Summary
この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。
Abstract
モデル生物C.エレガンスは、生体内カルシウムイメージングを行うための優れたシステムを提供します。その透明なボディおよび遺伝的な操作性は遺伝的にコードされたカルシウムセンサーの標的化された発現を可能にする。このプロトコルは、標的細胞におけるカルシウムダイナミクス、特にワームの体壁筋の生体内イメージングに対するこれらのセンサの使用を概説する。シナプス前チャネルロドプシンの共発現を利用することにより、興奮性運動ニューロンからのアセチルコリン放出の刺激は、青色光パルスを用いて誘導され、細胞質カルシウムの筋肉脱分極および再現性の変化をもたらすレベル。2 つのワーム固定化手法は、さまざまなレベルの難易度で説明されています。これらの技術の比較は、両方のアプローチが神経筋接合部の生理学を維持し、カルシウム過渡の再現可能な定量を可能にすることを示しています。光遺伝学と機能性カルシウムイメージングを組み合わせることで、後代カルシウム取り扱いと恒常性の変化を様々な変異型の背景で評価することができます。提示されたデータは、固定化技術の両方を検証し、具体的には、C.エレガンスサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPaseと体壁筋カルシウム調節におけるカルシウム活性化BKカリウムチャネルの役割を調べます。
Introduction
本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。
GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワーム神経筋接合部(NMJ)での研究を可能にする2.
チャネルロドプシンの使用は、C.エレガンスの神経筋接合部を脱分極するための電気刺激の必要性をバイパスし、解剖製剤でのみ達成できるため、この技術を使用しやすく、より正確に行うことができる。特定の組織を標的にする場合。例えば、チャネルロドプシンは、以前にC.エレガンスで特定のニューロンを可逆的に活性化するために使用され、興奮性または阻害性ニューロン3、4の堅牢な活性化のいずれかにつながる。光刺激脱分極の使用はまた、直接電気刺激による神経損傷の問題を回避する。これは、持続および繰り返し刺激を含む多くの異なる刺激プロトコルが、経例カルシウムダイナミクス4に及ぼす影響を調べる機会を提供する。
C.エレガンスの透明な性質は蛍光イメージング機能分析にとって理想的である。しかし、NMJで興奮性アセチルコリンニューロンを刺激する場合、動物は即時の筋肉収縮4で応答することが期待され、離散的なカルシウム変化を視覚化する上でワームの固定化が重要である。伝統的に、薬理学的薬剤は、動物を麻痺させるために使用されてきました。使用されるそのような薬物の1つは、レバミソール、コリン作動性アセチルコリン受容体アゴニスト5、6、7である。レバミソールは興奮性筋受容体のサブタイプの持続的な活性化につながるので、この試薬は筋肉カルシウムダイナミクスの研究には不向きである。レバミソールの作用は、シナプス後脱分極、細胞体カルシウムの上昇、およびシナプス前刺激後の観察を遮断する。麻痺薬の使用を避けるために、我々はC.エレガンスを固定する2つの代替方法を検討した。動物を接着し、次いで体壁の筋肉を露出させるために開いて解剖した動物は、既存のC.エレガンスNMJ電気生理学法8と同様に、またはナノビーズを無傷の動物9を固定するために使用した。両方の手順は、安静時の再現可能な測定を可能にし、容易に定量化可能な筋肉カルシウム過渡を誘発した。
この論文の方法は、C.エレガンスにおける後体壁筋細胞における基サイトソー酸カルシウムレベルおよび過渡性のベースラインを測定するために使用することができる。2つの異なる固定化技術を用いたデータの例が示される。両方の技術は、電気刺激を使用せずに筋肉細胞を脱分極するために光遺伝学を利用します。これらの例は、ワームにおける後質カルシウム処理に影響を与える変異を評価する際にこの方法の実現可能性を示し、2つの固定化アプローチの長所と短所を指摘する。
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Protocol
1. 顕微鏡セットアップ
- 蛍光機能を備えた複合顕微鏡を使用します。本研究では、励起用のLEDを装着した直立顕微鏡(材料の表)でデータを収集した。
- 体壁筋の蛍光変化を適切に可視化するためには、高倍率の目的を使用します。
- 解剖された調製物には、60x NA 1.0水浸漬目的(材料表)を使用してください。
- ナノビーズを用いる調製物には、60x NA 1.4オイル浸漬目的(材料表)を使用してください。この倍率はカメラセンサーの筋肉の十分な決断を保障する。
- 顕微鏡に取り付けられた高感度カメラを使用して、高フレームレートで画像をキャプチャし、カルシウムレベルの急激な変化を追跡します。本研究では、Ca2+信号の立ち上がり時間が数十ミリ秒と同じくらい速くなるように、100 Hzでフルフレームイメージングが可能なsCMOSシステム(材料表)を用いた画像を用いた画像を用いた。
- メーカーの指示に従ってImageJ10で実行されているマイクロマネージャソフトウェアでカメラの取得とLED蛍光励起を制御します(材料の表)。
- 外部オープンソースマイクロコントローラボード(材料の表)を接続するオープンソースの電子プラットフォームプラグインを使用して、外部タイミングパルスを管理して蛍光励起を制御します。
注:デジタル出力は、出力ビット0~5を提供するデジタルピン8~13から利用できます。これらは、1、10、100 などの基本 2 値として扱うことができます。シリアルポートの設定は表1に示され、マイクロマネージャーの Web サイト (材料の表)から入手できます。マイクロコントローラボードのファームウェアは、同様にこのウェブサイトで利用可能です。 - タイミングロジックを制御するには、製造元の指示に従ってソフトウェアでマイクロマネージャ集録プロトコルを有効にします(材料の表)。
注:これは同時に、プリセットカメラフレームの持続時間とアクティブにするフレームの数だけでなく、蛍光励起のための論理シャッターとプリセットアンバーLEDを開始します。この場合、オレンジ色のLEDソリッドステートスイッチは、ピン9を介したマイクロコントローラビット1出力によって制御されます。カメラフレームアウトTTL(バックプレートアウト3コネクタ)は、刺激器をトリガします。これは、画像化配列の活性化後の一定時間におけるチャネルロドプシンの活性化のための青色光LEDの活性化を正確に回す。 - 青色光でチャネロドプシンを刺激し、RCaMP の変化を記録するには、2 つの LED を使用します。470 nmのピーク発光波長とバンドパスフィルタ(455~490nm)を持つLEDでチャネロドプシンを活性化し、ピーク発光波長594nmとバンドパスフィルタ(570~600nm)のLEDでRCaMPを励起します。
- チャネロドプシンを同時に活性化し、RCaMP蛍光レベルの変化を捕捉するために、両方のLEDを同時に照射し、ダイクロイックビームコンバイナを使用して同じ光路に光を送信します。
- TTL信号によって制御されるソリッドステートスイッチ(材料表)によるLED照明のタイミングを制御します(最大定格ターンオン時間、1ミリ秒、ターンオフ時間0.3ms:0~90%ターンオン、<100 μs)。
- 現在制御された低ノイズリニア電源(材料の表)でLED強度を設定します。
- 青色光LEDの正確なタイミングを確保するには、刺激器からソリッドステートリレーにTTLパルスで直接アクティブにします。青色光刺激プロトコルを刺激器(材料の表)にプログラムし、画像取得開始から青色LED照明までの正確なタイマーとして機能します。この実験では、RCaMP蛍光のみを捕捉した2秒後に青色光刺激をオンにし、50msインターパルス間隔を持つ5、2msの青色光パルスの列車を使用してチャネロドプシンを活性化する。
注:青色光パルスの前の遅延、青色光パルスの持続時間、パルス間の時間、および列車内のパルスの数はすべて、この時点で設定することができ、実験的な関心のある特定のパラメータを反映する必要があります。
2. C. エレガンスサンプルの準備とデータ取得
- 前シナプスニューロンを光学的に刺激するために、興奮性コリン作動性ニューロンでチャネルロドプシンを発現する動物を得る, unc-17プロモーター領域で駆動,そして、myo-3プロモーターで駆動されるすべての体壁筋肉で発現RCaMPリージョン2.
注:対応する細胞タイプの可変発現がデータ獲得の信頼性に影響を与える可能性があるため、統合されたトランスジェネと強いレベルの蛍光を持つ動物のみ使用することをお勧めします。 - エタノールでレチナルパウダー(材料の表)を希釈して全トランスレチナルの作業ストックを作り、最終的な濃度を100mMにし、-20°Cで保存します。この稼働株は約1年間安定しています。
- LB培中に成長したOP50大腸菌のストックを作成し、ステップ2.2で作られた作業ストックから全トランスレチナルを補充し、最終的な濃度は80 μMです。OP50+レチンストックに使用される体積は、実験に必要なプレートの数に依存します。
- 種子線虫成長培地(NGM)プレートは、OP50+再生ストックの約300 μLで、プレートが暗闇の中で室温で一晩乾燥することを可能にします。
- 20°CでOP50+軟経NGMプレート上の暗闇の中で所望の年齢にC.エレガン株を成長させます。この実験では、成人ワームを使用します。
- 解剖調製を用いての実験では、若い小動物に対して解剖を行うのと同じように、灰色の成虫のみを使用することは非常に困難である。効果的なチャネルロドプシン活性化のために、OP50-retinalプレート上の動物を最低3日間放置します。
- 解剖調製8、11(図1A)を用いて、低照光下で解剖を行う。
- 150 mM Ca2+ 5 mM KCl、1 mM CaCl 2、4 mM MgCl2、10mM ブドウ糖、5 mM スクロース、および15 mM HEPES で満たされたシリコーンコーティングされたカバースリップ ベースで解剖皿に動物を配置します。、-340オスム)。
- 虫の背中に沿って青色の着色で液体局所皮膚接着剤を使用して動物を接着し、ガラス針を使用して接着剤/ワームインターフェースに沿って横キューティクル切開を行います。
- 口のピペットを使用して、虫の空洞から内内臓を取り除きます。
- 動物のキューティクルフラップを接着して、イメージング用の腹部中間体壁筋を露出させます。
- ナノビーズ製剤を用いれば(図1B)
- ddH2Oを使用して溶融5%アガロース溶液を100mLの最終容積にします。
- パストゥールピペットを使用して、溶融アガロース溶液の滴をガラススライド上に置き、すぐに最初に垂直に、第1に垂直な上に2番目のガラススライドを置き、穏やかな圧力を使用してアガロースパッドを作成します。使用前に上部スライドを取り外します。
- アガロースパッドの中央に約4μLのポリスチレンナノビーズ(材料表)を加えます。
- 低照光では、4-6 C.エレガンをナノビーズ溶液に取り入れ、動物が互いの上に横たわないようにし、慎重に上にカバースリップを置きます。
- 準備されたスライドまたは解剖皿を顕微鏡の上に置き、10倍の倍率と薄暗い明るい分野の照明を使用してワームを見つけて焦点を合わせます。
- 60倍の倍率とRCaMP蛍光励起に切り替えて、外陰部と正しい焦点面に付着する心室体壁筋を識別します。
注:外陰部の筋肉は、電気生理学の実験で一般的に刺激される筋肉を反映するように選択されます。 - トグルを引き出し、データ取得ソフトウェア内のLiveをクリックして、アイピースからカメラへの画像経路を変更します (材料の表)。
注: 画像をキャプチャする前に、チャネロドプシンがアクティブにならないように、この時点で青色光刺激経路がオフになっていることを確認してください。 - 顕微鏡の細かい焦点を使用して、データ集録ソフトウェア内の画像に焦点を合わせます。
- 筋肉がはっきりとピントが合ったら、ライブボタンをクリック解除してライブ画像をオフにします。
- データ取得ソフトウェアのROIボタンをクリックし、焦点を当てている筋肉の周りにボックスを作成します。
- 刺激器で、ステップ1.10で以前にプログラムされた青色光刺激経路をオンにします。
- イメージング ソフトウェアで [取得]をクリックして、CMOS カメラを介して画像をキャプチャします。これを行うには、1,000 フレームと 2x ビンで露出時間を 10 秒に設定します。
3. データ分析
- イメージング ソフトウェア (材料の表)でデータ ファイルを開き、ポリゴン ツールを使用して、対象の筋肉の輪郭を描きます。これがROIです。
- 画像へ |スタック|Z 軸プロファイルをプロットし、結果のデータ ポイントをスプレッドシート ソフトウェア (材料の表)に書き出します。この関数は、ROI 選択平均値と時点点をプロットします。
- ポリゴンツールで作成した筋肉ROIを動物の外側に移動し、3.2で概説したステップを使用して背景蛍光測定を取得します。結果のデータをスプレッドシート ブックにエクスポートします。
- スプレッドシート ブックで、各時点での筋肉蛍光値から背景蛍光値を減算します。これにより、背景減算蛍光信号が提供される。
- データポイントの最初の2sの蛍光を差し引いた背景を平均します。これにより、ベースライン蛍光測定、Fが与える。
- ベースライン蛍光測定を使用して、各時点で正規化された蛍光レベルを計算します。これを行うには、式 (ΔF/F)+1 を使用します。ΔFは(F(t)-F)を表し、F(t)は任意の時点における蛍光測定であり、Fはベースライン値である。+1 は Y 軸オフセットとして追加されます。
- 収集された筋肉画像ごとに手順 3.2-3.6 を繰り返します。画像あたりの単一または複数の筋肉細胞を使用することは、研究者の裁量であります.実験のnは、電力解析を行うことによって決定することができる。
- ステップ3.2-3.6の処理データを使用して、製造元の指示に従ってソフトウェアの蛍光値をトレースします(材料の表)。
- このトレースから、製造元の指示に従ってグラフソフトウェアに付属のツールを使用して、ピーク時間と半分の減衰時間に上昇するなど、一過性のカルシウムの動態を測定します。
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Representative Results
この技術は、カルシウムの取り扱いや筋肉の脱分極に影響すると考えられている変異体の変化を評価した。ベースライン蛍光レベルおよび蛍光過渡を可視化し、筋肉内の細胞質カルシウムおよびカルシウム動態を休止して評価した。動物は、少なくとも3日間全トランス形直結で成長し、その後、チャネルロドプシンを活性化することが重要である(図2A)。動物が全トランス・レチナルにさらされていない場合、筋肉カルシウム過渡は引き起こされない(図2B)。これらの動物は、ベースライン細胞細胞性カルシウムレベルを評価するためにまだ使用することができますが、カルシウムの動的な変化は捕捉されません。さらに、動物または解剖の健康のための内部制御として、動物は青色光刺激後に収縮する。固定化にナノビーズを使用する場合、ワームの体の総運動を最小限に抑える筋肉収縮を伴う記録がデータ収集のために選択された。生蛍光値を収集するために使用される筋肉が激しく収縮し、ワームの全身が移動する場合、一過性トレースはこの運動アーティファクト(図2C)を反映し、定量から廃棄されるべきである。
sca-1遺伝子座への変異マッピングは、C.エレガンス筋ニコチン性受容体局在化に影響を与える変異のスクリーンから単離された。C.エレガンスsca-1遺伝子は、ワーム中のサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPase(SERCA)の唯一のホモログをコードし、体壁の筋肉12、13に存在する唯一のSERCAポンプである。機能喪失sca-1変異体は、哺乳類の筋肉におけるカルシウム恒常性を維持する上でSERCAが果たす重要な役割に基づいて筋肉カルシウム取り扱いに変化を示すことを予測した14,15,16 、17、18.GECI RCaMPは体壁筋で発現し、青色光活性化性チャネルロドプシンは興奮性コリン作動性ニューロンで発現し、sca-1変異体における細胞内ベースラインカルシウムおよびカルシウムダイナミクスの両方を評価した。解剖された調製技術により、対照と比較した場合にsca-1変異体においてRCaMP蛍光のベースラインレベルの増加が認められた(図3A,B)、SERCA機能の喪失が安静性細胞質カルシウムの上昇レベル。カルシウムダイナミクスを調べたところ、5、2msの青色光パルス(図3C)の列車で引き起こされたシナプス前刺激に続いて、sca-1(tm5339)変異体におけるピークカルシウムレベルの有意な減少があった。 コントロール(図3D)と比較して、SRにおけるカルシウムストアの減少を反映する可能性があります。しかし、ピーク時や半分の減衰時間の上昇には変化は見られなかった(図3E,F)。これは、アセチルコリン受容体を介したカルシウム入口や電圧ゲートカルシウムチャネル、および内部ストアからのカルシウム入力などの外部源からのサイトソリックカルシウムの変化がsca-1(tm5339)変異体に影響を受けずていることを示唆している。.同様の結果は、図419に示すように、ナノビーズ製剤を用いて観察することができる。このデータの要約は、これらの技術の両方が細胞質カルシウムレベルを休ませる体壁の筋肉を測定するだけでなく、刺激されたカルシウム過渡を観察するための生理学的であることを証明します。これはまた、ワームの解剖は、そのカルシウム処理を変更する動物やポストシナプティック筋肉を脱分極する能力に損傷を引き起こさないことを示しています。
このプロトコルは、C.エレガンスにおけるカルシウム処理に間接的に影響を与える変異体を調べるためにも使用できます。関数slo-1(例えば142)変異体の喪失を評価し、これを実証した。slo-1遺伝子は、ニューロンと筋肉20、21の両方で発現されるカルシウム活性化BKカリウムチャネルをコードする。研究は、以前に体壁筋肉におけるSLO-1の役割を説明し、機能変異体の喪失が筋肉作用電位20、21に続く後の脱分極に欠陥があることを実証している。この過興奮性に起因するベースラインカルシウムレベルおよびカルシウム過渡性ダイナミクスの可能な変化は、ナノビーズ固定化を用いて検討された。RCaMPのベースラインレベルを測定した場合、slo-1(例えば142)変異体は対照と比較して蛍光を増加させる(図5A,B)19。これは、BKチャネルが細胞管カルシウムのベースラインレベルを調節するかもしれないことを示唆している。一過性カルシウムの運動学を評価する際に対照(図5C,D)と比較して、ピークカルシウムレベルの変化は見られなかった。しかし、slo-1(例えば142)変異体は、対照に比べてピーク時に有意に増加した上昇を示した(図5E)。これは、以前に報告されたシナプス興奮前興奮度20、21の増加を反映し得る。しかし、slo-1(例えば142)変異体の半崩壊時間は対照と比較して有意な変化はなかった(図5F)。これらのデータは、これらの方法が休息と刺激体壁筋カルシウムの両方に対する前および後の突然変異の効果を評価するために使用できることを示しています。
| シリアル設定 | 値 |
| 応答タイムアウト | 500 |
| ボーレート | 57600 |
| 遅延間チャーズム | 0 |
| ハンドシェイク | オフ |
| パリティ | なし |
| ストップビット | 1 |
| 詳細 | 0 |
表 1: 外部マイクロコントローラボードを制御するマイクロコントローラプラグインのシリアルポート設定。これは、蛍光励起を制御するために外部タイミングパルスをプログラムするために使用されます。
図1:異なる固定化技術のグラフィカルな表現。(A)この図は、固定化のための解剖技術を示しています。虫の体は、動物の後部側の周りに(青色)接着されています。キューティクルに沿った後部切開は、キューティクルフラップを生成します。このフラップは、緑色の心室神経コードのシナプス(チャネルロドプシン)と赤色で筋肉を発現するRCaMPの間に形成された無傷のNMJを露出させるために接着されています。(B)この図は、ナノビーズ固定化技術を示す図である。無傷のワームは、溶液中のナノビーズの表現に囲まれ、その上のカバースリップによって圧縮されると、ワームを固定化する。C.エレガンスの透明性のために、心室神経コードは緑色(チャネルロドプシン)で視覚化することができ、筋肉を発現するRCaMPは赤で視覚化することができる。ワームの真ん中の卵は外陰部を表し、これは腹部の体壁の筋肉を識別するランドマークである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カルシウム過渡の代表的な痕跡。(A)50ミリ秒間隔で5、2msの青色光パルスの列車によって誘発されたカルシウム過渡の単一の微量表現は、全トランス・レチナル(+all-トランスレティナル)。スパイクアーティファクトは、両方のLEDが同時に照射されるため、青色光刺激パルスです。(B)全トランス・レチナル(-全トランス・レチナル)に曝露されていない動物において、5,2msの青色光パルス5,2msの列車に応答してカルシウム過渡性の不在を示す単一の微量表現、- 動き)。(C)50ミリ秒のインターパルス間隔を持つ5、2ミリ秒の青色光パルスの列車によって誘発されたカルシウム過渡の単一の微量表現は、運動アーティファクトにつながる著しい筋肉収縮を有する動物に記録される(+運動、+)全トランスレティナル)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ベースラインカルシウムレベルおよび照会およびsca-1(tm5339)サンプルから誘発されたカルシウム過渡性を解剖技術を用いて調製した。(A) sca-1(tm5339)変異体および対照におけるベースラインRCaMP蛍光の代表的な画像。スケールバー = 50 μm.(B) sca-1(tm5339)変異体(n=13)および制御(n=9)におけるベースライン蛍光レベル定量。(C) sca-1(tm5339)変異体および対照動物に対する誘発カルシウム過渡の平均痕跡をアンサンブルする。(D)チャネルロドプシンからのピークRCaMP蛍光の定量は、sca-1(tm5339)変異体(n=12)および対照(n=9)におけるカルシウム応答を誘発した。(E)チャネルロドプシンのピーク時までの上昇の定量化は、sca-1(tm5339)変異体(n=12)および対照(n=8)におけるカルシウム過渡を誘発した。(F)チャネルロドプシンの半分の減衰時間定量は、sca-1(tm5339)変異体(n=12)および対照(n=7)におけるカルシウム過渡を誘発した。統計的に有意な値は、有意ではない p>0.05, * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.誤差バーは平均±SEMを表し、データはシャピロ・ウィルク検定を用いて正規化され、非正規分布に対するマン・ホイットニー検定では有意性が決定された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ベースラインカルシウムレベルおよびナノビーズ固定化を用いて調製したsca-1(tm5339)サンプルからカルシウム過渡を誘発した。(A) sca-1(tm5339)変異体および対照におけるベースライン蛍光の代表的な画像、スケールバー 50 μm(B) sca-1(tm5339)変異体におけるベースラインRCaMP蛍光レベルの定量(n=14)および対照(n=13)。.(C) sca-1(tm5339)変異体および対照に対する誘発カルシウム過渡の平均。(D) sca-1(tm5339)変異体(n=14)および対照(n=13)におけるカルシウム応答を誘発した後のピークRCaMP蛍光の定量。(E) sca-1(tm5339)変異体(n=14)および対照(n=12)における誘発カルシウム過渡のピーク時までの上昇の定量化。(F) sca-1(tm5339)変異体(n=14)および対照(n=13)における誘発カルシウム過渡の半分減衰時間の定量化。フィギュアは19から適応されています。統計的に有意な値は:有意ではないp > 0.05、 * p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。誤差バーは平均±SEM.データ正規性をシャピロ・ウィルク検定を用いて評価し、非正規分布に対するマン・ホイットニー検定で有意性を決定した。この数値は、19から許可を受けて変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ベースラインカルシウムレベルおよびナノビーズ固定化を用いて調製したslo-1(例えば142)試料からカルシウム過渡を誘発した。(A) slo-1(例142)変異体および対照におけるベースライン蛍光の代表的な画像、スケールバー50 μm.(B)slo-1(例えば142)変異体(n=29)および対照(n=13)におけるベースラインRCaMP蛍光レベルの定量化。(C) slo-1(例えば142)変異体および対照に対する誘発カルシウム過渡の平均。(D) slo-1(例えば142)変異体(n=29)および対照(n=13)におけるカルシウム応答を誘発した後のピークRCaMP蛍光の定量。(E) slo-1(例えば142)変異体(n=29)および対照(n=13)における誘発カルシウム過渡のピーク時までの上昇の定量化。(F) slo-1(例えば142)変異体(n=11)および対照(n=13)における誘発カルシウム過渡の半分減衰時間の定量化。フィギュアは19から適応されています。統計的に有意な値は:有意ではないp > 0.05、 * p ≤ 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001。誤差バーは平均±SEM.データ正規性をシャピロ・ウィルク検定を用いて評価し、非正規分布に対するマン・ホイットニー検定で有意性を決定した。この数値は、19から許可を受けて変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
GECはC.エレガンス神経生物学の強力なツールです。これまでの研究では、カルシウムイメージング技術を用いて、感覚反応や行動反応など、ニューロンと筋肉細胞の両方で多種多様な機能を調べ、様々な刺激方法を用いた。いくつかの研究は、感覚ASHニューロン22、23、または咽頭筋肉24でカルシウム波を誘導するために化学刺激を使用しています。別のグループは、ワームがマイクロ流体チップに保持されている間に機械的刺激を利用し、タッチ受容体ニューロン25におけるカルシウム応答を調べた。それでも、他の人は、ニューロン26と体壁筋肉27のカルシウム変化を可視化するために電気刺激を採用している。これらの研究の間で一般的なのは、カルシウム過渡を引き起こすソリューションや機器などの外部刺激の要件です。ここで概説されるプロトコルは、神経特異性を提供する光遺伝学的刺激から得られる制御を利用し、同じ実験パラダイムでGECI2を発現した筋肉の機能解析と相まって。
2つの形態のワーム固定化が説明され、実験ニーズに対処する際に各方法を評価する必要があるが、解剖および生理学的に無傷の製剤の両方が相補的な結果を生み出し、研究者はどちらかのアプローチを使用することを可能にする。彼らの研究で。解剖技術を使用する技術的な課題が増大しており、ユーザーは神経コードや筋肉を損傷することなく、外科的接着剤と微細解剖の両方を正確に使用する必要があります。さらに、解剖の難易度のために、重力の成人だけが使用されるべきであり、実験時間ポイントを制限する可能性がある。さらに、解剖技術は、小さな、薄い、または病気の動物を産生する変異体に対して実行するのがはるかに困難であり、再び実験パラメータを制限する可能性があります。この技術の利点は、脱分極に起因する身体運動アーティファクトを制限し、接着がワームの身体の過剰な動きを防ぎ、また、溶液の変更および薬物用途のためのNMJへのアクセスを提供することです。さらに、各調製物は、体壁の筋肉が一貫して焦点を合わせることを保証するワームの同じ領域を公開します。第2の技術は、ナノビーズを使用してワームを固定化するが、関与が少なく、迅速に学習することができる。また、この方法では年齢の動物を使用できるため、開発を通じたカルシウム取り扱いの変化を監視することができます。動物の操作が多すぎると破裂する可能性があるため、ワームをナノビーズ溶液に入れる際には注意が必要です。また、カバースリップは、動物が転がったりねじれたりする可能性があるため、動物の上に置かれた後に移動してはなりません。ナノビーズを使用すると、動物が潜在的に回復することができるハイスループットアッセイを提供することができますが、動物の体の位置の標準化はなく、したがって、すべての動物は明確な焦点面に体壁の筋肉を持っていない可能性があります。実験が多数の動物を必要とする場合、寒天系マイクロウェルなど、バルクカルシウム蛍光イメージング28を可能にする異なる固定化方法が必要となる場合がある。これら2つの技術の限界にかかわらず、どちらかがC.エレガンス体壁筋内の信頼性の高い、容易に定量化可能なカルシウム過渡を得るために利用することができる。
C. エレガンスは、機能イメージング研究のためのインインインインビボシステムとして多くの利点を提供します。動物は透明であり、GECI RCaMPとのチャネルロドプシンの使用を通じて光遺伝学的神経脱分極の組み合わせが筋肉の得られたシナプスカルシウム過渡を測定することを可能にする。RCaMP蛍光の事前刺激レベルは、ベースラインサイトソリックカルシウムレベルを評価するためにも使用することができます。C.エレガンスの遺伝的なトラクビリティは、カルシウム恒常性に影響を与える可能性のある新しい変異の研究を行うか、または多くの場合、容易に利用可能な変異アレルで、追求しやすい取り扱いを行う。このプロトコルで概説した技術を用いることで、シナプスカルシウムイメージングデータを効率的かつ比較的低コストで得ることができ、幅広いイメージング実験に最適なシステムです。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、ZX1659のアレクサンダー・ゴッチョルク博士、ワーム株を含むRCaMPとチャネルロドプシン、slo-1(例えば142)ワーム株のホンギョン・キム博士、およびsca-1(tm5339)ワーム株の国家生物資源プロジェクトに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
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