Summary
Denne undersøgelse beskriver i detaljer processen af gavaging præcise mængder af probiotika til neonatal mus. Den eksperimentelle set-up var optimeret til at omfatte, men er ikke begrænset til probiotiske dosering, metoder til administration og kvantificering af bakterier i tarmene.
Abstract
Voksen musemodeller har været udbredt at forstå mekanismen bag sygdomsprogression hos mennesker. Anvendeligheden af undersøgelser udført i voksen musemodeller til neonatal sygdomme er begrænset. For bedre at forstå sygdomsprogression, vært svar og langsigtede virkninger af interventioner i nyfødte, er en neonatal musemodel sandsynligvis en bedre pasform. Den sparsomme brug af neonatal musemodeller kan delvis tilskrives de tekniske vanskeligheder med at arbejde med disse små dyr. En neonatal musemodel blev udviklet til at fastlægge virkningerne af probiotiske administration tidligt i livet og især vurdere muligheden for at etablere kolonisering i nyfødte mus og tarmkanal. Specifikt, for at vurdere probiotiske kolonisering i neonatal musen, blev Lactobacillus plantarum (LP) leveret direkte i neonatal mus mave-tarmkanalen. Med henblik herpå, blev LP administreret til mus ved at fodre gennem intra-spiserøret (IE) sonde. En yderst reproducerbar metode blev udviklet til at standardisere processen med IE sonde, der tillader en præcis administration af probiotiske doser samtidig minimere traumer, et aspekt særlig vigtigt givet skrøbelighed af nyfødte mus. Begrænsninger af denne proces omfatte mulighederne for esophageal irritation eller skade og aspiration hvis gavaged forkert. Denne tilgang repræsenterer en forbedring af nuværende praksis, fordi IE sonde i distale spiserøret reducerer risikoen for aspiration. Efter sonde, var profilen kolonisering af probiotiske spores ved hjælp af kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) af den udpakkede intestinal DNA med LP specifikke primere. Forskellige kuld indstillinger og bur management teknikker blev brugt til at vurdere potentialet for kolonisering-spredning. Protokollen detaljer snørklede af IE neonatal mus sonde og efterfølgende kolonisering kvantificering med LP.
Introduction
Hos spædbørn, har tidlig probiotiske eksponering været forbundet med immunmodulerende effekt fører til reduceret forekomst af sygdomme som nekrotiserende enterocolitis, atopisk dermatitis og sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bag denne immunmodulerende svar er udfordrende for at udforske givet begrænsning til prøvetagning i nyfødte menneskelige forsøg (dvs., sekventiel blod trækker og biopsier). Neonatal musemodeller kan hjælpe studere virkningsmekanismen involveret i neonatal immunsystemet forordning forbundet med probiotiske brug og ændringer i den tarmens mikrobiota. Desværre, de fleste musemodeller for probiotika har i vid udstrækning fokuseret på voksne mus; men virkningen af probiotika er tilbøjelige til at være højest tidligt i livet, tyder på modeller, der er specifikke for denne aldersgruppe vil være nyttigt3,6. Derudover er neonatal musemodeller bedre egnet til at studere sygdomme og interventioner, som de forventes at mere nøje efterligne en udvikle immun og mikrobielle system7,8 bestemt til anvendelse i tidlige liv i menneskelige spædbørn ,9,10. Formålet var at undersøge omfanget og mønstre af probiotiske kolonisering af neonatal mus med fokus på de mekanistiske samspillet mellem vært og dens microbiome. Passende beskrivelser af nyfødte modeller blev ikke fundet i litteraturen, og dermed et behov for udvikling af robuste og standardiseret metode blev behandlet.
Etablerede metoder til oral administration af forskellige forbindelser til nyfødte mus omfatter maternel overførsel af ønskede forbindelser gennem mælk ved behandling af vandkilde for gravide dæmninger11 eller bruge fodring nåle til at lette administrationen af ønskede forbindelser i oropharynx12. Disse metoder er nyttige for eksperimenter der ikke har præcis dosering krav og hvor behandlingen er let indtages af den modtagende mus. Probiotika er ofte administreres sammen med en prebiotiske såsom galactooligosaccharide og fructooligosaccharide (FOS), der tjener som en kilde til ernæring for probiotiske bakterier; disse tilsætningsstoffer forbindelser gør løsningen tyktflydende og udfordrende at administrere via de ovennævnte metoder. Udtænke en metode til at administrere præcise mængder af probiotika og prebiotics til nyfødte mus starter så tidligt som den første dag i livet (DOL) var nødvendigt. Ved at udvikle sonde teknik, muligheden for kolonisering-spredning (som observeret i andre probiotiske undersøgelser mellem behandling og kontrol arme13,14,15,16) blev testet og den relative forekomst af koloniseret Lactobacillus plantarum (LP) i tarmene af unger med forskellige sonde tidsplaner blev vurderet. Probiotiske forberedelse af forsøgsdyr bestod af 109 kolonidannende enheder (CFU) pr. sonde af LP (ATCC-202195 stamme), blandet med FOS (prebiotiske) og maltodextrin (hjælpestof) som beskrevet i den seneste menneskelige forsøg3. Probiotiske levering blev udført ved hjælp af IE sonde og processen er udførligt beskrevet i protokollen nedenfor. Profilen kolonisering af probiotiske blev evalueret ved hjælp af realtid forstærkning af DNA ekstraheret fra hele tarmen ved hjælp af LP specifikke primere.
Protocol
Alle procedurer blev foretaget vedrørende retningslinier som hjælpepersonale på dyrs pleje facilitet på University of British Columbia og alle procedurer blev godkendt af UBC dyr efterbehandling udvalget.
1. kvantificering af probiotika administreres
Bemærk: Dette trin anbefales at bestemme den nøjagtige mængde af probiotiske CFU, der kan administreres i en enkelt dosis. Mængden af probiotika og køretøj (FOS og maltodextrin) fastsætter mætning af løsningen. Fra erfaring, ikke mere end 30 µL (~ 20 mL / kg) af væske, kan administreres til mus på DOL 2 som nogen større volumen øger risiko for aspiration.
- Forberede seks 1,5 mL microcentrifuge rør for serielle fortyndinger med hver tube indeholder 180 µL sterilt 5% dextrose saltvand.
- Vejer en 0,2 g alikvot af en probiotisk-prebiotiske blanding og opløse den i 1 mL 5% dextrose saltvand i et sterilt måde.
- Vortex for 30 sekunder og pipette til at bryde klumper. Gentag indtil ingen synlige klumper er observeret.
Bemærk: Maltodextrin gør løsningen tyktflydende og bidrage til løsningen mætning. - Udføre en seriel fortynding ved hjælp af rør forberedt i trin 1.1. Vortex at blande.
- Plade 40 µL af hver fortynding på en mærket kvadrant af MRS agar plade. Plade hver fortynding i to eksemplarer.
- Inkuber under anaerobe (eller microaerophilic) betingelser ved 37 ° C for 48 h i et tomrum krukke bruger en pakke med gas.
- Tæl hver plade inden for en række 20-70 kolonier pr. kvadrant. Gennemsnitlige plade tæller med den samme fortynding og beregne tilbage til de ønskede enheder.
2. forberedelse af probiotika og prebiotics til sonde
Bemærk: Korrekt opløsning af probiotiske og prebiotiske er nødvendigt at sikre den glatte indsprøjtning af væske gennem fodring nålen under sonde.
- Kombinere den nødvendige mængde af frysetørrede probiotiske organisme med de ønskede mængder af prebiotics og køretøj i en steril microcentrifuge tube.
- Tilføj passende mængder opløsningsmiddel (5% dextrose saltvand) til at opløse den probiotiske-prebiotiske blanding.
Bemærk: Kapaciteten i opløsning er begrænset af den prebiotiske og køretøjet anvendes. Fra erfaring nåede synbiotic kombinationen (med FOS og maltodextrin) mætning på ca. 0,3 g/mL mens opløse i et 2 mL microcentrifuge rør med 1 mL opløsningsmiddel. - Vortex at bland indtil alle faste stoffer er opløst. Bruge en pipette til at bryde op globules af faste partikler i opløsningsmidlet af pipettering op og ned.
- Inkuber løsning i et 37 ° C vandbad i 20 min.
Bemærk: Dette trin kan springes over hvis de probiotiske-prebiotiske løsning er oprettet fra en levende kultur. - Plade en fem serie 10-fold fortynding på MRS agar plader før sonde til nøjagtigt kvantificere probiotiske gives til pup. Kan springes over dette trin, hvis nøjagtige CFU optællingen ikke er nødvendig.
3. forberedelse af biosikkerhed kabinet
- Bruge en biosikkerhed fryser når du arbejder med probiotika til at vedligeholde aseptisk teknik. Indstille bur med dæmninger og unger på en varme tæppe (sæt til ca 38 ° C) på den ene halvdel af tæppet. Placer en ren, Tom dyrs bur på anden halvdelen af det varme tæppe.
- Sted en desinficeres eller sterile, absorberende pad på den varme tæppe til har tendens til at musen under sonde.
- Indsamle redemateriale for hvalpene fra toppen af den eksisterende, dam-lavet reden og oprette en ny konisk nesting cup med behandskede hænder, desinficeres med 70% ethanol og tørres. Placere denne nye reden i ren, tomme bedrift bur. Dette letter overførslen af duften af reden til de behandskede hænder og dermed minimerer indførelsen af andre dufte på pup mens håndtering dem under proceduren, at reducere risikoen for cannibalization.
- Flytte hvalpene ind i konisk reden holding bur og fjerne bur med dæmningen fra kabinettet. Dette mindsker stress for dæmningen ved at forhindre det fra høre hvalpene under proceduren.
Bemærk: Hvis probiotiske er en kendt kolonisator af murine tarmene, behandling betingelser skal være adskilt af bure eller endda forskellige biosikkerhed kabinetter for at undgå muligheden for kryds kolonisering.
4. Intra-esophageal sonde af neonatal mus
- Åbne sprøjten emballage for nem adgang. Åbn pakning af nålen i en steril måde og knytte den til lederen af sprøjten. Vask nålen med 70% ethanol og autoklave før proceduren. Bruge forskellige sæt af nåle til behandling og kontrolgruppen til at undgå forurening.
- Trække lidt mere end den ønskede mængde af probiotiske-dye løsning ind i sprøjten. Hold sprøjten opad. Derefter trække yderligere og svirp med fingeren til at løsne bobler og skubbe på stemplet til at udvise bobler og den ekstra flydende volumen, indtil den ønskede lydstyrke er nået. Dette sikrer, at der er ingen luftrum i nålen. For DOL 2 mus, må mængden af sonde ikke overstige 30 µL.
- Placer pup på sterile absorberende puden på toppen af den hede afrivningsblok. Bruge fodring nålen (24 Gauge, 1" nålen længde, 1,25 mm kugle diameter) eksternt til at måle længden af spiserøret ved at placere bolden af nålen lige under formet som et sværd proces (nederste ende af brystbenet). Markere nål på niveau med snude at bemærke grænsen for indsættelse af nål (figur 1). Observere pup for sundhed tegn, som omfatter regelmæssig vejrtrækning og pink farvning af huden.
- Dyppe spidsen af nålen i dypper opløsningsmidlet (5% dextrose saltvand eller -mediet bruges til at opløse probiotiske og pre biotiske) at smøre de udvendige flader af fodring nålen. Dette letter den glatte indtastning af nålen ind i spiserøret af musen.
- Løft pup ved harmoniske eller ved forsigtigt holde hoved og krop mellem tommel- og pegefinger. Sikre hoved, hals og krop er holdt i en lige position. Hold ikke hvalpen af harmoniske for længere end 60 s da der er en risiko for obstruktion af luftrøret fører til kvælning. Sikre pup kan ånde. Tegn på scruffing for hårdt kan omfatte manglende evne til at trække vejret, betydelig gispende og tungen forlænget ud af munden. Overvåge pup farve og vejrtrækning under hele proceduren.
- Indsæt pære af nålen ind i midten af munden på hvalp i en 45° vinkel symmetriplan i torso, indtil den når bagsiden af halsen.
- Ændre forsigtigt vinklen på nålen ved at dreje på pære af nålen og flytte sprøjten væk fra gavaging personen (mod den dorsale side af pup) indtil det er parallelt med den pup rygsøjlen. Scruffing pup hjælper med at holde nålen på plads på bagsiden af halsen, og forhindrer også, at musen vrider. Sørg for bolden af nålen ikke forskud eller lægge noget pres mod bagsiden af halsen under ændringen af vinkel.
- Hvis musen, forsøger at sluge nålen, lade det naturligt glide nedad og anholde bevægelsen, når mærkningen på nålen flugter med snuden. Sprøjte og kanyle er normalt tunge nok til at glide ned due til tyngdekraften. Understøttelse af nålen vægt på alle tidspunkter så nålen glider let ned i spiserøret med ingen pristrykket fra den person, der udoever sonde.
- Hvis nålen møder modstand på bagsiden af halsen, trække sonde nålen lidt til dislodge bolden af nål og re vinkel nålen inde i munden mod venstre mus (Handlerens højre) langsomt i små, 1 mm-trin. Nålen skal begynde at glide let ned i spiserøret.
- Hvis nålen stopper før mærkning på nål når munden, Injicér ikke løsningen.
- Opbevar ikke nålen indsat for mere end 20 s. Hvis dette sker, trække nålen langsomt mens du holder sprøjten parallel til torso og lad pup hvile på et stykke køkkenrulle for 30 s til 1 min. Prøv gavaging igen efter smøre den udvendige overflade af nålen med opløsningsmiddel.
Bemærk: Anæstesi anvendes ikke til proceduren, som muss svar er nødvendigt at måle succesen af sonde.
- Når mærkningen på fodring nålen er over snuden og på linje med spidsen af snuden, lad ikke nålen bevæge sig eller fremme nogen yderligere. Langsomt injicere den ønskede mængde væske. Hvis væsken er indsugning eller observeret at boble gennem næsen, stoppe indsprøjtningen umiddelbart og langsomt trække nålen.
- Placer pup oprejst på køkkenrulle på varmepude til støtte i dens inddrivelse. Nøje overvåge for fortsatte vejrtrækningsproblemer eller ændring i farve af den pup, der viser aspiration. Aflive unger, der har indsugning straks.
- Når sonde er færdig, forsigtigt trække fodring nålen i den samme vinkel, det blev indsat. Placer pup på køkkenrulle på den varmede varmepude. Vent 10 s for pup at genvinde normal aktivitet og vejrtrækningsmønster. En sund pink nuance skal vises over den pup krop og farvestoffet bør kun ses i maven rum. Flytte det tilbage til buret med de andre unger.
Bemærk: Gavaging blå frugtfarve er en glimrende måde at praktisere den procedure, der er skitseret ovenfor. Hvis sonde er vellykket, vil maven af musen ses som en blå farvetone. Hvis det blå farvestof er fundet uden for maven af hvalp (hals, bryst eller aksillær region), bør dyret humant aflives (efter dyrs pleje regler), som angiver en Bristning af spiserøret eller aspiration.
5. opkrævning af intestional prøver for kolonisering analyse
- Under efterfølgende overvågning eller gavaging, skal du indsamle fækal microbiome prøver fra hvalpene.
Bemærk: Pup ofte tisser og defecates når gavaged og denne gang kan bruges som en mulighed for at indsamle de fækal prøver til microbiome analyse. - For opsigelse af eksperimenter, skal du indsamle tarmene fra duodenum til rektum efter eutanasi af hvalpene. PIN pup en kirurgisk bord og Desinficer huden med 70% ethanol. Skåret væk i huden i fire kvadranter uden at beskadige den peritoneale lag ved hjælp af værktøjer steriliseret med 70% ethanol og en varm perle sterilisation ved 250 ° C.
- Bruge et andet sæt af sterile redskaber til at skære bughinden i fire kvadranter og flytte det væk fra centrum på en måde, at de viscerale organer er udsat.
- Find maven og bruge en klemme til knivspids nedenfor pylorus sphincter og for enden af endetarmen. Køre længden af tarmen ved hjælp af en stump værktøj eller pincet til at strømline tarmen og frigøre det fra bindevæv og mesenteriallymfeknuderne væv. Når hele længden af tarmen er blevet løsladt af bindevæv, skåret i fastspændt enderne.
- Markere aluminiumsfolie med orientering af tarmen, wrap på en sikker måde og fryse ved-80 ° C.
Bemærk: Ekstraktionsmetode DNA kan udføres på dette tidspunkt uden frysning. Det blå farvestof blev også set at passere igennem tarmen over 24 h og indsamling af prøver for kolonisering analyse er bedst, når tarmene er indsamlet mindst 24 timer efter den sidste sonde. Signaler kan blive forstærket før dette tidspunkt af ikke-overholdt bakterier forbigående passerer gennem sonde blanding.
6. DNA-ekstraktion fra tarmene til kolonisering analyse
Bemærk: DNA-ekstraktion er gjort ved hjælp af en kommerciel kit med optimering af ændringer foretaget i protokollen for den tarmen DNA-ekstraktion. Sikre at opvarmningsapparatet er indstillet til den ønskede temperatur og de løsninger, der kræver ændringer eller pre opvarmning tilberedes korrekt.
- Forberede enzymatisk Lysis Buffer (ELB) som følger: gør en løsning med 20 mM Tris-Cl, 2 mM natrium EDTA og 1,2% Triton X-100. Justeres til pH 8,0. Umiddelbart før du bruger ELB, tilføje lysozym til en endelig koncentration på 20 mg/mL.
- Pre veje granat perle rør på Analysevægt med lågene fjernes.
Bemærk: Dette er gjort så at hvis den krævede vægt er overskrides, er det lettere at fjerne tarmindhold. - Skær tarmen i små segmenter ved hjælp af et sterilt engangs skalpel og øse de ønskede segmenter i pre vejes granat perle rør.
Bemærk: Sørg for at ændre skalpeller mellem hver prøve som DNA er allestedsnærværende og kan påvirke PCR resultater. - Der tilsættes 1 mL af ELB med lysozym (fra trin 6.1) til hver tube, sted på vortexing perle tæppebanker og Kør på maksimalt indstilling (14) i 5 minutter.
- Når vævet er afbrudt, overføre rør til 37° C vandbad og Inkuber i 30 minutter.
Bemærk: Dette trin er gjort for at aktivere lysozym og fremkalde fordelingen af cellevæggen peptidoglycan af gram-positive bakterier. - Forberede hver prøve ved en koncentration på 600 mAU pr. mL rør med 20 µL af Proteinase K.
- Der centrifugeres rør på 400 x g i 10 minutter. Den lysate skal se klar med nogle væv rester på toppen af perlerne.
- Overføre 180 µL af supernatanten (den øverste fase) ind i et rør, der indeholder Proteinase K og derefter tilføje 200 µL af AL buffer til glasset. Vortex for 15 s at blande.
- Sted rør på den varme blok ved 56 ° C i 10 minutter.
- Tilføje 200 µL af 100% ethanol til røret og mix af vortexing for 15 s.
- Tilføje ca 600 µL af lysate til kolonnen spin (fra kit).
- Der centrifugeres i 1 minut ved 8.000 x g. Kassér gennemstrømningen.
- Gentag trin 6.12 indtil alle lysate er blevet trukket gennem kolonnen.
- Placer kolonnen i en ny collection tube. Tilføje 500 µL af AW1 buffer, og der centrifugeres ved 8.000 x g i 1 minut.
- Kassér flow gennem. Tilføje 500 µL af AW2 buffer, og der centrifugeres ved 8.000 x g i 3 min.
- Kassér flow gennem og centrifugeres kolonnen i en tom collection tube på 8.000 x g i 3 min.
- Overfør kolonnen til DNA eluering tube. Tilsættes 60 µL PCR grade ultrarent vand direkte på membranen og der inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Bruge pre varmede eluering vand ved 37 ° C at eluere. Eluering kan ske to gange af benytter halvdelen den endelige eluering volumen og gentage trin 6.15 to gange for at øge udbyttet.
- Der centrifugeres i 1 minut ved 8.000 x g at eluere DNA.
- Mål koncentrationen af DNA elueres ved hjælp af metoden ønskede kvantificering. Udvinding proces udbytter er i rækken af 10-40 ng/µL DNA.
- Butik eluted DNA ved-20 ° C.
7. qPCR setup
- PCR betingelser
- Tænd maskinen og indlæse programmet i tabel 1 i en realtid qPCR maskine.
- Gentag trin 3 til 5 i tabel 1 til 40 cykler og holde prøven ved 4 ° C for enden af reaktionen.
- PCR eksperimentel opsætning
- Bruge primere og temperatur fundet i tabel 2. Bruge koncentrationer og reaktionsbetingelser findes i tabel 3. Konfigurer hver reaktion i tre eksemplarer til kontrol for proceduremæssige variation.
- PCR reaktion rør/pladen anbringes i qPCR system og Kør programmet indlæses i systemet fra trin 7.1.
- Fjerne rør for enden af flugt, placere den på 4 ° C og forberede gel ladning.
8. kvantificering af LP kolonisering
- Forberede qPCR blander 10 µL eller 20 µL reaktioner i henhold til tabel 3.
- LP genomisk DNA standardkurven 107 til 101 kopier/µL
Bemærk: Da 4 µL af hver fortynding vil være forgyldt, kræves 107 eksemplarer i 4 µL eller 2,5 x 106 eksemplarer pr. µL i udgangspunktet bestanden. Bruge samme princip for resten af kurven.- Forberede et 1:4 fortynding: 107 eksemplarer pr. µL i 50 µL.
3.147 µL af LPDNA + 46.85 µL af dH2O = 2,5 x 106 eksemplarer pr. µL - Seriefremstillede fortyndes 10-fold: Tilsæt 5 µL til 45 µL dH2O til 1.25 x 105 kopier/µL.
- Plade 4 µL pr. fortynding pr. brønd.
- Forberede et 1:4 fortynding: 107 eksemplarer pr. µL i 50 µL.
- Visualisering af LP amplikoner
- Bruge en 2%-agarosegel at nå frem til en klar adskillelse af de ~ 197 bp LP forstærket fragment.
- Indlæse 9 µL af hver PCR produkt i gelen.
- Kør gelen i 30 minutter ved 120 V.
Representative Results
Unikke ved denne metode hviler i sin tilpasning af gavaging teknikken til størrelsen og skrøbelighed af en neonatal mus. Forrige afsnit beskrives de vigtige skridt i gennemførelsen af en vellykket sonde procedure på en DOL 2 mus. For at etablere en god kvantificering skala, var en standardkurve genereret ved hjælp af ren LP DNA med tre tekniske flergangsbestemmelser (figur 2). Standardkurven leveres et dynamisk udvalg af påvisning af LP-DNA ved hjælp af primere. Det dynamiske område var mellem 7 og 28 cyklusser, hvor en række 101 til 107 eksemplarer af LP DNA var opdaget. Den stabile hældningen af standardkurven repræsenteret effektiviteten og skalerbarhed af reaktionen.
Proceduren for IE sonde er blevet brugt i voksen mus med relativ lethed. Dog den øvre mave-tarmkanalen af en neonatal mus er skrøbelige og krævede kalibreret bevægelser af en mavesonde nål under proceduren. Gentagne gavages kunne øge chancerne for intra-esophageal irritation, skade og svigt eller afvisning af dam på grund af håndtering. Således to forskellige gavaging skemaer blev testet og den intestinale kolonisering var kvantificeres ved hjælp af DNA fra hele tarmen homogeniseret. Mus blev gavaged fra DOL 2 gennem DOL 8 med probiotiske administreret hver dag eller hver to dage (figur 3). Hver prøve indeholdt en teknisk replikat og hver tilstand havde mindst to biologiske replikater. Hvalpe gavaged havde hver dag med 7 doser omkring 103 kopier af LP, mens PUP'er gavaged hver to dage med 4 doser havde omkring 105 eksemplarer. Sammenhængen i resultaterne mellem replikater tilføje kredit til præcisionen af teknik. Der var flere LP opdaget i tarmene af unger gavaged hver to dage i forhold til unger, der var gavaged hver dag. I betragtning af dette, blev efterfølgende forsøg sat op med en sonde tidsplan for hver anden dag som det også reducerer stress til hvalpene.
Det er vigtigt at undgå intra-kuld probiotiske krydskontaminering, når du arbejder med probiotika. Microbiome af littermates forventedes at være den samme som de deler den samme mor og nesting miljø. Det viser et problem for probiotiske undersøgelser, hvis behandling og kontrol betingelserne var til stede inden for den samme kuld som probiotiske organisme har potentiale til at blive en del af mikrobiota ("kolonisering sprede '). For at afgøre, om en probiotisk vil forurene og kolonisere ubehandlet littermates, var halvdelen af et kuld gavaged som ovenfor og tarmene blev indsamlet til qPCR. Tarm qPCR analyse af DOL 10 mus viste forventede forstærkning af LP DNA i gavaged mus, men også, i mindre grad i de ikke-gavaged littermates (figur 4). Tarme af de samme DOL mus fra en ubehandlet bur viste ingen forstærkning eller minimal forstærkning på cykler større end 32. Dette fremlagde beviser for den kommunale deling af microbiome inden for et kuld i et bur. Således, for eksperimenter med probiotika behandlingsgrupper bør være adskilt af bure til kontrol for variation gennem krydskontaminering. Brugen af foster dæmninger kan betragtes, hvis et eksperiment er at blive oprettet i et kuld indstilling, men forstyrrende virkninger som formindsket pleje fra dæmningen foster og afvisning bør evalueres og optimeret til. Når mus gavaged indtil DOL 8 blev efterladt ubehandlet i seks dage og den intestinale DNA blev analyseret på DOL 14, fandtes ca. 10 eksemplarer af LP (figur 5). Således kolonisering af LP blev fundet for at være forbigående og påviselige befolkningen mindskes over tid.
Figur 1 . Måle længden mellem formet som et sværd proces (lavere ende af brystbenet) og snude at gøre maksimal indsættelse mærkning for nålen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Standardkurve, der er fastlagt ved anvendelse af LP primere og ATCC LP DNA. En seriel fortynding af ATCC LP DNA blev gjort til at etablere de påviselige dynamikområde for de primere, der anvendes i undersøgelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . LP forstærkning af intestinal DNA fra DOL 10 unger behandlet mellem DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser) og hver anden dag (4 doser). Gavaging hver anden dag viste højere intestinal LP i forhold til gavaging hver dag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . LP forstærkning af intestinal DNA fra DOL 10 hvalpe med 2 behandlede og 2 ubehandlet i et kuld på 4 unger. Sonde var mellem DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser). De to probiotiske behandlet pups viser den forventede forstærkning profil. Ubehandlet hvalpene vise variabel forstærkning af LP med angivelse af kommunale deling af probiotiske organisme i et kuld. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . LP forstærkning af intestinal DNA fra DOL 14 unger behandlet mellem DOL 2 og DOL 8 i planlagte gavages hver dag (7 doser) og hver anden dag (4 doser). LP belastning dråber under cyklus 28 angivelse clearance af LP i løbet af 6 dage post sidste probiotiske sonde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Temperatur | Tid |
| 1 | 50 ° C | 2 minutter |
| 2 | 95 ° C | 3 minutter |
| 3 | 95 ° C | 30 sekunder |
| 4 | 58 ° C | 30 sekunder |
| 5 | 72 ° C | 30 sekunder |
Bord 1. qPCR forstærkning betingelser. Temperaturen og antallet af cyklus betingelser for PCR reaktionen.
| Target | 16s-23S intergenic spacer region |
| Forventede fragment størrelse | 144 bp |
| Primer Tm | 58˚C |
| Fremad primer (FP) | LPN-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| Omvendt primer (RP) | LPN-2: TGT TCT CGG TTT kat TAT GAA AAA ATA |
Tabel 2. Detaljer af komponenter af qPCR reaktion. Detaljer om primere, deres udgloedning temperatur og forventede fragment størrelse i PCR reaktionen.
| Koncentration | 10 µL reaktion | 20 µL reaktion | |
| DNA-Template | 200 pg/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| SYBR Master Mix | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| RP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8.8 ΜL |
Tabel 3. Per reaktion mængder og koncentrationer. Koncentration af reagenser og diskenheder for reaktioner.
Discussion
Proceduren for IE sonde blev udviklet for at sikkert administrere en bestemt dosis af en probiotisk til neonatal mus. Små mængder af væske er leveret til den øvre mave-tarmkanalen ved hjælp af en fodring nål til at forhindre aspiration samtidig sikre levering af doseringen i tillid. Tarme af mus blev indsamlet for kolonisering analyse to og seks dage efter sonde. Proceduren for DNA-ekstraktion blev ændret for at sikre højt udbytte af probiotiske Gram-positive organismer. QPCR analyse af DNA udvundet to dage post sidste sonde viste relativt højere kolonisering af LP i mus gavaged hver to dage i forhold til mus gavaged hver dag mellem DOL 2-8. Der var også et fald i mængden af LP over seks dage, viser denne probiotiske er en forbigående organisme i tarmen af musen. Resultaterne af disse eksperimenter fastsætte betingelser til at gennemføre forskning med høj stringens i denne aldersgruppe.
For at overholde de langsigtede virkninger af probiotika i neonatal mus, blev det administreret til neonatal mus på DOL 2; en lignende starttidspunkt pege på den humane forsøg. Oropharyngeale fodring af neonatal mus er tidligere beskrevet i litteraturen og foretaget kun efter DOL 5-812,17 , når risikoen for aspiration er lavere på grund af et veludviklet synke mekanik. Dog er oropharyngeale fodring ikke velegnet til DOL 2 mus, som højere satser for aspiration blev observeret i pilotundersøgelse (data ikke vist). Den tyktflydende karakter af probiotiske og prebiotiske løsningen føjes til risikoen for aspiration. Proceduren IE gavaging minimeres risikoen for aspiration i DOL 2 mus samtidigt med at levere den ønskede mængde direkte til den øvre mave-tarmkanalen. Resultat af indgrebet var først valideret ved hjælp af levnedsmiddelfarvestof infunderes probiotiske sonde. Mad farve fungerer som en markør, der er synlige gennem huden af pup. Ingen negative effekter blev observeret i mus gavaged med frugtfarve, og det anbefales at validere gavaging procedure på denne måde før påbegyndelse storskalaforsøg. Den hurtige opløsning på den gispende refleks set post sonde kan også bruges som en yderligere indikator for en vellykket sonde. Når musen er placeret på den varme tæppe efter sonde, den gispende refleks vil stilne og en stigning i vejrtrækning frekvens vil være observeret inden for 20 sekunder. Fortsættelse af den gispende refleks for længere end 30 sekunder angiver en mislykket sonde. Vellykket sonde afhænger også passende indsættelse af fodring nålen med pæren sidder lige over åbningen af den kardiale sphincter af maven. Dette kan fremmes ved at sikre, at mærkningen på nålen længdemåling mellem formet som et sværd proces og spidsen af snuden, ikke går forbi Snuden af musen under sonde. Dette minimerer risikoen for skade at musen. Hyppigheden af sonde kan have en betydelig indvirkning på de eksperimentelle resultater. Hyppige gavaging kan også oprette mere stress til unger og mor på grund af konstant undertrykkelse af netbårne buret og reden. Den mest optimale sonde tidsplan er når gavages er den mindst hyppige og over en kortere varighed uden at miste den forventede virkning i systemet. For at sikre sikkerhed og sterilitet i proceduren sonde skal nålen steriliseres ved vask og autoklavering imellem brug. Vask grundigt på udefra med et krat og indersiden ved at tvinge vand gennem nålen ved hjælp af en sprøjte, før autoklavering er nødvendige som enhver sidesten partikler kan encrust på nålen under autoklavering og kan forstyrre gavaging procedure.
Højere LP kolonisering blev observeret i unger, der var gavaged hver anden dag i forhold til unger gavaged hver dag. Dette kan skyldes nedsat stress på unger gavaged hver anden dag og potentielt probiotiske får flere næringsstoffer gennem relativt mere mælken indtages af disse unger. Dosis afhængighed af probiotiske behandling har været tidligere studeret i mus modeller18,19 og administrationen af korrekt dosering er derfor vigtigt. De probiotiske rengøringsopløsning er forgyldt før hver sonde til at få en præcis optælling af CFU administreres. Hvis probiotiske organismen er anaerobt, er det vigtigt at se om der er forskel i CFU når kulturperler aerobt eller anaerobt. Da LP er en fakultativ anaerobe, det var kulturperler, med begge metoder og ingen forskel i CFU blev observeret.
Post sonde intestinal LP load analyse blev udført ved hjælp af qPCR og høj kvalitet DNA-prøver. For at minimere LP DNA forurening mellem behandling og kontrolgrupper, forskellige fodring nåle, biosikkerhed kabinetter og kirurgisk udstyr blev brugt til at sikre højeste kvalitet prøver. Nøjagtig måling af probiotiske i tarmen kræves en optimeret DNA ekstraktion metode. Mest effektive metoder til udvinding af DNA fra afføring indebærer flere perle slå trin20,21,22. Denne metode blev vedtaget for udvinding af tarmbakterier bruger perle bankende og observeret formindsket repræsentation (< 102 eksemplarer genvundet) af LP i den hele tarmen DNA-ekstraktion. Som LP er en Gram positive organisme med en betydelig mængde af peptidoglycan i cellevæggen, blev protokollen optimeret med en peptidoglycan opløsning trin ved hjælp af lysozym23,24 tilføjes den enzymatiske lysisbuffer. Denne øgede repræsentation af LP i samme intestinal prøve af større end dobbelt. Lysozym behandling sikrer opløsningen af det yderste lag, mens perle slå trin letter lysering af organismen. Optimering af mængden af væv, granat perle type og varighed af forstyrrelser ved hjælp af perlerne er nødvendige for at opnå optimal DNA produkter for at gennemføre PCR-analyse.
Den positive effekt af probiotika administreret som profylakse eller behandling i de foreløbige sigt og sigt nyfødte er dokumenteret i de seneste undersøgelser25,26,27,28. Etablering af en ordentlig neonatal musemodel for probiotika er berettiget til at pakke den beskyttende effekt af probiotika. Denne protokol her skitserede repræsenterer en vejledning for forskere uvante med neonatal mus arbejde ved hjælp af probiotika. Uanset problemer med gnaver mikrobiota samtidig med at studere menneskers sundhed og sygdom, kan denne metode forlænges til forskning fokuseret på at forstå ændringerne af microbiome på grund af probiotika. Denne model giver også en platform for at studere vært-mikrobe interaktion og immunrespons i løbet af forskellige udviklingsstadier.
Disclosures
Ingen interessekonflikt at videregive.
Acknowledgments
Tak til dyrs pleje facilitet medarbejdere og UBC dyrlæger til træning og bistå med at musen virker på BC children's Hospital Research Institute. Tak til University of British Columbia og Institut for eksperimentel medicin for finansiering til undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
