bryte klumper. Gjenta til ingen synlige klumper er observert.
Merk: Maltodekstrin gjør løsningen tyktflytende og bidra til løsning metning. - Utføre en seriell fortynning med rør i trinn 1.1. Vortex å blande.
- Plate 40 µL av hver fortynning på en merket kvadrant av MRS agar plate. Plate hver fortynning i duplikat.
- Inkuber under anaerob (eller gram-negative) forhold på 37 ° C for 48 timer i et vakuum krukke med en gass-pakke.
- Telle hver plate innenfor en 20-70 kolonier pr. kvadrant. Gjennomsnittlig plate teller med samme fortynning og beregne tilbake til den ønskede enheten.
2. utarbeidelse av probiotika og prebiotics for gavage
Merk: Riktig oppløsningen av probiotiske og prebiotiske er nødvendig for å sikre jevn injeksjon av væske gjennom fôring nålen under gavage.
- Kombiner den nødvendige mengden av lyofilisert probiotiske organisme med den ønskede mengden prebiotics og kjøretøy i et sterilt microcentrifuge rør.
- Legge til passende mengder løsningsmiddel (5% druesukker saltvann) å oppløse probiotiske-prebiotiske blandingen.
Merk: Kapasiteten på oppløsningen er begrenset av den prebiotiske og kjøretøy som brukes. Fra erfaring, synbiotic kombinasjonen (med FOS og maltodekstrin) nådd metning på ca 0,3 g/mL mens oppløses i en 2 mL microcentrifuge tube med 1 mL av løsemidler. - Vortex å blande til alle faste stoffer oppløst. Bruk en Pipetter for å bryte opp globules av faste partikler i løsemiddelet av pipettering opp og ned.
- Ruge i løsning på 37 ° C vannbad for 20 min.
Merk: Denne steg kan hoppet hvis probiotiske-prebiotiske løsningen er laget fra en levende kultur. - Plate en fem serie 10 ganger fortynning på MRS agar plater før gavage å tallfeste nøyaktig probiotiske administreres å pup. Denne steg kan hoppet hvis nøyaktig CFU greven ikke er nødvendig.
3. forberedelser for biosikkerhet skap
- Bruk en biosafety skap når du arbeider med probiotika for å opprettholde steril teknikk. Angi cage dammer og valpene på en oppvarming teppe (satt til ca 38 ° C) på en halv av teppet. Plass en ren, tom dyr bur på den andre halvparten av oppvarming teppet.
- Sted desinfiseres eller steril, absorberende puten på oppvarming teppet for musen under gavage.
- Samle hekke materiale for valpene fra toppen av eksisterende, dam opprettet reiret og opprette en ny konisk hekkende kopp med hansker hendene, desinfiseres med 70% etanol og tørket. Sett denne nye reir i ren, tom holder buret. Dette forenkler overføringen av duften av reiret til hendene hansker og dermed minimerer innføring av andre dufter på pup mens håndtering dem fremgangsmåten, redusere risikoen for cannibalization.
- Flytte valpene til konisk reiret holder buret, og fjerne buret med demningen fra regjeringen. Dette reduserer stress for demningen ved å hindre den i å høre pups under prosedyren.
Merk: Hvis probiotiske er en kjent colonizer av murine tarmen, behandling betingelsene må være atskilt av burene eller med ulike biosikkerhet skap for å unngå mulighet for kryss kolonisering.
4. Intra-esophageal gavage neonatal mus
- Åpne sprøyte emballasje for enkel tilgang. Åpne pakking av nålen i et sterilt måte og knytte den til leder av sprøyten. Vask nålen med 70% etanol og autoklav før prosedyren. Bruke forskjellige sett med pinner for behandling og kontrollgruppen for å unngå forurensning.
- Trekke litt mer enn den ønskede mengden av probiotiske-dye løsning i sprøyten. Hold sprøyten grossist. Deretter trekke ned ytterligere og flick fingeren å dislodge bobler og presse på stempelet å utvise bobler og ekstra væske volumet til det ønskede volumet. Dette sikrer at det er ikke luft plass i nålen. For DOL 2-mus, må volumet av gavage ikke overstige 30 µL.
- Plass pup på sterilt absorberende puten over oppvarming pad. Bruk fôring nålen (24 måling, 1" p lengde, 1,25 mm ball diameter) eksternt til å måle lengden på esophagus ved å plassere ballen på nålen rett under xiphoid prosessen (bunnen av sternum). Merk pinnen på nivået av snuten å merke grensen for innsetting av nålen (figur 1). Observere valpen for helse tegn, som inkluderer vanlige puste og rosa farge i huden.
- Dypp spissen av nålen i dipping løsemiddelet (5% druesukker saltvann eller -mediet brukes å oppløse probiotiske og pre biotiske) å smøre de ytre flatene fôring nålen. Dette forenkler glatt oppføringen av nålen i spiserøret av musen.
- Løft pup ved scruff eller forsiktig holder hodet og kroppen mellom tommelen og pekefingeren. Sikre hode, nakke og kropp er holdt i rett stilling. Ikke hold pup av scruff for mer enn 60 s som det er en risiko for obstruksjon av trachea fører til kvelning. Sikre pup kan puste. Tegn på scruffing for hardt kan inkludere manglende evne til å puste, betydelig gisper og tungen utvidet ut munnen. Overvåke pup farge og puste under hele prosedyren.
- Sett inn pære nålen i midten av munningen av pup på en vinkel på 45 grader på Planet av torso før den når baksiden av halsen.
- Endre forsiktig nålen ved å dreie på pæren nålen og flytte sprøyten vekk fra den gavaging personen (mot dorsal side av pup) inntil den løper parallelt flyet av det pup virvelsøylen. Scruffing pup bidrar til å holde nålen på plass på baksiden av halsen, og forhindrer også at musen squirming. Kontroller at ballen på nålen ikke fremme eller utøve noe press mot baksiden av halsen under vinkel endringen.
- Hvis musen forsøker å svelge nålen, la det selvsagt Skyv nedover og arrestere bevegelsen når merkingen på pinne justert med snute. Sprøyten og p er vanligvis tungt nok til å skli ned forfaller til tyngdekraften. Støtte vekten av nålen hele tiden slik nålen glir lett ned esophagus uten nedadgående press fra personen utføre gavage.
- Hvis nålen møter motstand på baksiden av halsen, trekke gavage nålen litt å dislodge ballen nål og re vinkel nålen inne munnen mot venstre museklikk (handler's høyre) sakte i små, 1 mm intervaller. Nålen skal begynne å gli lett ned spiserøret.
- Hvis nålen slutter før merkingen på p Når munnen, injisere ikke løsningen.
- Ikke holde nålen settes inn for mer enn 20 s. Hvis dette skjer, trekke nålen sakte mens sprøyten parallelt torso og la det pups hvile på tørkepapir for 30 å 1 min. prøver gavaging igjen etter smøring i ytre overflaten av nålen med løsemiddelet.
Merk: Anestesi brukes ikke for prosedyren som musen er svaret er nødvendig for å måle suksessen til gavage.
- Når merkingen på fôring pinne er over snuten og justert med spissen av snuten, ikke la nålen flytte eller forhånd noen ytterligere. Sakte injisere det ønskede volumet av væske. Hvis væsken er pustende eller å boble gjennom nesen, stoppe injeksjon umiddelbart og trekke sakte nålen.
- Plass pup oppreist på papirhåndkle på oppvarming pad til hjelp i sin utvinning. Monitor tett for fortsatt pusteproblemer eller endre fargen på pup som angir aspirasjon. Euthanize pups det har pustende umiddelbart.
- Når gavage er fullført, forsiktig trekke fôring nålen i samme vinkel det ble satt inn. Plass pup på papirhåndkle på varmet oppvarming pad. Vent 10 s pup å gjenvinne normal aktivitet og pustemønster. En sunn rosa fargetone skal vises over i pup kroppen og fargestoff skal bare være synlig i magen rommet. Flytte den tilbake til buret med andre valpene.
Merk: Gavaging blå konditorfarge er en utmerket måte å praktisere prosedyren beskrevet ovenfor. Hvis gavage er vellykket, vil magen museklikk vises som en blå nyanse. Hvis blå fargestoff finnes utenfor magen på pup (halsen, brystet eller axillaris område), bør dyr være Human euthanized (i henhold til dyr omsorg regler), som angir et brudd på esophagus eller aspirasjon.
5. samling av intestional prøver for kolonisering analyse
- Under påfølgende overvåking eller gavaging, samle fecal microbiome prøver fra pups.
Merk: Pup ofte urinates og defecates når gavaged og denne gangen kan brukes som en mulighet til å samle fecal prøvene for microbiome analyse. - For avslutning av eksperimenter, samler du tarmen fra tolvfingertarmen til endetarm etter euthanasia av valpene. Feste pup å en kirurgisk bord og rense huden med 70% etanol. Klippe bort huden i fire quadrants uten å skade peritoneal laget med verktøy sterilisert med 70% etanol og en varm perle sterilisering på 250 ° C.
- Bruke et annet sett av sterile verktøy å kutte peritoneum i fire quadrants og flytte det fra midten på en måte at visceral organer er utsatt.
- Finn magen og bruke en klemme for å klype under den inn sphincter og på slutten av endetarm. Kjør lengden av intestine bruke et sløv verktøy eller tang å effektivisere tarmen og frigjøre den fra bindevev og hvem vev. Når hele lengden av tarmen er frigjort av bindevev, kuttet i festet endene.
- Merke aluminiumsfolie med retningen av tarmen, brytes på en sikker måte og fryse på-80 ° C.
Merk: DNA utvinning prosedyren kan utføres på dette punktet uten frysing. Blått fargestoff ble også sett gjennom tarmen over 24 timer og samling av prøver for kolonisering analyse er best når tarmen er samlet minst 24 timer legge den siste gavage. Signalene kan bli forsterket før det timepoint av ikke-overholdt bakterier transiently passerer gjennom gavage blandingen.
6. DNA utvinning fra tarmen for kolonisering analyse
Merk: DNA utvinning er gjort med en kommersiell kit i å optimalisere modifikasjoner protokollen for tarmen DNA utvinning. Sikre varmeapparatet er satt til ønsket temperatur og løsningene som trenger endringer eller forvarming tilberedes riktig.
- Forbered den enzymatiske Lysis Buffer (ELB) som følger: lage en løsning med 20 mM Tris-Cl og 2 mM natrium EDTA 1,2% Triton X-100. Justere pH til 8.0. Umiddelbart før du bruker ELB, legge til lysozyme en siste konsentrasjon på 20 mg/mL.
- Pre-veie garnet perle rørene på analytical balanse med caps fjernet.
Merk: Dette gjøres slik at hvis vekten er skutt, er det lettere å fjerne intestinal innholdet. - Skjær tarmen i små segmenter ved hjelp av sterile disponibel skalpell og scoop ønsket segmentene i pre vektet garnet perle rørene.
Merk: Husk å endre skalpeller mellom hver eksempel DNA allestedsnærværende og kan påvirke PCR resultater. - Legge 1 mL av ELB med lysozyme (fra trinn 6.1) til hver tube, plassere på vortexing perle beater og kjøre på maksimal innstilling (14) på 5 minutter.
- Når vevet avbrytes, overføre rør til 37° C vannbad og ruge i 30 minutter.
Merk: Dette trinnet er gjort for å aktivere lysozyme og indusere nedbryting av cellevegg Peptidoglykan av gram-positive bakteriene. - Forberede rør med 20 µL proteinasen k hver eksempel på en konsentrasjon av 600 mAU per mL.
- Sentrifuge rørene på 400 x g i 10 minutter. Det lysate bør se klare med noen vev rester på perlene.
- Overføre 180 µL av nedbryting (den øvre fasen) inn i et rør som inneholder proteinasen K og deretter legge til 200 µL AL bufferen røret. Vortex 15 s å blande.
- Plasser rør på oppvarming blokk på 56 ° C i 10 minutter.
- Legg 200 µL av 100% etanol til røret og bland av vortexing for 15 s.
- Legge til ca 600 µL av lysate i kolonnen spinn (fra kit).
- Sentrifuger i 1 minutt på 8000 x g. Kast strømme gjennom.
- Gjenta trinn 6.12 til alle lysate er trukket gjennom kolonnen.
- Plass kolonnen i en ny samling rør. Legg til 500 µL AW1 buffer og sentrifuger 8000 x g i 1 minutt.
- Kast flyten gjennom. Legg til 500 µL AW2 buffer og sentrifuger 8000 x g i 3 minutter.
- Forkast flyten gjennom og sentrifuge kolonnen i en tom samling rør 8000 x g i 3 minutter.
- Overføre kolonnen til DNA elueringsrør. Legg til 60 µL PCR klasse ultrapure vann direkte på membranen og ruge i 2 minutter ved romtemperatur.
- Bruke forvarmes tilsettes vannet på 37 ° C til elute. Tilsettes kan gjøres to ganger av bruker halve siste elueringsrør volumet og gjenta trinn 6.15 to ganger for å øke avkastningen.
- Sentrifuger i 1 minutt på 8000 x g til elute DNA.
- Måle konsentrasjonen av DNA elut med metoden ønsket kvantifisering. Utvinning prosessen gir er mellom 10-40 ng/µL DNA.
- Lagre eluted DNA på 20 ° C.
7. qPCR installasjon
- PCR forhold
- Slå på maskinen og laste inn programmet i tabell 1 i en sanntid qPCR maskin.
- Gjenta trinn 3 til 5 i tabell 1 for 40 sykluser og holde prøven på 4 ° C på slutten av reaksjonen.
- PCR eksperimentelle oppsett
- Bruk grunning og temperaturen i tabell 2. Bruk konsentrasjoner og reaksjonen forhold finnes i tabell 3. Definere hver reaksjon i tre eksemplarer kontroll for fremgangsmåter for variasjon.
- Plass PCR reaksjon rør/platen i qPCR systemet og kjøre programmet lastet inn i systemet fra trinn 7.1.
- Fjerne røret på slutten av kjøringen, plassere den på 4 ° C og forberede gel lasting.
8. kvantifisering av LP kolonisering
- Forberede qPCR mikser 10 µL eller 20 µL reaksjoner ifølge tabell 3.
- LP genomisk DNA standardkurve 107 til 101 Kopier/µL
Merk: Siden 4 µL av hver fortynning vil være belagt, 107 eksemplarer i 4 µL eller 2,5 ganger 106 eksemplarer per µL kreves i Start lager. Bruk samme prinsipp for resten av kurven.- Forberede en 1:4 fortynning: 107 eksemplarer per µL i 50 µL.
3.147 µL LPDNA + 46.85 µL av dH2O = 2,5 x 106 eksemplarer per µL - Serielt fortynne 10-fold: legge til 5 µL 45 µL dH2O for 1,25 x 105 Kopier/µL.
- Plate 4 µL per fortynning per brønn.
- Forberede en 1:4 fortynning: 107 eksemplarer per µL i 50 µL.
- Visualisering av LP amplicons
- Bruke en 2% agarose gel for å nå et klart skille mellom den ~ 197 bp LP forsterket fragment.
- Last 9 µL av hvert PCR produkt i gel.
- Kjør gel i 30 minutter ved 120 V.
Representative Results
Unikheten med denne metoden hviler i tilpasningen av gavaging teknikken størrelsen og skrøpelighet neonatal museklikk. Forrige avsnitt beskrives de viktige trinnene i å utføre en vellykket gavage fremgangsmåte DOL 2 mus. For å etablere en god kvantifisering skala, ble en standardkurve generert med ren LP DNA med tre tekniske replikat (figur 2). Standardkurven gitt et dynamisk område av deteksjon av LP DNA bruker primerne. Dynamikkområdet var mellom 7 og 28 sykluser der en rekke 101 til 107 eksemplarer av LP DNA ble oppdaget. Jevn skråningen av standardkurve representert effektivitet og skalerbarhet av reaksjonen.
Prosedyren for IE gavage har blitt brukt i voksen mus med relativ letthet. Men øvre gastrointestinal skrift neonatal museklikk er skjør og nødvendige kalibrert bevegelser av gavage p under prosedyren. Gjentatte gavages kan øke sjansene for intra-esophageal hudirritasjon, skader og dårlig eller avvisning av demningen på grunn av behandlingen. Dermed to forskjellige gavaging tidsplaner ble testet og intestinal koloniseringen ble kvantifisert med DNA fra hele tarmen homogenates. Mus var gavaged DOL 2 til DOL 8 med probiotiske administrert hver dag eller hver to dager (Figur 3). Hvert utvalg inneholdt en teknisk replikere og hver tilstand hadde minst to biologiske gjentak. Valpene gavaged hadde hver dag med 7 doser rundt 103 eksemplarer av LP mens pups gavaged hver to dager med 4 doser hadde rundt 105 eksemplarer. Konsistensen av resultater mellom gjentak legge kreditt på presisjon for teknikk. Det var flere LP oppdaget i tarmen av pups gavaged hver to dager med pups det var gavaged hver dag. Gitt dette, ble etterfølgende eksperimenter satt opp i et gavage annenhver dag som også reduserer stress for pups.
Det er viktig å unngå intra-kull probiotiske cross forurensning når du arbeider med probiotika. Microbiome av littermates var forventet å være lik som de deler samme mor og hekkende miljø. Dette beviser et problem for probiotiske studier om behandling og kontroll forholdene var til stede i det likt søppel som probiotiske organismen har potensial til å bli en del av bakterieflora ("kolonisering spre"). For å avgjøre hvis en probiotiske vil forurense og kolonisere ubehandlet littermates, halvparten av en søppel var gavaged som ovenfor og tarmen ble samlet inn for qPCR. Intestinal qPCR analyse av DOL 10 mus viste forventet forsterkning av LP DNA i gavaged mus, men også i mindre grad i de ikke-gavaged littermates (Figur 4). Tarmen av samme DOL mus fra en ubehandlet cage viste ingen forsterkning eller minimal forsterkning på sykluser større enn 32. Dette gitt bevis for felles deling av microbiome i en søppel in en bur. Dermed for eksperimenter med probiotika skal behandling gruppene skilles med bur å kontrollere for variasjon gjennom cross forurensning. Bruk av foster dammer kan betraktes hvis et eksperiment er defineres innenfor en søppel-innstilling, men forvirrer effekter som redusert omsorg fra foster dammen og avvisning burde bli evaluert og optimalisert for. Når mus gavaged til DOL 8 ble etterlatt ubehandlet i seks dager og intestinal DNA ble analysert DOL 14, fant ca 10 kopier av LP (figur 5). Dermed koloniseringen av LP ble funnet for å være forbigående og synlig befolkningen redusert over tid.
Figur 1 . Måle lengden mellom xiphoid prosessen (nedre enden av sternum) og snute å gjøre maksimal innsetting merking etter nålen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Standardkurven som er opprettet ved hjelp av LP primere og ATCC LP DNA. En seriell fortynning av ATCC LP DNA ble gjort å etablere synlig dynamikkområdet for primere brukt i studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . LP forsterkning av intestinal DNA fra DOL 10 pups behandlet mellom DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser) og annenhver dag (4 doser). Gavaging annenhver dag viste høyere intestinal LP med gavaging hver dag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . LP forsterkning av intestinal DNA fra DOL 10 pups med 2 behandlet og 2 ubehandlet inne en søppel av 4 pups. Gavage var mellom DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser). To probiotiske behandlet pups Vis forventede forsterkning profilen. Ubehandlet valpene viser variabel forsterkning av LP indikerer felles deling av probiotiske organismen i en søppel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . LP forsterkning av intestinal DNA fra DOL 14 pups behandlet mellom DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser) og annenhver dag (4 doser). LP lasten faller under syklus 28 angir klarering av LP i løpet av 6 dager legge siste probiotiske gavage. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temperatur | Tid |
| 1 | 50 ° C | 2 minutter |
| 2 | 95 ° C | 3 minutter |
| 3 | 95 ° C | 30 sekunder |
| 4 | 58 ° C | 30 sekunder |
| 5 | 72 ° C | 30 sekunder |
Tabell 1. qPCR forsterkning forhold. Temperatur og antall syklus forholdene for PCR reaksjonen.
| Mål | 16S-23S intergenisk spacer regionen |
| Forventet fragment størrelse | 144 bp |
| Primer Tm | 58˚C |
| Fremover primer (FP) | LPN-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| Omvendt primer (RP) | LPN-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA |
Tabell 2. Detaljer av komponenter av qPCR reaksjonen. Detaljene på primere, deres annealing temperatur og forventet fragment størrelse i PCR reaksjonen.
| Konsentrasjon | 10 µL reaksjon | 20 µL reaksjon | |
| Malen DNA | 200 pg/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| SYBR Master Mix | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| RP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8,8 ΜL |
Tabell 3. Per reaksjon volumer og konsentrasjoner. Konsentrasjonen av reagenser og volumer for reaksjoner.
Discussion
Prosedyren for IE gavage ble utviklet å trygt administrere en bestemt dose av en probiotiske neonatal mus. Små mengder av væske leveres til øvre gastrointestinal skrift bruker en fôring nål for å hindre aspirasjon samtidig sikre levering av dosering i tillit. Tarmen av mus ble samlet inn for kolonisering analyse to og seks dager legge gavage. Prosedyren for DNA utvinning ble endret for å sikre høy avkastning av probiotiske Gram-positive organismen. QPCR analyse av DNA utdraget to dager innlegg siste gavage viste relativt høyere kolonisering av LP i mus gavaged hver to dager i forhold til mus gavaged hver dag mellom DOL 2-8. Det var også en nedgang i LP over seks dager, viser denne probiotiske å være en forbigående organisme i tarmen av musen. Resultatene av disse eksperimentene etablere betingelsene for å forske med høy fasthet i denne aldersgruppen.
For å observere de langsiktige effektene av probiotika i neonatal mus, ble det administrert til neonatal mus på DOL 2; en lignende starttidspunktet pek menneskelige rettssaken. Orofaryngeal fôring neonatal mus er beskrevet tidligere i litteratur og er utført etter DOL 5-812,17 når risikoen for aspirasjon er lavere på grunn av en godt utviklet svelge mekanikk. Men er orofaryngeal mate ikke godt egnet for DOL 2 mus som høyere priser av aspirasjon ble observert i pilotstudien (data ikke vist). Tyktflytende slags probiotiske og prebiotiske løsning lagt til risikoen for aspirasjon. Fremgangsmåten IE gavaging minimert risikoen for aspirasjon i DOL 2 mus mens levere ønsket volum direkte til øvre gastrointestinal skrift. Suksessen til prosedyren ble først bekreftet bruker konditorfarge infundert probiotiske gavage. Konditorfarge fungerer som en markør som vises gjennom huden av valp. Ingen negative effekter ble observert i mus gavaged med konditorfarge, og det anbefales å validere gavaging prosedyren på denne måten før du setter store eksperimenter. Rask løsning på de gisper reflex sett innlegg gavage kan også brukes som en ytterligere indikator for en vellykket gavage. Når musen er plassert på den varme teppet etter gavage, det gisper refleks vil avta og en økning i puste frekvensen vil bli observert innen 20 sekunder. Videreføring av den gisper refleks i mer enn 30 sekunder indikerer en mislykket gavage. Vellykket gavage avhenger også riktig innsetting av fôring nålen med pære sitter rett over åpningen av cardiac sphincter av magen. Dette kan ordnes ved å sikre at merkingen på pinne måle lengden mellom xiphoid prosessen og spissen av snuten, ikke gå forbi snuten av musen under gavage. Dette minimerer sjansen for skade på musen. Frekvensen for gavage kan ha en betydelig innvirkning på de eksperimentelle resultatene. Hyppige gavaging kan også opprette mer stress for valpene og mor på grunn av konstant forstyrrelsene buret og reiret. Den mest optimale gavage planen er når gavages er den minste hyppige og over en kortere varighet av tid uten å miste den forventede effekten i systemet. For å sikre sikkerhet og sterilitet prosedyren gavage må p steriliseres ved vask og autoklavering mellom bruk. Vask grundig på utenfor hjelp en skrubb og innsiden av presser vann gjennom nålen bruker en sprøyte før autoklavering er nødvendig som noen leftover partikler kan encrust på p under autoklavering kan forstyrre gavaging prosedyren.
Høyere LP kolonisering ble observert i pups det var gavaged annenhver dag sammenlignet pups gavaged hver dag. Dette kan skyldes redusert stress på pups gavaged annenhver dag og potensielt probiotiske får mer næringsstoffer gjennom relativt mer melk ingested av disse valpene. Dose avhengighet av probiotiske behandlingen har vært tidligere studert i musen modeller18,19 og dermed av riktig dosering er viktig. Probiotiske løsningen forberedt er belagt før alle gavage å få et nøyaktig antall CFU administrert. Hvis probiotiske organismen er anaerob, er det viktig å se hvis det er forskjell i CFU når kultivert din aerobt eller anaerob. Siden LP er en facultative anaerobe, det ble kultivert med både metoder og ingen forskjell i CFU ble observert.
Innlegg gavage intestinal LP Last analysen ble gjort ved hjelp av qPCR og høy kvalitet DNA-prøver. For å minimere LP DNA forurensning mellom behandling og kontroll grupper, ulike fôring nåler, biosafety skap og kirurgisk utstyr ble brukt for å sikre høyest kvalitet prøver. Nøyaktig måling av probiotiske i tarmen nødvendig en optimalisert DNA utvinning metoden. Mest effektive metoder for utvinning av DNA fra avføring innebærer flere perle slo trinnene20,21,22. Denne metoden var adoptert for utvinning av tarmbakterier bruker perle juling og observert redusert representasjon (< 102 Kopier gjenopprettet) av LP i hele tarmen DNA utvinning. LP er en Gram positiv organisme med en betydelig mengde Peptidoglykan i celleveggen, var protokollen optimalisert med en Peptidoglykan oppløsning trinn bruker lysozyme23,24 lagt til enzymatisk lyseringsbuffer. Dette økt representasjon av LP i samme intestinal utvalget av større enn to ganger. Lysozyme behandling sikrer oppløsningen av det ytterste laget mens perlen slo trinn forenkler lysis av organismen. Optimalisering av mengden vev, av garnet perle og varigheten av avbrudd med perler er nødvendig for å oppnå optimal DNA produkter å gjennomføre PCR analysen.
Den positive virkningen av probiotika administrert som profylakse eller behandling i pre-term og sikt nyfødte er dokumentert i nyere studier25,26,27,28. Etablering av en skikkelig neonatal musemodell for Probiotika er garantert for å pakke beskyttende effekten av probiotika. Denne protokollen skissert her representerer en støttelinje for forskere ukjent neonatal musen arbeidet med probiotika. Til tross for problemene med gnager bakterieflora mens han studerte helse og sykdom, kan denne metoden utvides til forskning fokusert på å forstå endringene av microbiome på grunn av probiotika. Denne modellen gir også en plattform for å studere vert-mikrobe samhandling og immunreaksjoner i løpet av ulike utviklingsstadier.
Disclosures
Ingen interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
Takk til dyr omsorg anlegget ansatte og UBC veterinærer for opplæring og bistå i musen fungerer ved BC Children's Hospital Research Institute. Takk til University of British Columbia og Institutt for eksperimentell medisin for finansiering studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
