Summary
Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.
Abstract
Model organizma C. elegans in vivo kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Şeffaf gövdesi ve genetik manipulability genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri hedefli ifade sağlar. Bu protokol, hedeflenen hücrelerde kalsiyum dinamiklerinin in vivo görüntüleme için bu sensörlerin kullanımını özetliyor, özellikle solucanların vücut duvarı kasları. Presinaptik kanalrodopsin inko-ekspresyonu kullanılarak, uyarıcı motor nöronlardan asetilkolin salınımının uyarılması mavi ışık darbeleri kullanılarak indüklenebilir, kas depolarizasyonu ve sitoplazmik kalsiyumda tekrarlanabilir değişikliklerle sonuçlanabilir. Düzey. İki solucan immobilizasyon teknikleri zorluk değişen düzeylerde tartışılmıştır. Bu tekniklerin karşılaştırılması, her iki yaklaşımın da nöromüsküler kavşak fizyolojisini koruduğunu ve kalsiyum geçicilerinin tekrarlanabilir nicelifikasyonuna olanak sağladığını göstermektedir. Optogenetik ve fonksiyonel kalsiyum görüntüleme ile postsinaptik kalsiyum kullanımı ve homeostazdaki değişiklikler çeşitli mutant arka planlarda değerlendirilebilir. Sunulan veriler hem immobilizasyon tekniklerini doğrular hem de özellikle C. elegans sarco(endo)plazmik retiküler kalsiyum ATPaz ve vücut duvarı kas kalsiyum regülasyonundaki kalsiyum aktive Edilmiş BK potasyum kanalının rollerini inceler.
Introduction
Bu yazıda optogenetik nöronal stimülasyon kullanarak C. elegans vücut duvarı kaslarının in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemleri sunmaktadır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü (GECI) ile mavi ışık la eşleşen bir kasın eşleşmesi nöronal depolarizasyonu tetikler ve uyarılmış postsinaptik kalsiyum geçicilerini net bir şekilde gözlemleyen bir sistem sağlar. Bu, postinaptik kalsiyum dinamiklerini etkileyen mutantların non-invaziv analizini sağlayarak elektriksel stimülasyonkullanımını önler.
GCaMP gibi tek floroforem GECIs, C-terminus'ta n-terminal ucunda ve calmodulin (CaM) miyozin ışık zinciri kimyazının M13 etki alanına erimiş tek bir floresan protein molekülü kullanır. Kalsiyum bağlanması üzerine, kalsiyum afiniteyüksek olan CaM etki alanı, floresan protein sonraki konformasyonel değişim indükleyen bir konformasyonel değişim uğrarfloresanyoğunluğu nda bir artışa yol açan 1 . GCaMP floresan 488 nm heyecanlı, channelrhodopsin ile birlikte kullanılmak üzere uygun hale, hangi benzer bir uyarma dalga boyu vardır 473 nm. Bu nedenle, kalsiyum ölçümlerini kanaloidsin stimülasyonu ile çifte ayırmak için, GCaMP'ın yeşil floresan proteininin kırmızı floresan proteini mRuby (RCaMP) ile değiştirilmesi gerekir. Kas ifade RCaMP kullanarak, channelrhodopsin kolinerjik motor nöron ekspresyonu ile birlikte, aynı hayvan içinde optogenetik ve fonksiyonel görüntüleme eşzamanlı kullanımı ile solucan nöromüsküler kavşak (NMJ) çalışmaları izin verir 2 .
Channelrhodopsin kullanımı C. elegansnöromüsküler kavşaklar depolarize etmek için elektrikstimülasyon ihtiyacını atlar , sadece diseksiyon preparatları elde edilebilir, böylece bu tekniği hem daha kolay istihdam ve daha hassas hale belirli dokuları hedef alırken. Örneğin, channelrhodopsin daha önce C. elegans geri belirli nöronları etkinleştirmek için kullanılmıştır, uyarıcı veya inhibitör nöronların ya sağlam aktivasyonu yolaçan 3,4. Işık uyarılmış depolarizasyon kullanımı da doğrudan elektriksel stimülasyon nedeniyle nöronal hasar sorunu atlatMaktadır. Bu postsinaptik kalsiyumdinamikleri4, sürekli ve tekrarlanan stimülasyonlar da dahil olmak üzere birçok farklı stimülasyon protokolleri, etkilerini incelemek için bir fırsat sağlar.
C. elegans şeffaf doğası floresan görüntüleme fonksiyonel analiz için ideal hale getirir. Ancak, NMJ de uyarıcı asetilkolin nöronlar uyarıcı, hayvanların ani bir kas kasılması ile yanıt bekleniyor4, ayrık kalsiyum değişiklikleri görselleştirme solucanların immobilizasyon kritik hale. Geleneksel olarak, farmakolojik ajanlar hayvanları felç etmek için kullanılmıştır. Kullanılan böyle bir ilaç levamisole, bir kolinerjik asetilkolin reseptör agonist5,6,7. Levamisole uyarıcı kas reseptörlerinin bir alt tipinin kalıcı aktivasyonuna yol açtığından, bu reaktif kas kalsiyum dinamiğinin incelenmesi için uygun değildir. Levamisole eylem postsinaptik depolarizasyon neden olur, sitosolik kalsiyum yükselterek, ve presinaptik stimülasyon aşağıdaki gözlemler oklüt. Felç edici ilaçların kullanılmasını önlemek için C. elegans'ıetkisiz hale getirmek için iki alternatif yöntem irdeledik. Hayvanlar ya yapıştırılmış ve daha sonra vücut duvar kasları ortaya çıkarmak için açık, mevcut C. elegans NMJ elektrofizyoloji yöntemi8benzer, ya da nanoboncuklar bozulmamış hayvanları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır9. Her iki prosedür kolayca ölçülebilir olan istirahat ve uyarılmış kas kalsiyum geçici tekrarlanabilir ölçümler için izin verdi.
Bu yazıda yöntemler Temel sitosolik kalsiyum düzeyleri ve Geçici olarak m. eleganspostsinaptik vücut duvarı kas hücrelerinde ölçmek için kullanılabilir. İki farklı immobilizasyon tekniğini kullanan veri örnekleri verilmiştir. Her iki teknik elektriksel stimülasyon kullanmadan kas hücrelerini depolarize etmek için optogenetik yararlanmak. Bu örnekler, solucanlarda postinaptik kalsiyum kullanımını etkileyen mutasyonların değerlendirilmesinde bu yöntemin fizibilitesini göstermekte ve iki immobilizasyon yaklaşımının artılarını ve eksilerini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroskop kurulumu
- Floresan yetenekleri ile bileşik bir mikroskop kullanın. Bu çalışma için veriler, uyarma için LED'lerle donatılmış dik bir mikroskop(Malzeme Tablosu)üzerinde toplanmıştır.
- Vücut duvarı kaslarındaki floresan değişikliklerini doğru bir şekilde görselleştirmek için yüksek büyütme hedefi kullanın.
- Parçalanmış preparatlar için 60x NA 1.0 su daldırma hedefi(Malzeme Tablosu)kullanın.
- Nanoboncuklar kullanarak hazırlıklar için, 60x NA 1.4 yağ daldırma hedefi(Tablo Malzemeler)kullanın. Bu büyütme, kasların kamera sensörüne yeterli çözünürlüğü sağlar.
- Kalsiyum seviyelerindeki hızlı değişimleri izlemek için yüksek kare hızında görüntü yakalamak için mikroskoba bağlı yüksek hassasiyetli bir kamera kullanın. Bu çalışmada, 100 Hz'de tam kare görüntüleme yapabilen bir sCMOS sistemi(Tablo)ile görüntü, Ca2+ sinyallerinin yükselme süreleri onlarca milisaniye kadar hızlı olabilir.
- Üreticinin talimatlarına göre ImageJ10'da çalışan bir mikro-manager yazılımı ile kamera edinimi ve LED floresan uyarma kontrol edin(Malzeme Tablosu).
- Floresan uyarma kontrol etmek için harici zamanlama darbeleri yönetmek için harici bir açık kaynak mikrodenetleyici kurulu(Malzeme Tablosu)bağlayan bir açık kaynak elektronik platform eklentisi kullanın.
NOT: Dijital çıkışlar, 0'dan 5'e çıkış biti sağlayan 8-13 dijital pinlerden edinilebilir. Bunlar 1, 10, 100, vb temel 2 değerleri olarak ele alınabilir. Seri bağlantı noktası ayarları Tablo 1'de belirtilir ve mikro yönetici web sitesinden(Malzeme Tablosu)ulaşılabilir. Mikrodenetleyici kurulu için Firmware benzer şekilde bu web sitesinde mevcuttur. - Zamanlama mantığını kontrol etmek için, yazılımdaki micromanager satın alma protokolünü üreticinin talimatlarına(Malzeme Tablosu)göre etkinleştirin.
NOT: Bu aynı anda önceden ayarlanmış bir kamera çerçevesi süresi ve aktive edilecek çerçeve sayısının yanı sıra floresan uyarma için mantıksal deklanşör ve önceden ayarlanmış kehribar LED'i başlatır. Bu durumda, kehribar LED katı hal anahtarı mikrodenetleyici bit 1 çıkışı ile pin 9 ile kontrol edilir. Kamera, TTL'yi (arka plaka çıkış 3 konektör) çerçeveler bir uyarıcıyı tetikler. Bu tam kez görüntüleme dizisinin aktivasyonu aşağıdaki belirli bir zamanda channelrhodopsin aktivasyonu için mavi ışık LED aktivasyonu. - Mavi ışık ile channelrhodopsin uyarmak ve RCaMP değişiklikleri kaydetmek için, iki LED kullanın. 470 nm maksimum emisyon dalga boyuna ve bir bandpass filtresine (455-490 nm) sahip bir LED ile channelrhodopsin'i etkinleştirin ve 594 nm'lik en yüksek emisyon dalga boyuna ve bandpass filtresine (570-600 nm) sahip bir LED ile RCaMP'yi heyecanlandırın.
- Aynı anda channelrhodopsin etkinleştirmek ve RCaMP floresan düzeylerinde değişiklikleri yakalamak için, her iki LED'leri birlikte aydınlatın ve bir dikroik ışın birlatör kullanarak aynı optik yola ışığı iletin.
- TTL sinyalleri (maksimum anma açma süresi, 1 ms, 0,3 ms: 0 ila %90 açma ve < 100 μs' lik açma süresi) tarafından kontrol edilen katı hal anahtarları(Malzeme Tablosu)ile LED aydınlatmanın zamanlamasını kontrol edin.
- LED yoğunluğunu, geçerli kontrollü düşük gürültülü doğrusal güç kaynakları(Malzeme Tablosu)ile ayarlayın.
- Mavi ışık LED'inin kesin zamanlamasını sağlamak için, doğrudan TTL darbe ile bir uyarıcıdan katı hal rölesine etkinleştirin. Mavi ışık stimülasyon protokolünü, görüntü ediniminin başlangıcından mavi LED aydınlatmasına kadar hassas bir zamanlayıcı görevi gören bir uyarıcıya(Malzeme Tablosu)programlayın. Bu deneyde, sadece RCaMP floresan yakalama 2 s sonra mavi ışık stimülasyon açın ve 50 ms interpulse aralıkları ile 50 ms mavi ışık darbeleri bir tren kullanın kanaloiddopsin etkinleştirmek için.
NOT: Mavi ışık darbelerinden önceki gecikme, mavi ışık darbelerinin süresi, darbeler arasındaki süre ve trendeki darbe sayısı bu noktada ayarlanabilir ve deneysel ilginin belirli parametrelerini yansıtmalıdır.
2. C. elegans örnek hazırlama ve veri toplama
- Optik presinaptik nöronlar uyarmak için, uyarıcı kolinerjik nöronlarda channelrhodopsin ifade hayvanlar elde, unc-17 promotör bölgesi ile tahrik, ve RCaMP myo-3 organizatörü ile tahrik tüm vücut duvarı kasları ifade bölge2.
NOT: İlgili hücre tiplerindeki değişken ifade veri toplamanın güvenilirliğini etkileyebileceğinden, yalnızca entegre transgenlere ve sağlam floresan seviyelerine sahip hayvanların kullanılması önerilir. - 100 mM'lik son konsantrasyonu oluşturmak ve -20 °C'de depolamak için retina tozunu(Malzeme Tablosu)etanolde seyrelterek tümtrans retinal bir çalışma stoku yapın. Bu çalışma stoku yaklaşık bir yıl boyunca istikrarlı olacaktır.
- OP50 E. colibir stok oluşturun , LB medyada yetiştirilen, 80 μM son konsantrasyonda, adım 2.2 yapılan çalışma stokundan tümtrans retinal ile desteklenmektedir. OP50+retinal stok için kullanılan hacim deney için gerekli plaka sayısına bağlı olacaktır.
- OP50+retinasi stokunun yaklaşık 300°L'sine sahip tohum nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları, plakaların karanlıkta oda sıcaklığında bir gecede kurumasını sağlar.
- 20 °C'de OP50+retinal NGM plakalarında karanlıkta istenilen yaşa kadar c. elegans suşları büyütün. Bu deney için yetişkin solucanlar kullanın.
- Diseksiyonlu preparatı kullanan deney için, sadece gravid yetişkin solucanları kullanın, daha genç, küçük hayvanlar üzerinde diseksiyonu yapmak son derece zordur. Etkili bir kanalrodopsin aktivasyonu için en az 3 gün op50 retinal plakalar üzerinde hayvanları bırakın.
- Eğer diseksiyonlu preparat8,11 ( Şekil1A)kullanıyorsanız, düşük ışıkta diseksiyonlar yapın.
- 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 4 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 5 mM sakkaroz ve 15 mM HEPES 'den oluşan silikon kaplı kapak lı taban ile hayvanları bir diseksiyon kabına yerleştirin (pH 7.3 , -340 Osm).
- Solucanın sırt tarafı boyunca mavi boyama ile sıvı topikal deri yapıştırıcı kullanarak hayvanları aşağı tutkal ve cam iğneler kullanarak tutkal / solucan arayüzü boyunca yanal bir miğfer kesi yapmak.
- Solucan boşluğundan iç vissera temizlemek için bir ağız pipet kullanın.
- Hayvanın miğfer kapağını aşağı yapıştırarak ventral medial vücut duvar kaslarını görüntüleme için ortaya çıkar.
- Nanoboncuk hazırlığı kullanıyorsanız (Şekil 1B)
- 100 mL son hacmi ne ddH2O kullanarak erimiş% 5 agarose çözeltisi olun.
- Pasteur pipeti kullanarak, bir cam slayt üzerine erimiş agarose çözeltisi bir damla yerleştirin ve hemen üst üzerinde ikinci bir cam slayt yerleştirin, ilk dik, eşit bir agarose ped oluşturmak için nazik basınç kullanarak. Kullanmadan önce üst teki slaydı kaldırın.
- Agarose pedin ortasına yaklaşık 4 μL polistiren nanoboncuk(Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Düşük ışıkta, nanoboncuk çözeltisi içine 4-6 C elegans seçin, hayvanların üst üste yatmayın emin olun, ve dikkatlice üstüne bir coverslip yerleştirin.
- Hazırlanan slayt veya diseksiyon kabını mikroskoba yerleştirin ve 10x büyütme ve loş parlak alan aydınlatması kullanarak bir solucanı bulup odaklanın.
- Vulva'nın ön ve doğru odak düzleminde olan ventromedial vücut duvar kasını tanımlamak için 60x büyütme ve RCaMP floresan uyarma ile geçiş edin.
NOT: Vulvanın ön ön kasları elektrofizyoloji deneylerinde yaygın olarak uyarılan kasları yansıttığı için seçilir. - Geçişi çekerek ve veri toplama yazılımı(Tablo Malzemeler)içinde Live'ı tıklatarak görüntü yolunu göz parçasından kameraya değiştirin.
NOT: Bu noktada, kanaloidopunun görüntüleri yakalamadan önce etkinleştirilmediğinden emin olmak için mavi ışık stimülasyon yolunun kapalı olduğundan emin olun. - Mikroskop ince odak kullanarak veri toplama yazılımı içinde görüntü odaklanın.
- Kas net bir şekilde odaklandıktan sonra Live düğmesine tıklamayı bırakarak canlı görüntüyü kapatın.
- Veri toplama yazılımındaki YG düğmesini tıklatın ve odaklanılan kasın etrafında bir kutu oluşturun.
- Uyarıcıda, daha önce adım 1.10'da programlanmış olan mavi ışık stimülasyon yolunu açın.
- Görüntüyü CMOS kameradan yakalamak için görüntüleme yazılımında Edinme'yi tıklatın. Bunu yapmak için, 1.000 kare ve 2x binning ile 10 s pozlama süresini ayarlayın.
3. Veri analizi
- Görüntüleme yazılımındaki(Malzeme Tablosu)veri dosyasını açın ve Çokgen Aracı'nıkullanarak ilgi kaslarını ana hatlarını belirtin. Bu yatırım getirisi.
- Görüntüye Git | Yığınlar | Z ekseni profilini çizin ve elde edilen veri noktalarını elektronik tablo yazılımına(Malzeme Tablosu)aktarın. Bu işlev, YG seçimini zaman noktasına göre ortalama değeri çizer.
- 3.2'de belirtilen adımları kullanarak bir arka plan floresan ölçümü almak için hayvanın dışında Polygon aracı ile oluşturulan kas RoI taşıyın. Elde edilen verileri elektronik tablo çalışma kitabına aktarın.
- Elektronik tablo çalışma kitabında, her zaman noktasında arka plan floresan değerlerini kas floresan değerlerinden çıkarın. Bu arka plan çıkarılan floresan sinyal sağlar.
- Veri noktalarının ilk 2'si için arka plan çıkarılan floresan ortalaması. Bu temel floresan ölçümü, F verecektir.
- Her zaman noktasında normalleştirilmiş floresan düzeyini hesaplamak için temel floresan ölçümlerini kullanın. Bunu yapmak için (ΔF/F)+1 denklemini kullanın. ΔF, F(t)'nin herhangi bir zaman noktasında floresan ölçümü, F'nin ise temel değer olduğu (F(t)-F'yi temsil eder. +1 y ekseni ofset olarak eklenir.
- Toplanan her kas görüntüsü için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın. Görüntü başına tek veya birden fazla kas hücresi kullanmak araştırmacının takdirine bağlıdır. Deneyin n'si bir güç analizi yaparak belirlenebilir.
- 3.2-3.6 adımlarından alınan işlenmiş verileri kullanarak grafik yazılımındaki floresan değerlerin üreticinin talimatlarına(Tablo Of Materials)göre iz lenebilir.
- Bu izden, üreticinin talimatlarına göre grafik yazılımında sağlanan araçları kullanarak, en yüksek zamana ve yarı bozunma süresine yükselmek gibi kalsiyum geçicisinin kinetiklerini ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknik, kalsiyum işleme veya kas depolarizasyonunu etkilediği düşünülen mutantlardaki değişiklikleri değerlendirmiştir. Bazal floresan düzeyleri ve floresan geçiciler görselleştirildi ve kas içinde sitosolik kalsiyum ve kalsiyum kinetik dinlendirildi. Hayvanların retinanın başarılı bir şekilde birleşmesini sağlamak için en az üç gün boyunca all-trans retinal olarak yetiştirilmesi ve daha sonra kanaloidin aktive edilmesi önemlidir(Şekil 2A). Hayvanlar all-trans retinal maruz değilse, hiçbir kas kalsiyum geçici tetiklenir(Şekil 2B). Bu hayvanlar hala temel sitosolik kalsiyum düzeylerini değerlendirmek için kullanılabilir rağmen, kalsiyum herhangi bir dinamik değişiklikler yakalanmaz. Ayrıca, hayvan veya diseksiyon sağlığı için bir iç kontrol olarak, hayvan mavi ışık stimülasyonu aşağıdaki sözleşme olacaktır. İmmobilizasyon için nanoboncuklar kullanılırken solucanın vücudunun en az brüt hareketine neden olan kas kasılması ile bir kayıt veri toplama için seçildi. Ham floresan değerlerini toplamak için kullanılan kas şiddetle kasılırsa, solucanın tüm vücudunun hareket etmesini sağlarsa, geçici iz bu hareket objesini(Şekil 2C)yansıtır ve nicelleştirmeden atılmalıdır.
Sca-1 gen lokusuna yapılan mutasyon haritası, C. elegans kas nikotinik reseptör lokalizasyonunu etkileyen mutasyonlar için bir ekrandan izole edildi. C. elegans sca-1 geni solucanda sarco(endo)plasmik retiküler kalsiyum ATPaz (SERCA) tek homolog kodlar ve vücut duvarı kaslarında mevcut olan tek SERCApompasıdır 12,13. Fonksiyon kaybı sca-1 mutantlar memeli kaslarında kalsiyum homeostaz korunmasında SERCA oynadığı önemli role dayalı kas kalsiyum işleme değişiklikler sergilemek için tahmin edildi14,15,16 ,17,18. GECI RCaMP vücut duvarı kaslarında ifade edildi ve sca-1 mutantlarında hem hücre içi bazal kalsiyum hem de kalsiyum dinamiği değerlendirmek için uyarıcı kolinerjik nöronlarda mavi ışık la aktive edilen channelrhodopsin ifade edildi. Diseksiyonlu hazırlama tekniği ile, sca-1 mutantında sca-1 mutantında temel düzeylerde artışlar gözlendi (Şekil 3A,B),SERCA fonksiyonunun kaybının istirahat sitoplazmik kalsiyum yüksek düzeyde. Kalsiyum dinamiği incelendiğinde, 5, 2 ms mavi ışık darbeleri(Şekil 3C)ile tetiklenen presinaptik stimülasyon dan sonra, sca-1(tm5339) mutantlarında en yüksek kalsiyum düzeylerinde önemli bir azalma meydana geldi. kontrol(Şekil 3D)ile karşılaştırıldığında, SR'deki azalmış kalsiyum depolarını yansıtabilir. Ancak en yüksek zamana veya yarı bozunma süresine yükselişte herhangi bir değişiklik görülmedi (Şekil 3E,F). Bu durum, sitosolik kalsiyumda asetilkolin reseptörleri ve/veya voltaj kapılı kalsiyum kanalları yoluyla kalsiyum girişi gibi dış kaynaklı ve iç depolardan gelen uyarılmış değişikliklerin sca-1(tm5339) mutantlarda etkilenmediğini göstermektedir. . Benzer sonuçlar Şekil 419'dagösterildiği gibi nanoboncuk hazırlığı kullanılarak da görülebilir. Verilerin bu recapitulation bu tekniklerin her ikisi de vücut duvarı kas sitoplazmik kalsiyum düzeylerini ölçme yanı sıra uyarılmış kalsiyum geçici gözlemlemek için fizyolojik olduğunu kanıt sağlar. Bu aynı zamanda solucanın diseksiyonu kalsiyum işleme veya postsinaptik kasları depolarize yeteneğini değiştiren hayvan adazarar vermez gösterir.
Bu protokol aynı zamanda Dolaylı c. eleganskalsiyum işleme etkisi mutantlar incelemek için kullanılabilir. Slo-1(örneğin142) mutantların fonksiyon kaybı bunu göstermek için değerlendirildi. Slo-1 geni hem nöronlarda hem de kaslarda ifade edilen kalsiyum aktive edilmiş BK potasyum kanalını kodlar20,21. Çalışmalar daha önce vücut duvarı kaslarında SLO-1 için bir rol tarif var, fonksiyon mutantların kaybı kas eylem potansiyelleri aşağıdaki postsinaptik repolarizasyon bir kusur olduğunu gösteren20,21. Nanoboncuk immobilizasyonu ile temel kalsiyum düzeyleri ve bu hipereksiteabilityn kaynaklanan kalsiyum geçici dinamitlerindeki olası değişiklikler incelenmiştir. RCaMP'ın temel düzeyleri ölçüldüğünde, slo-1(örneğin142) mutantlar kontrollere göre floresan artışı gösterdiler (Şekil 5A,B)19. Bu, BK kanallarının sitosolik kalsiyumun temel düzeylerini de düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Uyarılmış kalsiyum geçicisinin kinetikleri değerlendirilirken, en yüksek kalsiyum düzeylerinde kontrol(Şekil 5C,D)ile karşılaştırıldığında herhangi bir değişiklik görülmedi. Slo-1 (örneğin142) mutantlar, ancak, kontrol(Şekil 5E)ile karşılaştırıldığında pik zaman önemli ölçüde artış sergiledi . Bu presinaptik uyarılabilirlik daha önce bildirilen bir artış yansıtabilir20,21. Ancak, slo-1 (örneğin142) mutantlarda yarı bozunma süresinde kontrole göre anlamlı bir değişiklik yoktu (Şekil 5F). Birlikte, bu veriler bu yöntemin hem istirahat hem de uyarılmış vücut duvarı kas kalsiyumu üzerinde pre-ve postsinaptik mutasyonların etkilerini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
| Seri Ayarı | Değer |
| Zaman aralarını yanıtla | 500 |
| Baud oranı | 57600 |
| GecikmeBetweenCharsMs | 0 |
| El sıkışma | Kapalı |
| Eş -lik | Hiçbiri |
| Stopbits | 1 |
| Ayrıntılı | 0 |
Tablo 1: Harici bir mikrodenetleyici panosunu kontrol eden mikrodenetleyici eklentisi için seri bağlantı noktası ayarları. Bu floresan uyarma kontrol etmek için dış zamanlama darbeleri programlamak için kullanılır.
Şekil 1: Farklı immobilizasyon tekniklerinin grafiksel gösterimi. (A) Bu grafik immobilizasyon için diseksiyon tekniğini göstermektedir. Solucanın gövdesi hayvanın sırt tarafının etrafına (mavi) yapıştırılır. Mitelik boyunca bir dorsal kesi bir mitikül flep oluşturur. Bu flep, ventral sinir kordonunun yeşil (channelrhodopsin) ve RCaMP'nin kırmızı daki kaslarını ifade eden sinapsları arasında oluşan bozulmamış NMJ'leri ortaya çıkarmak için yapıştırılmıştır. (B) Bu grafik nanoboncuk immobilizasyon tekniğini göstermektedir. Bozulmamış solucan çözeltinanoboncuklar bir temsili ile çevrilidir, bu örten coverslip tarafından sıkıştırılmış zaman, solucan hareketsiz. C. elegansşeffaflığı nedeniyle, ventral sinir kordonu yeşil görselleştirilmiş olabilir (channelrhodopsin) ve RCaMP ifade kasları kırmızı görselleştirilmiş olabilir. Solucanın ortasındaki oval vulvayı temsil eder, bu da ventral vücut duvar kaslarını tanımlayan bir dönüm noktasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kalsiyum geçicilerinin temsili izleri. (A) 5 0 ms mavi ışık darbelerinin 50 ms interpulse aralıklarında uyardığı kalsiyum geçicisinin tek iz gösterimi, tümtrans retinal (+ tüm- trans retinal). Başak eserler mavi ışık stimülasyon darbeleri vardır, her iki LED eş-aynı anda aydınlatılmış olarak. (B) Tümtrans retinal (- tüm-trans retinal) maruz kalmamış bir hayvanda 50 ms interpulse aralıkları ile 50 ms mavi ışık darbeleri ile bir tren eki beyanı bir kalsiyum geçici yokluğunu gösteren tek iz gösterimi , - hareket). (C) 5 0 ms mavi ışık darbeleri 50 ms inpulse aralıkları ile bir tren tarafından uyarılmış olan bir kalsiyum geçici tek iz gösterimi, hareket yapıları yol açan önemli kas kasılması olan bir hayvan kaydedildi (+ hareket, + tüm-trans retinal). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temel kalsiyum düzeyleri ve diseksiyon tekniği kullanılarak hazırlanan kontrol ve sca-1(tm5339) örneklerinden uyarılmış kalsiyum geçicileri. (A) Sca-1(tm5339) mutantlar ve kontrollerde temel RCaMP floresan temsili görüntüler. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=13) ve kontrolde (n=9) bazal floresan düzeyleri nicellik. (C) Sca-1(tm5339) mutantları ve kontrol hayvanları için uyarılmış kalsiyum geçici topluluk ortalama izleri. (D) Kanaloiddopsin'den en yüksek RCaMP floresanının sca-1(tm5339) mutantlarında (n=12) ve kontrollerde (n=9) kalsiyum yanıtlarını uyardığının ölçülmesidir. (E) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=12) ve kontrollerde (n=8) kanalrodopsun en yüksek zamana yükselmesinin sayısallaştırılması. (F) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=12) ve kontrollerde (n=7) channelrhodopsin uyarılmış kalsiyum geçicilerinin yarı bozunma süresi nicelemesi. İstatistiksel olarak anlamlı değerler: anlamlı değil p>0.05, * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil eder. Veriler Shapiro-Wilk testleri kullanılarak normalleştirildi ve normal olmayan dağılımlar için Mann-Whitney testi ile önemi belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nanoboncuk immobilizasyonu kullanılarak hazırlanan temel kalsiyum düzeyleri ve kontrol ve sca-1 (tm5339) örneklerinden uyarılmış kalsiyum geçicidir. (A) Sca-1(tm5339) mutantlar ve kontrollerdeki temel floresanların temsili görüntüleri, ölçek çubuğu 50 μm. (B) Sca-1(tm5339) mutantlarda temel RCaMP floresan düzeylerinin sayısallaştırılması (n=14) ve kontrol (n=13) . (C) Sca-1(tm5339) mutantlar ve kontroller için uyarılmış kalsiyum geçici ortalama. (D) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=14) ve kontrollerde (n=13) uyarılmış kalsiyum yanıtı sonrasında pik RCaMP floresanının ölçülmesi. (E) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=14) ve kontrollerde (n=12) uyarılmış kalsiyum geçicilerinin en yüksek zamana yükselmesinin sayısallaştırılması. (F) Sca-1(tm5339) mutantlarında (n=14) ve kontrolde (n=13) uyarılmış kalsiyum geçicilerinin yarı bozunma zamanının ölçülmesi. Şekil19uyarlanmıştır. İstatistiksel olarak anlamlı değerler: p > 0.05, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 anlamlı değildir. Hata çubukları ± SEM. Veri normalitesi Shapiro-Wilk testleri kullanılarak değerlendirildi ve normal olmayan dağılımlar için Mann-Whitney testi ile anlamlılık belirlendi. Bu rakam19izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nanoboncukimmobilizasyonu kullanılarak hazırlanan temel kalsiyum düzeyleri ve kontrol ve slo-1(örneğin142) örneklerinden uyarılmış kalsiyum geçicidir. (A) Slo-1(örneğin142) mutantlar ve kontrollerde temel floresan temsili görüntüler, ölçek çubuğu 50 μm. (B) Slo-1(örneğin142) mutantlarda temel RCaMP floresan düzeylerinin sayısallaştırılması (n=29) ve kontrol (n=13). (C) Slo-1(örneğin142) mutantlar ve kontroller için uyarılmış kalsiyum geçici ortalama. (D) Slo-1(örneğin142) mutantlarında (n=29) ve kontrollerde (n=13) uyarılmış kalsiyum yanıtı sonrasında pik RCaMP floresanının ölçülmesi. (E) Slo-1(örneğin142) mutantlarında (n=29) ve kontrollerde (n=13) uyarılmış kalsiyum geçicilerinin en yüksek zamana yükselmesinin ölçülmesi. (F) Slo-1(örneğin142) mutantlarında (n=11) ve kontrollerde (n=13) uyarılmış kalsiyum geçicilerinin yarı bozunma süresinin ölçülmesi. Şekil19uyarlanmıştır. İstatistiksel olarak anlamlı değerler: p > 0.05, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 anlamlı değildir. Hata çubukları ± SEM. Veri normalitesi Shapiro-Wilk testleri kullanılarak değerlendirildi ve normal olmayan dağılımlar için Mann-Whitney testi ile anlamlılık belirlendi. Bu rakam19izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs C. elegans nörobiyoloji güçlü bir araçtır. Önceki çalışmalarda, duyusal ve davranışsal tepkiler de dahil olmak üzere, hem nöronlarda hem de kas hücrelerinde çeşitli fonksiyonlar ve çeşitli stimülasyon yöntemleri ile incelemek için kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılmıştır. Bazı çalışmalar da duyusal ASH nöronlarda kalsiyum geçici tetiklemek için kimyasal uyaranlar kullandık22,23 veya faringeal kaslarda kalsiyum dalgaları neden24. Solucanlar dokunma reseptör nöronların kalsiyum yanıtlarını incelemek için mikroakışkan yongaları yapıldı ise başka bir grup mekanik stimülasyon kullanılmıştır25. Yine de, diğerleri hem nöronlarda kalsiyum değişiklikleri görselleştirmek için elektrikstimülasyon istihdam var26 ve vücut duvarı kasları27. Bu çalışmalar arasında yaygın olan şey, kalsiyum geçicilerini tetiklemek için çözeltiler veya ekipmanlar gibi dış uyaranların gerekliliğidir. Burada özetlenen protokol, nöronal özgüllük sağlayan optogenetik stimülasyondan elde edilen kontrolden ve aynı deneysel paradigmada ifade edilen kasların fonksiyonel analizinden yararlanmaktadır.
Solucan immobilizasyonunun iki biçimi tanımlanır ve deneysel ihtiyaçlar ele alınırken her yöntem değerlendirilmelidir, hem diseksiyonlu hem de fizyolojik olarak bozulmamış preparatlar, araştırmacıların her iki yaklaşımı da kullanmasına olanak tanıyan tamamlayıcı sonuçlar üretir. araştırmalarında. Diseksiyon tekniğini kullanmak için artan bir teknik zorluk vardır, kullanıcı sinir kordonu veya kaszarar vermeden cerrahi tutkal ve mikrodiseshem hassas kullanımı ana olmak için gerekli olan. Ayrıca, diseksiyonun zorluk seviyesi nedeniyle, deneysel zaman noktalarını sınırlandırabilecek sadece gravid yetişkinler kullanılmalıdır. Ayrıca, diseksiyon tekniği de küçük, ince veya hasta hayvanlar üreten mutantlar üzerinde gerçekleştirmek için çok daha zordur, yine muhtemelen deneysel parametreleri sınırlayan. Bu tekniğin avantajı, depolarizasyon sonucu oluşan vücut hareketi artifakı sınırlar, yapıştırma solucanın vücudunun aşırı hareketini önler, ve aynı zamanda çözüm değişiklikleri ve ilaç uygulamaları için NMJ erişim sağlar. Ayrıca, her hazırlık solucan aynı alanda ortaya çıkarır, hangi vücut duvarı kasları sürekli odak olacak garanti eder. Solucanları hareketsiz hale getirmek için nanoboncuklar kullanan ikinci teknik daha az ilgilidir ve hızlı bir şekilde öğrenilebilir. Ayrıca, herhangi bir yaş hayvanlar bu yöntem ile kullanılabilir, gelişim yoluyla kalsiyum işleme değişiklikleri için izin izlenmesiiçin. Solucanları nanoboncuk çözeltisine yerleştirirken dikkatli olunması gerekir, çünkü hayvanların çok fazla manipülasyonu onların patlamasına neden olabilir. Ayrıca, örtü başı hayvanların üzerine bir kez yerleştirildikten sonra hareket ettirilmemelidir, çünkü bu hayvanlar kendi başlarına yuvarlanmalarına veya bükülmelerine neden olabilir ve yine hasara yol açabilir. Nanoboncuklar kullanarak hayvanların potansiyel olarak kurtarılabilir hangi bir yüksek iş çıkışlı test sağlayabilir rağmen, hayvanın vücut pozisyonu hiçbir standardizasyon yoktur, bu nedenle her hayvan net bir odak düzleminde vücut duvarı kasları olmayabilir. Deney çok sayıda hayvan gerektiriyorsa, dökme kalsiyum floresan görüntüleme28için izin agar tabanlı mikro kuyular gibi immobilizasyon farklı yöntemler gerekli olabilir. Ne olursa olsun bu iki teknik sınırlamaları, ya C. elegans vücut duvar kasları içinde güvenilir, kolayca ölçülebilir kalsiyum geçici elde etmek için kullanılabilir.
C. elegans fonksiyonel görüntüleme çalışmaları için bir in vivo sistemi olarak birçok avantaj sağlar. Hayvanlar şeffaftır, geci RCamp ile kanalrodoppsin kullanımı yoluyla optogenetik nöronal depolarizasyon eşleştirme izin kas ortaya çıkan postsiaptik kalsiyum geçici ölçmek için. RCaMP floresan pre-stimülasyon düzeyleri de bazal sitosolik kalsiyum düzeylerini değerlendirmek için kullanılabilir. C. elegans genetik sistemlilik kalsiyum homeostaz etkileyebilir yeni mutasyonlar çalışma yapar veya takip etmek kolay işleme, genellikle hazır mutant aleller ile. Bu protokolde belirtilen teknikler kullanılarak, postsinaptik kalsiyum görüntüleme verileri verimli ve nispeten düşük maliyetle elde edilebilir, bu da bu çok çeşitli görüntüleme deneyleri için cazip bir sistem haline getirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar ZX1659 için Dr Alexander Gottschalk teşekkür, RCaMP ve kanalrhodopsin solucan suşu içeren, Dr Hongkyun Kim slo-1 (örneğin142) solucan suşu için, ve Sca-1 (tm5339) solucan suşu için Ulusal Biyokaynak Projesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
