Summary
Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.
Abstract
Der Modellorganismus C. elegans bietet ein ausgezeichnetes System zur Durchführung von In-vivo-Calcium-Bildgebung. Sein transparenter Körper und seine genetische Manipulierbarkeit ermöglichen die gezielte Expression genetisch kodierter Kalziumsensoren. Dieses Protokoll skizziert den Einsatz dieser Sensoren für die In-vivo-Bildgebung der Kalziumdynamik in Zielzellen, insbesondere der Körperwandmuskulatur der Würmer. Durch die Verwendung der Ko-Expression von präsynaptischem Kanalrhodopsin kann die Stimulation der Acetylcholin-Freisetzung aus exzitatorischen motorischen Neuronen mit blauen Lichtimpulsen induziert werden, was zu einer Muskeldepolarisation und reproduzierbaren Veränderungen des zytoplasmatischen Kalziums führt. Ebenen. Zwei Schneckenimmobilisierungstechniken werden mit unterschiedlichen Schwierigkeitsgraden besprochen. Der Vergleich dieser Techniken zeigt, dass beide Ansätze die Physiologie der neuromuskulären Kreuzung erhalten und die reproduzierbare Quantifizierung von Kalziumtransienten ermöglichen. Durch die Kombination von Optogenetik und funktioneller Kalziumbildgebung können Veränderungen der postsynaptischen Kalziumhandhabung und Homöostase in einer Vielzahl mutierter Hintergründe bewertet werden. Die vorgestellten Daten validieren sowohl Immobilisierungstechniken als auch untersucht speziell die Rolle des C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase und des calciumaktivierten BK Kaliumkanals in der Körperwandmuskel-Calciumregulation.
Introduction
Dieses Papier stellt Methoden zur In-vivo-Calcium-Bildgebung von C. elegans Körperwandmuskeln mit optogenetischer neuronaler Stimulation vor. Die Kombination eines muskelexprimierten genetisch kodierten Kalziumindikators (GECI) mit blauem Licht löste eine neuronale Depolarisation aus und bietet ein System, um die evozierten postsynaptischen Calciumtransienten klar zu beobachten. Dies vermeidet den Einsatz elektrischer Stimulation, was eine nicht-invasive Analyse von Mutanten ermöglicht, die die postsynaptische Kalziumdynamik beeinflussen.
Single-Fluorophor-GECIs, wie GCaMP, verwenden ein einzelnes fluoreszierendes Proteinmolekül, das mit der M13-Domäne der Myosin-Lichtkettenkinase an seinem N-Terminal-Ende und Calmodulin (CaM) am C-Terminus verschmolzen wird. Bei der Kalziumbindung erfährt die CaM-Domäne, die eine hohe Affinität zu Kalzium aufweist, eine Konformationsänderung, die eine nachfolgende Konformationsänderung im fluoreszierenden Protein zur Folge hat, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität1führt. GCaMP Fluoreszenz ist bei 488 nm angeregt, so dass es ungeeignet ist, in Verbindung mit Channelrhodopsin verwendet zu werden, das eine ähnliche Anregungswellenlänge von 473 nm hat. Um Kalziummessungen mit der Stimulation des Kanalrhodopsins zu koppeln, muss daher das grüne fluoreszierende Protein von GCaMP durch ein rotes fluoreszierendes Protein, mRuby (RCaMP), ersetzt werden. Die Verwendung des muskelausgedrückten RCaMP in Kombination mit der cholinergen motorischen Neuronenexpression von Channelrhodopsin ermöglicht Studien an der neuromuskulären Schnittstelle des Wurms (NMJ) bei gleichzeitiger Anwendung von Optogenetik und funktioneller Bildgebung innerhalb desselben Tieres. 2.
Der Einsatz von Channelrhodopsin umgeht die Notwendigkeit der elektrischen Stimulation, um die neuromuskulären Knoten von C. eleganszu depolarisieren, die nur in sezierten Präparaten erreicht werden können, wodurch diese Technik sowohl einfacher zu verwenden als auch präziser zu machen ist. wenn bestimmte Gewebe gezielt werden. Zum Beispiel, Channelrhodopsin wurde zuvor in C. elegans verwendet, um bestimmte Neuronen reversibel zu aktivieren, was entweder zu einer robusten Aktivierung der exzitatorischen oder hemmenden Neuronen3,4. Der Einsatz einer lichtstimulierten Depolarisation umgeht auch das Problem der neuronalen Schäden durch die direkte elektrische Stimulation. Dies bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen vieler verschiedener Stimulationsprotokolle, einschließlich anhaltender und wiederholter Stimulationen, auf die postsynaptische Kalziumdynamik4zu untersuchen.
Die transparenzliche Natur von C. elegans macht es ideal für die fluoreszierende bildgebende funktionelle Analyse. Jedoch, bei der Stimulierung der exzitatorischen Acetylcholin-Neuronen an der NMJ, Tiere werden erwartet, mit einer sofortigen Muskelkontraktion reagieren4, so dass die Immobilisierung der Würmer entscheidend bei der Visualisierung diskreter Kalziumveränderungen. Traditionell werden pharmakologische Wirkstoffe verwendet, um die Tiere zu lähmen. Ein solches Medikament verwendet wird, ist Levamisol, ein cholinerge Acetylcholin-Rezeptor-Agonist5,6,7. Da Levamisol zur anhaltenden Aktivierung eines Subtyps von exzitatorischen Muskelrezeptoren führt, ist dieses Reagenz für die Untersuchung der Muskelkalziumdynamik ungeeignet. Die Wirkung von Levamisol induziert eine postsynaptische Depolarisation, erhöht das zytosolische Kalzium und schließt Beobachtungen nach präsynaptischer Stimulation aus. Um die Verwendung von lähmenden Medikamenten zu vermeiden, untersuchten wir zwei alternative Methoden, um C. elegansimmobilisieren. Die Tiere wurden entweder verklebt und dann aufgeschnitten, um die Körperwandmuskeln freizulegen, ähnlich der bestehenden C. elegans NMJ Elektrophysiologie-Methode8, oder Nanoperlen wurden verwendet, um intakte Tiere immobilisieren9. Beide Verfahren ermöglichten reproduzierbare Messungen der ruhenden und evozierten Muskelkalziumtransienten, die leicht quantifizierbar waren.
Die Methoden in diesem Papier können verwendet werden, um die grundlegenden zytosolischen Kalziumspiegel und Transienten in postsynaptischen Körperwandmuskelzellen in C. eleganszu messen. Beispiele für Daten, die die beiden verschiedenen Immobilisierungstechniken verwenden, werden genannt. Beide Techniken nutzen die Optogenetik, um die Muskelzellen ohne elektrische Stimulation zu depolarisieren. Diese Beispiele zeigen die Machbarkeit dieser Methode bei der Bewertung von Mutationen, die die postsynaptische Kalziumbehandlung in den Würmern beeinflussen, und weisen auf die Vor- und Nachteile der beiden Immobilisierungsansätze hin.
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Protocol
1. Mikroskop-Setup
- Verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop mit Fluoreszenzfähigkeiten. Für diese Studie wurden Daten auf einem aufrechten Mikroskop(Materialtabelle) gesammelt, das zur Anregung mit LEDs ausgestattet war.
- Um Fluoreszenzänderungen in den Körperwandmuskeln richtig zu visualisieren, verwenden Sie ein zielweises hohe Vergrößerung.
- Für sezierte Präparate verwenden Sie ein 60x NA 1.0 Wasserimmerziel (Materialtabelle).
- Für Präparate mit Nanoperlen verwenden Sie ein 60x NA 1.4 Öl Immersion objektiv (Tabelle der Materialien). Diese Vergrößerung sorgt für eine ausreichende Auflösung der Muskeln auf den Kamerasensor.
- Verwenden Sie eine hochempfindliche Kamera, die am Mikroskop befestigt ist, um Bilder mit einer hohen Bildrate zu erfassen, um schnelle Veränderungen des Kalziumspiegels zu verfolgen. Für diese Studie, Bild mit einem sCMOS-System (Tabelle der Materialien) in der Lage, Vollbild-Bildgebung bei 100 Hz, wie Anstiegszeiten für die Ca2+ Signale können so schnell wie Dutzende von Millisekunden sein.
- Steuerung der Kameraaufnahme und LED-Fluoreszenzanregung mit einer Micro-Manager-Software, die in ImageJ10 gemäß den Anweisungen des Herstellers läuft (Materialtabelle).
- Verwenden Sie ein Open-Source-E-Mail-Plugin, das ein externes Open-Source-Mikrocontroller-Board (Tabelle der Materialien )verbindet, um die externen Timing-Impulse zu verwalten, um die Fluoreszenzerregung zu steuern.
HINWEIS: Digitale Outs sind von den digitalen Pins 8 bis 13 verfügbar, die die Ausgangsbits 0 bis 5 bereitstellen. Diese können als Basiswerte von 1, 10, 100 usw. adressiert werden. Die Einstellungen für serielle Ports sind in Tabelle 1 angegeben und auf der Micro-Manager-Website (Materialtabelle )verfügbar. Firmware für das Mikrocontroller-Board ist ebenfalls auf dieser Website verfügbar. - Um die Timing-Logik zu steuern, aktivieren Sie das Micromanager-Erfassungsprotokoll in der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Dies initiiert gleichzeitig eine voreingestellte Kamerarahmendauer und die Anzahl der zu aktivierenden Frames sowie den logischen Verschluss und die voreingestellte Gelbe LED für die Fluoreszenzerregung. In diesem Fall wird der gelbe LED-Vollzustandsschalter über den Mikrocontroller-Bit 1-Ausgang durch Pin 9 gesteuert. Die Kamera rahmen TTL (Rückplatte aus 3 Stecker) löst einen Stimulator aus. Dies genau mal die Aktivierung der Blaulicht-LED zur Aktivierung von Channelrhodopsin zu einem festgelegten Zeitpunkt nach Aktivierung der Bildsequenz. - Um Channelrhodopsin mit blauem Licht zu stimulieren und RCaMP-Änderungen aufzuzeichnen, verwenden Sie zwei LEDs. Aktivieren Sie Channelrhodopsin mit einer LED mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 470 nm und einem Bandpassfilter (455 bis 490 nm) und erregen Sie RCaMP mit einer LED mit einer Peak-Emissionswellenlänge von 594 nm und einem Bandpassfilter (570 bis 600 nm).
- Um kanalrhodopsin gleichzeitig zu aktivieren und Veränderungen der RCaMP-Fluoreszenzwerte zu erfassen, beleuchten Sie beide LEDs und übertragen Sie das Licht mit einem dichroitischen Strahlkombinator auf denselben optischen Pfad.
- Steuern Sie das Timing der LED-Beleuchtung mit Festkörperschaltern(Materialtabelle), die durch TTL-Signale gesteuert werden (maximale Einschaltzeit, 1 ms, Abschaltzeit 0,3 ms: 0 bis 90 % Einschalt- und Ausschaltzeit von < 100 s).
- Stellen Sie die LED-Intensität mit den stromgesteuerten linearen Netzteilen mit geringem Rauschen ein (Tabelle der Materialien).
- Um das genaue Timing der Blaulicht-LED zu gewährleisten, aktivieren Sie sie direkt per TTL-Impuls vom Stimulator aus an das Festkörperrelais. Programmieren Sie das Blaulichtstimulationsprotokoll in einen Stimulator (Tabelle der Materialien), der als präziser Timer vom Beginn der Bildaufnahme bis zur blauen LED-Beleuchtung fungiert. Schalten Sie in diesem Experiment die Blaulichtstimulation nach 2 s nur rCaMP-Fluoreszenz ein und verwenden Sie einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulsintervallen, um Channelrhodopsin zu aktivieren.
HINWEIS: Die Verzögerung vor blaulichten Impulsen, die Dauer der Blaulichtimpulse, die Zeit zwischen den Impulsen und die Anzahl der Impulse im Zug können an dieser Stelle eingestellt werden und sollten die spezifischen Parameter von experimentellem Interesse widerspiegeln.
2. C. elegans Probenvorbereitung und Datenerfassung
- Um präsynaptische Neuronen optisch zu stimulieren, erhalten Tiere, die Kanalrhodopsin in exzitatorischen cholinergen Neuronen exprimieren, angetrieben mit der Unc-17-Promotorregion, und RCaMP, ausgedrückt in allen Körperwandmuskeln, die mit dem Myo-3-Promotor angetrieben werden Region2.
HINWEIS: Es wird nur die Verwendung von Tieren mit integrierten Transgenen und robusten Fluoreszenzgehalten empfohlen, da die variable Expression in den entsprechenden Zelltypen die Zuverlässigkeit der Datenerfassung beeinträchtigen kann. - Machen Sie einen Arbeitsbestand vonAll-Trans-Retinal durch Verdünnung der Netzhautpulver ( Tabelle derMaterialien) in Ethanol, um eine endgültige Konzentration von 100 mM zu schaffen und lagern bei -20 °C. Dieser Arbeitsbestand wird für etwa ein Jahr stabil bleiben.
- Erstellen Sie einen Bestand von OP50 E. coli, der in LB-Medien angebaut wird, ergänzt durchAll-Trans-Retinal aus dem Arbeitsbestand in Schritt 2.2, bei einer Endkonzentration von 80 m. Das für den OP50+Retinal-Bestand verwendete Volumen hängt von der Anzahl der für das Experiment erforderlichen Platten ab.
- Samennematoden-Wachstumsmedienplatten (NGM) mit ca. 300 l op50+retinalen Vorrat und lassen Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht trocknen.
- Wachsen C. elegans Stämme bis zum gewünschten Alter im Dunkeln auf OP50 + retinale NGM Platten bei 20 °C. Verwenden Sie für dieses Experiment erwachsene Würmer.
- Für das Experiment mit der sezierten Zubereitung, verwenden Sie nur gravid erwachsene Würmer als Durchführung der Sezieren an jüngeren, kleineren Tieren ist extrem anspruchsvoll. Lassen Sie die Tiere für eine effektive Kanalrhodopsin-Aktivierung mindestens 3 Tage auf den OP50-Retinalen Platten.
- Wenn Sie das sezierte Präparat8,11 (Abbildung 1A) verwenden, führen Sie Sezierungen bei schwachem Licht durch.
- Legen Sie die Tiere in eine Sezierensteller mit einer silikonbeschichteten Deckslipbasis, die mit einer 1 mM Ca2+ extrazellulären Lösung bestehend aus 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 5 mM Saccharose und 15 mM HEPES (pH 7.3) gefüllt ist. , -340 Osm).
- Kleben Sie Tiere mit dem flüssigen topischen Hautkleber mit blauer Färbung entlang der Dorsalseite des Wurms und machen Sie einen seitlichen Cuticle-Schnitt entlang der Leim-Wurm-Schnittstelle mit Glasnadeln.
- Verwenden Sie eine Mundpipette, um die innere Eingeweide aus der Wurmhöhle zu löschen.
- Kleben Sie die Nagelhautklappe des Tieres herunter, um die ventralen medialen Körperwandmuskeln für die Bildgebung freizulegen.
- Bei Verwendung des Nanoperlenpräparats (Abbildung 1B)
- Machen Sie eine geschmolzene 5% Agarose-Lösung mit ddH2O bis zu einem Endvolumen von 100 ml.
- Mit einer Pasteur-Pipette einen Tropfen geschmolzener Agarose-Lösung auf eine Glasrutsche legen und sofort eine zweite Glasrutsche über die Oberseite legen, senkrecht zur ersten, mit sanftem Druck, um ein gleichmäßiges Agarose-Pad zu schaffen. Entfernen Sie die obere Folie vor der Verwendung.
- Fügen Sie etwa 4 L Polystyrol-Nanoperlen (Tabelle der Materialien) in die Mitte des Agarose-Pads.
- Wählen Sie bei schwachem Licht 4-6 C. Elegane in die Nanobead-Lösung, um sicherzustellen, dass die Tiere nicht übereinander liegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlappen auf die Oberseite.
- Legen Sie die vorbereitete Rutsche oder Sezierschale auf das Mikroskop, und finden und konzentrieren Sie sich auf einen Wurm mit 10-facher Vergrößerung und trüber heller Feldbeleuchtung.
- Wechseln Sie zu 60x Vergrößerung und RCaMP Fluoreszenzerregung, um einen ventromedialen Körperwandmuskel zu identifizieren, der vor der Vulva und in der richtigen Fokalebene ist.
HINWEIS: Muskeln, die der Vulva voranstehen, werden ausgewählt, da sie Muskeln reflektieren, die häufig in elektrophysiologischen Experimenten stimuliert werden. - Ändern Sie den Bildweg vom Okular zur Kamera, indem Sie den Umschalter herausziehen und innerhalb der Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien )auf Live klicken.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsweg für blaues Licht an dieser Stelle ausgeschaltet ist, um sicherzustellen, dass das Channelrhodopsin vor der Aufnahme von Bildern nicht aktiviert wird. - Fokussieren Sie das Bild innerhalb der Datenerfassungssoftware mit dem Mikroskop Feinfokus.
- Sobald der Muskel klar im Fokus ist, schalten Sie das Live-Bild aus, indem Sie auf die Live-Taste klicken.
- Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche in der Datenerfassungssoftware, und erstellen Sie eine Box um den Muskel, auf den sie fokussiert sind.
- Schalten Sie am Stimulator den zuvor in Schritt 1.10 programmierten Blaulichtstimulationsweg ein.
- Klicken Sie in der Bildverarbeitungssoftware auf Übernehmen, um das Bild über die CMOS-Kamera zu erfassen. Stellen Sie dazu die Belichtungszeit mit 1.000 Frames und 2x Binning auf 10 s ein.
3. Datenanalyse
- Öffnen Sie die Datendatei in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) und skizzieren Sie mit dem Polygon-Toolden Interessensmuskel. Das ist der ROI.
- Gehen Sie zu Bild | Stapel | Plotten Sie das Z-Achsenprofil und exportieren Sie die resultierenden Datenpunkte in die Tabellenkalkulationssoftware (Tabelle der Materialien). Diese Funktion zeichnet den Mittelwert der ROI-Auswahl im Vergleich zum Zeitpunkt.
- Verschieben Sie den Mitdemkraft-ROI des Muskels, der mit dem Polygon-Werkzeug außerhalb des Tieres erstellt wurde, um eine Fluoreszenzmessung im Hintergrund mithilfe der in 3.2 beschriebenen Schritte zu erhalten. Exportieren Sie die resultierenden Daten in die Tabellenarbeitsmappe.
- Subtrahieren Sie in der Tabellenarbeitsmappe die Hintergrundfluoreszenzwerte von den Muskelfluoreszenzwerten zu jedem Zeitpunkt. Dadurch wird das im Hintergrund subtrahierte Fluoreszenzsignal zur Verfügung.
- Durchschnitt der im Hintergrund subtrahierten Fluoreszenz für die ersten 2 s Datenpunkte. Dadurch wird die Basisfluoreszenzmessung F.
- Verwenden Sie die Basisfluoreszenzmessung, um den normalisierten Fluoreszenzpegel zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Verwenden Sie dazu die Gleichung (F/F)+1. F steht für (F(t)-F), wobei F(t) die Fluoreszenzmessung zu einem bestimmten Zeitpunkt und F der Basiswert ist. Die +1 wird als y-Achsenversatz hinzugefügt.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.6 für jedes gesammelte Muskelbild. Die Verwendung einzelner oder mehrerer Muskelzellen pro Bild liegt im Ermessen des Forschers. Das n des Experiments kann durch durchführung einer Leistungsanalyse bestimmt werden.
- Verwenden Sie die verarbeiteten Daten aus den Schritten 3.2-3.6, um eine Spur der Fluoreszenzwerte in der Graphik-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle der Materialien) zu erstellen.
- Messen Sie anhand dieser Spur die Kinetik des Kalziumtransienten, wie z. B. Anstieg auf Spitzenzeit und halbzerfallszeit, mit den Indizierungswerkzeugen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
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Representative Results
Diese Technik bewertete Veränderungen bei Mutanten, von denen angenommen wird, dass sie die Kalziumhandhabung oder Muskeldepolarisation beeinflussen. Die Grundfluoreszenzspiegel und fluoreszierenden Transienten wurden visualisiert und ruhende zytosolische Kalzium- und Calciumkinetik innerhalb des Muskels wurden ausgewertet. Es ist wichtig, dass die Tiere mindestens drei Tage lang auf All-Trans-Retina angebaut wurden, um die erfolgreiche Integration der Netzhaut zu gewährleisten und so anschließend das Kanalrhodopsin zu aktivieren (Abbildung 2A). Wenn Tiere nicht alltransretinal ausgesetzt sind, wird kein Muskelkalziumtransient ausgelöst (Abbildung 2B). Obwohl diese Tiere immer noch zur Bewertung des zytosolischen Kalziumspiegels verwendet werden können, werden keine dynamischen Veränderungen des Kalziums erfasst. Darüber hinaus wird das Tier als interne Kontrolle für die Gesundheit von Tieren oder Sezierungen nach Blaulichtstimulation zusammenziehen. Eine Aufnahme mit einer Muskelkontraktion, die minimale grobe Bewegung des Wurmkörpers verursacht, wurde für die Datenerfassung ausgewählt, wenn Nanoperlen für die Immobilisierung verwendet werden. Wenn der Muskel, der zur Erfassung der Rohfluoreszenzwerte verwendet wird, sich kräftig zusammenzieht, wodurch sich der gesamte Körper des Wurms bewegt, spiegelt die transiente Spur dieses Bewegungsartefakt wider (Abbildung 2C) und sollte aus der Quantifizierung verworfen werden.
Eine Mutationskartierung zum Sca-1-Gen-Lokus wurde von einem Bildschirm für Mutationen isoliert, die die Lokalisierung des C. elegans-Muskel-Nikotinrezeptors beeinflussen. Das C. elegans sca-1-Gen kodiert den einzigen Homolog des Sarco(endo)plasmischen Retikulatus-Calciumatas (SERCA) im Wurm und ist die einzige SERCA-Pumpe, die in den Körperwandmuskeln12,13vorhanden ist. Verlust der Funktion Sca-1 Mutanten wurden vorhergesagt, um Veränderungen in der Muskel-Calcium-Handhabung auf der Grundlage der wichtigen Rolle SERCA spielt bei der Aufrechterhaltung der Kalziumhomöostase in Säugetiermuskeln14,15,16 ,17,18. Der GECI RCaMP wurde in den Körperwandmuskeln und das blaue lichtaktivierte Channelrhodopsin in exzitatorischen cholinergen Neuronen exprimiert, um sowohl die intrazelluläre Baseline-Calcium- als auch die Calciumdynamik bei Sca-1-Mutanten zu bewerten. Mit der sezierten Präparationstechnik wurden Im Vergleich zur Kontrolle(Abbildung 3A,B) Erhöhungen der RCaMP-Fluoreszenzwerte im Sca-1-Mutanten beobachtet , was darauf hindeutet, dass der Verlust der SERCA-Funktion erhöhte Konzentrationen von ruhendem zytoplasmatischem Kalzium. Bei der Untersuchung der Calciumdynamik nach präsynaptischer Stimulation, die mit einem Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen ausgelöst wurde (Abbildung 3C), gab es einen signifikanten Rückgang der Kalziumspitzen in den sca-1(tm5339) Mutanten als im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 3D), die reduzierte Kalziumspeicher in der SR widerspiegeln kann. Allerdings gab es keine Veränderung im Anstieg der Spitzenzeit oder der halben Zerfallszeit(Abbildung 3E,F). Dies deutet darauf hin, dass evozierte Veränderungen des zytosolischen Kalziums aus einer externen Quelle, wie z. B. Kalziumeintrag durch Acetylcholin-Rezeptoren und/oder spannungsgekabelte Kalziumkanäle sowie aus internen Speichern, nicht von sca-1(tm5339) Mutanten betroffen sind. . Ähnliche Ergebnisse können mit hilfe der Nanoperlenpräparation beobachtet werden, wie in Abbildung 419dargestellt. Diese Rekapitulation der Daten liefert Beweise dafür, dass beide Techniken physiologisch für die Messung der Körperwandmuskel ruhen den zytoplasmatischen Kalziumspiegel sowie die Beobachtung stimulierter Kalziumtransienten sind. Dies zeigt auch, dass die Zerlegung des Wurms keine Schäden an dem Tier verursacht, die seine Kalziumhandhabung oder die Fähigkeit, postsynaptische Muskeln zu depolarisieren verändert.
Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Mutanten zu untersuchen, die indirekt die Kalziumbehandlung in C. elegansbeeinflussen. Der Verlust von Funktionsslo-1(eg142) Mutanten wurde ausgewertet, um dies zu demonstrieren. Das Slo-1-Gen kodiert einen kalziumaktivierten BK-Kaliumkanal, der sowohl in Neuronen als auch in Muskeln20,21ausgedrückt wird. Studien haben zuvor eine Rolle für SLO-1 in Körperwandmuskeln beschrieben, zeigt, dass der Verlust der Funktion Mutanten haben einen Defekt in der postsynaptischen Repolarisation nach Muskel-WirkungPotenziale20,21. Mögliche Veränderungen des Kalziumspiegelspiegels und der transienten Kalziumdynamik aufgrund dieser Hypererregbarkeit wurden mittels Nanobead-Immobilisierung untersucht. Als die Ausgangswerte von RCaMP gemessen wurden, zeigten Slo-1(eg142) Mutanten eine Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 5A,B)19. Dies deutet darauf hin, dass BK-Kanäle auch die Ausgangswerte von zytosolischem Kalzium regulieren können. Bei der Bewertung der Kinetik des evozierten Kalziumtransienten wurden keine Veränderungen des Kalziumspitzenspiegels im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5C,D) beobachtet. Die Slo-1(eg142) Mutanten wiesen jedoch einen deutlich erhöhten Anstieg auf Spitzenzeit im Vergleich zur Kontrolle auf (Abbildung 5E). Dies kann auf einen zuvor gemeldeten Anstieg der präsynaptischen Erregbarkeit20,21widerspiegeln. Es gab jedoch keine signifikante Veränderung der halbzerkungshalber Zerfallszeit in slo-1(eg142) Mutanten im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5F). Zusammen zeigen diese Daten, dass diese Methode verwendet werden kann, um die Auswirkungen von prä- und postsynaptischen Mutationen auf ruhende und stimulierte Körperwandmuskel Kalzium zu bewerten.
| Serielle Einstellung | wert |
| Antworttimeout | 500 |
| Baud-Rate | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handshaking | weg |
| gleichstellung | nichts |
| Stopbits | 1 |
| wortreich | 0 |
Tabelle 1: Serielle Porteinstellungen für Mikrocontroller-Plugin, das eine externe Mikrocontroller-Platine steuert. Dies wird verwendet, um externe Timing-Impulse zu programmieren, um die Fluoreszenzerregung zu steuern.
Abbildung 1: Grafische Darstellung verschiedener Immobilisierungstechniken. (A) Diese Grafik zeigt die Seziertechnik für die Immobilisierung. Der Körper des Wurms ist (blau) um die Rückenseite des Tieres geklebt. Ein dorsaler Schnitt entlang der Nagelhaut erzeugt eine Nagelhautklappe. Diese Klappe wurde verklebt, um die intakten NMJs zwischen Synapsen der ventralen Nervenschnur in grün (Channelrhodopsin) und RCaMP auszudrückenden Muskeln in Rot zu entlarven. (B) Diese Grafik zeigt die Nanobead-Immobilisierungstechnik. Der intakte Wurm ist umgeben von einer Darstellung der Nanoperlen in Lösung, die, wenn sie durch den darüber liegenden Deckslip komprimiert werden, den Wurm immobilisieren. Durch die Transparenz von C. eleganskann die ventrale Nervenschnur in Grün (Channelrhodopsin) visualisiert werden und RCaMP-exemitzente Muskeln können rot visualisiert werden. Der Eizelle in der Mitte des Wurms stellt die Vulva dar, die ein Wahrzeichen ist, das die ventralen Körperwandmuskeln identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Spuren von Kalziumtransienten. (A) Einzelspurendarstellung eines Kalziumtransienten, der durch einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen in 50 ms Interpulsintervallen evoziert wird, aufgezeichnet bei einem Tier mit begrenzter Körperbewegung (- Bewegung), das in Gegenwart vonall-trans retinalen (+ trans-retinal). Die Spike-Artefakte sind die Blaulichtstimulationsimpulse, da beide LEDs gleichzeitig mitbeleuchtet werden. (B) Einzelspurendarstellung, die das Fehlen eines Kalziumtransienten als Reaktion auf einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulse-Intervallen bei einem Tier zeigt, das nichtall-trans retinal (- all-trans retinal , - Bewegung). (C) Einzelspurendarstellung eines Kalziumtransienten, der durch einen Zug von 5, 2 ms Blaulichtimpulsen mit 50 ms Interpulsintervallen evoziert wurde, aufgezeichnet bei einem Tier, das eine signifikante Muskelkontraktion hatte, die zu Bewegungsartefakten führte (+ Bewegung, + all-trans retinal). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Baseline-Calciumspiegel und evozierte Calciumtransienten aus Kontroll- und Sca-1(tm5339)-Proben, die mit der Seziertechnik hergestellt wurden. (A) Repräsentative Bilder der RCaMP-Fluoreszenz basismäßig in sca-1(tm5339) Mutanten und Kontrollen. Skala bar = 50 m. (B) Basisfluoreszenzniveaus Quantifizierung in sca-1(tm5339) Mutanten (n=13) und Kontrolle (n=9). (C) Ensemble durchschnittliche Spuren von evozierten Kalziumtransienten für sca-1(tm5339) Mutanten und Kontrolltiere. (D) Quantifizierung der Spitzen-RCaMP-Fluoreszenz aus Kanalrhodopsin evozierte Calciumreaktionen in sca-1(tm5339) Mutanten (n=12) und Kontrollen (n=9). (E) Quantifizierung des Anstiegs der Spitzenzeit von Kanalrhodopsin evozierte Calciumtransienten in sca-1(tm5339) Mutanten (n=12) und Kontrollen (n=8). (F) Halbzeit-Zerfallszeit-Quantifizierung von Kanalrhodopsin evozierte Calciumtransienten in sca-1(tm5339) Mutanten (n=12) und Kontrollen (n=7). Statistisch signifikante Werte waren: nicht signifikant p>0,05, * p-0,05, ** p-0,01, *** p-0,001. Fehlerbalken stellen den Mittelwert sem dar. Daten wurden mit Shapiro-Wilk-Tests normalisiert und die Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test für nicht-normale Verteilungen bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Baseline-Calciumspiegel und evozierte Calciumtransienten aus Kontroll- und Sca-1(tm5339)-Proben, die mit Nanobead-Immobilisierung hergestellt wurden. (A) Repräsentative Bilder der Basisfluoreszenz in sca-1(tm5339) Mutanten und Steuerungen, Maßstabsbalken 50 m (B) Quantifizierung der RCaMP-Basisfluoreszenzwerte in sca-1(tm5339) Mutanten (n=14) und der Steuerung (n=13) und der Steuerung (n=13) . (C) Durchschnitt der evozierten Calciumtransienten für sca-1(tm5339) Mutanten und Kontrollen. (D) Quantifizierung der RCaMP-Fluoreszenz nach evozierter Calciumantwort in sca-1(tm5339) Mutanten (n=14) und Kontrollen (n=13). (E) Quantifizierung des Anstiegs der Spitzenzeit evozierter Calciumtransienten in sca-1(tm5339) Mutanten (n=14) und Kontrollen (n=12). (F) Quantifizierung der halben Zerfallszeit evozierter Calciumtransienten in sca-1(tm5339) Mutanten (n=14) und Kontrolle (n=13). Die Abbildung wird von19angepasst. Statistisch signifikante Werte waren: nicht signifikant p > 0,05, * p - 0,05, ** p - 0,01, *** p - 0,001. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert SEM. Die Datennormalität wurde mit Shapiro-Wilk-Tests bewertet und die Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test für nicht-normale Verteilungen ermittelt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Baseline-Calciumspiegel und evozierte Calciumtransienten aus Kontroll- und Slo-1(eg142)-Proben, die mit Nanoperlen immobilisiert wurden. (A) Repräsentative Bilder der Ausgangsfluoreszenz in Slo-1(eg142) Mutanten und Steuerungen, Skalenbar 50 m (B) Quantifizierung der RCaMP-Basisfluoreszenzspiegel in Slo-1(eg142) Mutanten (n=29) und der Kontrolle (n=13). (C) Durchschnitt der evozierten Calciumtransienten für Slo-1(eg142) Mutanten und Kontrollen. (D) Quantifizierung der RCaMP-Fluoreszenz nach evozierter Calciumantwort in Slo-1(eg142) Mutanten (n=29) und Kontrollen (n=13). (E) Quantifizierung des Anstiegs der Spitzenzeit evozierter Calciumtransienten in slo-1(eg142) Mutanten (n=29) und Kontrollen (n=13). (F) Quantifizierung der halben Zerfallszeit evozierter Calciumtransienten in slo-1(eg142) Mutanten (n=11) und Kontrollen (n=13). Die Abbildung wird von19angepasst. Statistisch signifikante Werte waren: nicht signifikant p > 0,05, * p - 0,05, ** p - 0,01, *** p - 0,001. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert SEM. Die Datennormalität wurde mit Shapiro-Wilk-Tests bewertet und die Signifikanz wurde mit einem Mann-Whitney-Test für nicht-normale Verteilungen ermittelt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
GECIs sind ein leistungsfähiges Werkzeug in c. elegans Neurobiologie. Frühere Arbeiten haben Kalzium-Bildgebungstechniken verwendet, um eine Vielzahl von Funktionen in Neuronen und Muskelzellen zu untersuchen, einschließlich sensorischer und Verhaltensreaktionen, mit verschiedenen Methoden der Stimulation. Einige Studien haben chemische Reize verwendet, um Kalziumtransienten in sensorischen ASH-Neuronen22,23 auszulösen oder Kalziumwellen in den Rachenmuskeln zu induzieren24. Eine andere Gruppe nutzte die mechanische Stimulation, während Würmer in mikrofluidischen Chips gehalten wurden, um Kalziumreaktionen in Berührungsrezeptor-Neuronen25zu untersuchen. Dennoch haben andere elektrische Stimulation verwendet, um Kalziumveränderungen in den Neuronen26 und Körperwandmuskeln27zu visualisieren. Was zwischen diesen Studien gemeinsam ist, ist die Anforderung von äußeren Reizen, wie Lösungen oder Geräten, Kalziumtransienten auszulösen. Das hier skizzierte Protokoll profitiert von der Kontrolle, die durch die optogenetische Stimulation gewonnen wird, die neuronale Spezifität bietet, gekoppelt mit der funktionellen Analyse von muskelausgedrückten GECIs2 im selben experimentellen Paradigma.
Es werden zwei Formen der Wurmimmobilisierung beschrieben, und während jede Methode bei der Deckung des experimentellen Bedarfs bewertet werden sollte, liefern sowohl sezierte als auch physiologisch intakte Präparate komplementäre Ergebnisse, die es den Forschern ermöglichen, beide Ansätze zu verwenden. in ihrer Forschung. Es gibt eine erhöhte technische Herausforderung bei der Verwendung der Seziertechnik, wobei der Benutzer sowohl die präzise Verwendung des chirurgischen Leims als auch der Mikrosektion beherrschen muss, ohne die Nervenschnur oder Muskeln zu beschädigen. Zusätzlich sollten aufgrund des Schwierigkeitsgrads der Sezierung nur gravid Erwachsene verwendet werden, was die experimentellen Zeitpunkte begrenzen könnte. Darüber hinaus ist die Seziertechnik auch viel schwieriger auf Mutanten durchzuführen, die kleine, dünne oder kranke Tiere produzieren, was wiederum möglicherweise experimentelle Parameter begrenzt. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie das Körperbewegungsartefakt infolge der Depolarisation einschränkt, das Kleben eine übermäßige Bewegung des Wurmkörpers verhindert und auch den Zugriff auf das NMJ für Lösungsänderungen und Arzneimittelanwendungen ermöglicht. Zusätzlich setzt jedes Präparat den gleichen Bereich des Wurms frei, was garantiert, dass die Körperwandmuskulatur konsequent im Fokus steht. Die zweite Technik, nanobeads zur Immobilisierung der Würmer, ist weniger beteiligt und kann schnell erlernt werden. Auch können alle Alterstiere mit dieser Methode verwendet werden, so dass Veränderungen in der Kalziumbehandlung durch Entwicklung überwacht werden können. Beim Einsetzen der Würmer in die Nanoperlenlösung ist Vorsicht geboten, da zu viel Manipulation der Tiere zum Platzen führen kann. Außerdem darf der Deckelrutsch nicht einmal auf die Tiere gelegt werden, da dies dazu führen kann, dass die Tiere sich selbst rollen oder verdrehen, was wiederum zu Schäden führt. Obwohl die Verwendung der Nanoperlen einen Hochdurchsatz-Assay liefern kann, bei dem die Tiere möglicherweise geborgen werden könnten, gibt es keine Standardisierung der Körperposition des Tieres, so dass jedes Tier möglicherweise nicht über Körperwandmuskeln in einer klaren Fokalebene hat. Wenn das Experiment eine große Anzahl von Tieren erfordert, können verschiedene Methoden der Immobilisierung erforderlich sein, wie z. B. Mikrobrunnen auf Agarbasis, die eine Massen-Calciumfluoreszenz-Bildgebung ermöglichen28. Ungeachtet der Grenzen dieser beiden Techniken können entweder zuverlässige, leicht quantifizierbare Kalziumtransienten innerhalb der Körperwandmuskulatur von C. elegans verwendet werden.
C. elegans bieten viele Vorteile als In-vivo-System für die funktionellen Bildgebungsstudien. Die Tiere sind transparent, so dass die Paarung der optogenetischen neuronalen Depolarisation durch die Verwendung von Channelrhodopsin mit dem GECI RCaMP ermöglicht, um die resultierenden postsynaptischen Kalziumtransienten im Muskel zu messen. Prästimulationsniveaus der RCaMP-Fluoreszenz können auch verwendet werden, um den zytosolischen Calciumspiegel zu bewerten. Die genetische Traktionsfähigkeit von C. elegans macht die Untersuchung neuartiger Mutationen, die die Kalziumhomöostase oder die Handhabung leicht zu verfolgen haben können, oft mit leicht verfügbaren mutierten Allelen. Mit den in diesem Protokoll beschriebenen Techniken können postsynaptische Calcium-Imaging-Daten effizient und zu relativ niedrigen Kosten gewonnen werden, was dies zu einem attraktiven System für eine Vielzahl von bildgebenden Experimenten macht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Alexander Gottschalk für ZX1659, den RCaMP und Channelrhodopsin mit Wurmstamm, Dr. Hongkyun Kim für den Slo-1(eg142) Wurmstamm und das National Bioresource Project for the sca-1(tm5339) Wurmstamm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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