Summary
Cette méthode fournit un moyen de coupler l'optogénétique et les capteurs de calcium génétiquement codés pour imager les niveaux cytosoliques de base de calcium et les changements dans les transitoires évoquées de calcium dans les muscles de la paroi du corps de l'organisme modèle C. elegans.
Abstract
L'organisme modèle C. elegans fournit un excellent système pour effectuer l'imagerie in vivo du calcium. Son corps transparent et sa manipulabilité génétique permettent l'expression ciblée de capteurs de calcium génétiquement codés. Ce protocole décrit l'utilisation de ces capteurs pour l'imagerie in vivo de la dynamique calcique dans les cellules ciblées, en particulier les muscles de la paroi du corps des vers. En utilisant la co-expression de la nérhodopsine presynaptique, la stimulation de la libération d'acétylcholine des neurones moteurs excitatifs peut être induite à l'aide d'impulsions de lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation musculaire et des changements reproductibles dans le calcium cytoplasmique Niveaux. Deux techniques d'immobilisation de ver sont discutées avec des niveaux variables de difficulté. La comparaison de ces techniques démontre que les deux approches préservent la physiologie de la jonction neuromusculaire et permettent la quantification reproductible des transitoires de calcium. En jumelant l'optogénétique et l'imagerie fonctionnelle du calcium, les changements dans la manipulation du calcium postsynaptique et l'homéostasie peuvent être évalués dans une variété de milieux mutants. Les données présentées valident les deux techniques d'immobilisation et examinent spécifiquement les rôles du Sarco sarco (endo)plasmique de calcium ATPase de C. elegans et du canal de potassium DE BK calcium-activé dans la régulation de calcium de muscle de corps.
Introduction
Cet article présente des méthodes pour l'imagerie in vivo de calcium des muscles de la paroi du corps de C. elegans utilisant la stimulation neuronale optogénétique. Associer un muscle exprimé génétiquement encodé indicateur de calcium (GECI) avec la lumière bleue déclenché dépolarisation neuronale et fournit un système pour observer clairement les transitoires de calcium postsynaptic évoqués. Cela évite l'utilisation de la stimulation électrique, permettant une analyse non invasive des mutants affectant la dynamique du calcium postsynaptique.
Les GECI à fluorophore unique, comme le GCaMP, utilisent une seule molécule de protéine fluorescente fusionnée au domaine M13 de la kinase de la chaîne lumineuse de myosine à son extrémité N-terminale et de la calmoduline (CaM) au terminus C. Lors de la liaison calcique, le domaine CaM, qui a une forte affinité pour le calcium, subit un changement conformationnel induisant un changement conformationnel ultérieur dans la protéine fluorescente conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence1. La fluorescence GCaMP est excitée à 488 nm, ce qui le rend impropre à être utilisé en conjonction avec la canalrhodopsine, qui a une longueur d'onde d'excitation similaire de 473 nm. Ainsi, afin de coupler les mesures de calcium avec la stimulation de canalrhodopsine, la protéine fluorescente verte de GCaMP doit être remplacée par une protéine fluorescente rouge, mRuby (RCaMP). L'utilisation du muscle exprimé RCaMP, en combinaison avec l'expression cholinergique de neurone moteur de la canalrhodopsine, permet des études à la jonction neuromusculaire de ver (NMJ) avec l'utilisation simultanée de l'optogénétique et de l'imagerie fonctionnelle dans le même animal 2.
L'utilisation de la canalrhodopsine contourne la nécessité de la stimulation électrique pour dépolariser les jonctions neuromusculaires de C. elegans, qui ne peuvent être réalisées que dans les préparations disséquées, rendant ainsi cette technique à la fois plus facile à utiliser et plus précise en ciblant des tissus spécifiques. Par exemple, channelrhodopsin a été précédemment utilisé dans C. elegans pour activer de façon réversible des neurones spécifiques, conduisant à l'activation robuste des neurones excitateurs ou inhibiteurs3,4. L'utilisation de la dépolarisation stimulée par la lumière contourne également la question des dommages neuronaux dus à la stimulation électrique directe. Ceci fournit l'occasion d'examiner les effets de beaucoup de différents protocoles de stimulation, y compris les stimulations soutenues et répétées, sur la dynamique de calcium postsynaptic4.
La nature transparente de C. elegans le rend idéal pour l'analyse fonctionnelle de l'imagerie fluorescente. Cependant, en stimulant les neurones excitatifs d'acétylcholine au NMJ, les animaux sont censés répondre avec une contraction musculaire immédiate4,rendant l'immobilisation des vers critique en visualisant les changements discrets de calcium. Traditionnellement, les agents pharmacologiques ont été utilisés pour paralyser les animaux. Un tel médicament utilisé est le lévamisole, un agoniste récepteur de l'acétolcholine cholinergique5,6,7. Puisque le lévamisole conduit à l'activation persistante d'un sous-type de récepteurs musculaires excitatifs, ce réactif est impropre à l'étude de la dynamique du calcium musculaire. L'action du lévamisole induit la dépolarisation postsynaptique, élevant le calcium cytosolique, et occluding observations suivant la stimulation presynaptic. Pour éviter l'utilisation de médicaments paralysants, nous avons examiné deux méthodes alternatives pour immobiliser C. elegans. Les animaux ont été collés vers le bas et puis disséqués ouverts pour exposer les muscles de la paroi du corps, semblable à la méthode d'électrophysiologie C. elegans NMJ8, ou nanobeads ont été utilisés pour immobiliser les animaux intacts9. Les deux procédures ont permis les mesures reproductibles du repos et ont évoqué des transitoires de calcium de muscle qui étaient facilement quantifiables.
Les méthodes dans cet article peuvent être employées pour mesurer les niveaux cytosoliques de base de calcium et les transitoires dans les cellules de muscle de corps postsynaptic dans C. elegans. Des exemples de données utilisant les deux techniques d'immobilisation différentes sont donnés. Les deux techniques tirent parti de l'optogénétique pour dépolariser les cellules musculaires sans l'utilisation de stimulation électrique. Ces exemples démontrent la faisabilité de cette méthode dans l'évaluation des mutations qui affectent la manipulation du calcium postsynaptique dans les vers et soulignent les avantages et les inconvénients des deux approches d'immobilisation.
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Protocol
1. Configuration du microscope
- Utilisez un microscope composé avec des capacités de fluorescence. Pour cette étude, les données ont été recueillies sur un microscope droit(Tableau des matériaux) équipé de LED pour l'excitation.
- Afin de visualiser correctement les changements de fluorescence dans les muscles de la paroi du corps, utilisez un objectif de grossissement élevé.
- Pour les préparations disséquées, utilisez un objectif d'immersion de l'eau 60x NA 1.0 (Tableau des matériaux).
- Pour les préparations utilisant des nanobelées, utilisez un objectif d'immersion d'huile 60x NA 1.4 (Tableau des matériaux). Ce grossissement assure une résolution suffisante des muscles sur le capteur de la caméra.
- Utilisez une caméra à haute sensibilité fixée au microscope pour capturer des images à un taux d'images élevé afin de suivre les changements rapides des niveaux de calcium. Pour cette étude, l'image avec un système sCMOS (Table of Materials) capable d'imagerie à monture complète à 100 Hz, car les temps d'élévation pour les signaux Ca 2peuvent être aussi rapides que des dizaines de millisecondes.
- Contrôlez l'acquisition de la caméra et l'excitation de la fluorescence LED avec un logiciel de micro-gestionnaire fonctionnant dans ImageJ10 selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
- Utilisez un plugin de plate-forme électronique open-source, qui relie un microcontrôleur externe open-source(Tableau des matériaux),pour gérer les impulsions de synchronisation externe pour contrôler l'excitation de fluorescence.
REMARQUE : Les sorties numériques sont disponibles à partir des broches numériques 8 à 13 fournissant des bits de sortie 0 à 5. Ceux-ci peuvent être abordés comme valeurs de base 2 de 1, 10, 100, etc. Les paramètres des ports en série sont indiqués dans le tableau 1 et sont disponibles sur le site Web des microgestionnaires(tableau des matériaux). Firmware pour le conseil de microcontrôleur est également disponible sur ce site. - Pour contrôler la logique de synchronisation, activez le protocole d'acquisition de microgestionnaire dans le logiciel selon les instructions du fabricant (Tableau des Matériaux).
REMARQUE: Cela initie simultanément une durée de trame de caméra préréglé et le nombre de cadres à activer, ainsi que l'obturateur logique et préréglé AMBRE LED pour l'excitation de fluorescence. Dans ce cas, le commutateur à l'état solide LED ambre est contrôlé par microcontrôleur bit 1 sortie par la broche 9. La caméra encadre TTL (plaque arrière sur 3 connecteur) déclenche un stimulateur. Ceci fois précisément l'activation de la LED de lumière bleue pour l'activation de channelrhodopsin e à un moment fixé suivant l'activation de la séquence d'imagerie. - Pour stimuler la canalrhodopsine avec la lumière bleue et enregistrer les changements DeL, utilisez deux LED. Activer la canalrhodopsine avec une LED avec une longueur d'onde d'émission maximale de 470 nm et un filtre de bandpass (455 à 490 nm) et exciter RCaMP avec une LED avec une longueur d'onde d'émission maximale de 594 nm et un filtre de bandpass (570 à 600 nm).
- Afin d'activer simultanément la canalrhodopsine et de capturer les changements dans les niveaux fluorescents RCaMP, co-illuminer les deux LED et transmettre la lumière à la même trajectoire optique à l'aide d'un faisceau dichroique.
- Contrôlez le moment de l'éclairage LED avec des interrupteurs à l'état solide(tableau des matériaux)contrôlés par des signaux TTL (temps d'allumage maximum nominal, 1 ms, temps d'arrêt de 0,3 ms : 0 à 90 % d'allumage et d'arrêt de temps de 100 euros).
- Régler l'intensité LED avec les alimentations linéaires à faible bruit contrôlées par courant (Tableau des matériaux).
- Pour assurer le moment précis de la LED de lumière bleue, activez-la directement par l'impulsion de TTL au relais à l'état solide d'un stimulateur. Programmez le protocole de stimulation de la lumière bleue dans un stimulateur (Table of Materials), qui agit comme un minuteur précis depuis le début de l'acquisition d'image à l'éclairage LED bleu. Dans cette expérience, activez la stimulation de la lumière bleue après 2 s de la capture de la fluorescence RCaMP seulement et utilisez un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue avec des intervalles interpulsede de 50 ms pour activer la canalrhodopsine.
REMARQUE : Le délai avant les impulsions de lumière bleue, la durée des impulsions de lumière bleue, le temps entre les impulsions et le nombre d'impulsions dans le train peuvent tous être réglés à ce stade et devraient refléter les paramètres spécifiques d'intérêt expérimental.
2. C. elegans préparation d'échantillons et acquisition de données
- Pour stimuler optiquement les neurones presynaptiques, obtenir des animaux exprimant la nérhodopsine dans les neurones cholinergiques excitateurs, conduits avec la région de promoteur unc-17, et RCaMP exprimé dans tous les muscles de la paroi du corps conduit avec le promoteur myo-3 région2.
REMARQUE : Seule l'utilisation d'animaux avec des transgènes intégrés et des niveaux robustes de fluorescence sont recommandées car l'expression variable dans les types de cellules correspondants peut affecter la fiabilité de l'acquisition de données. - Faire un stock de travail de rétinetout-trans en diluant la poudre rétinienne (Tableau des matériaux) dans l'éthanol pour créer une concentration finale de 100 mM et stocker à -20 oC. Ce stock de travail sera stable pendant environ un an.
- Créer un stock d'OP50 E. coli, cultivé dans les médias LB, complété par la rétinetout-trans à partir du stock de travail fait à l'étape 2.2, à une concentration finale de 80 M. Le volume utilisé pour le stock OP50-retinal dépendra du nombre de plaques nécessaires à l'expérience.
- Plaques de support de croissance de nématodes de graine (NGM) avec approximativement 300 l du stock de rétine d'OP50 et permettent aux plaques de sécher pendant la nuit à la température ambiante dans l'obscurité.
- Grow C. elegans tend jusqu'à l'âge désiré dans l'obscurité sur les plaques NGM OP50-retinal à 20 oC. Pour cette expérience, utilisez des vers adultes.
- Pour l'expérience utilisant la préparation disséquée, il est extrêmement difficile d'utiliser uniquement des vers adultes gravid comme dissection sur des animaux plus jeunes et plus petits. Laissez les animaux sur les plaques OP50-retinal pendant un minimum de 3 jours pour une activation efficace de channelrhodopsine.
- Si vous utilisez la préparation disséquée8,11 (Figure 1A), effectuer des dissections en basse lumière.
- Placer les animaux dans un plat disséqué avec une base de couverture recouverte de silicone qui est rempli d'une solution extracellulaire de 1 mM Ca2 composé de 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM de glucose, 5 mM de saccharose, et 15 mM HEPES (pH 7,3 , -340 Osm).
- Collez les animaux à l'aide de l'adhésif liquide topique de la peau avec une coloration bleue le long du côté dorsal du ver et faites une incision latérale de cuticule le long de l'interface colle/ver utilisant des aiguilles en verre.
- Utilisez une pipette buccale pour dégager les viscères internes de la cavité du ver.
- Collez le rabat cuticule de l'animal pour exposer les muscles ventrales médiéques de la paroi du corps pour l'imagerie.
- Si vous utilisez la préparation des nanobilles (Figure 1B)
- Faire une solution d'agarose en fusion de 5 % à l'aide de ddH2O jusqu'à un volume final de 100 ml.
- À l'aide d'une pipette Pasteur, placez une goutte de solution d'agarose fondue sur un toboggan en verre et placez immédiatement une deuxième glissière en verre sur le dessus, perpendiculaire à la première, en utilisant une légère pression pour créer un tampon même agarose. Retirez la diapositive supérieure avant utilisation.
- Ajouter environ 4 l de nanobeles de polystyrène(Tableau des matériaux)au milieu du tampon d'agarose.
- Dans la faible lumière, choisissez 4-6 C. elegans dans la solution de nanoperles, en s'assurant que les animaux ne gisent pas les uns sur les autres, et placez soigneusement une feuille de couverture sur le dessus.
- Placez la lame ou le plat de dissection préparé sur le microscope, et trouvez et concentrez-vous sur un ver en utilisant le grossissement 10x et l'éclairage lumineux de champ.
- Passez à l'agrandissement 60x et à l'excitation de fluorescence de RCaMP pour identifier un muscle ventromedial de paroi de corps qui est antérieur à la vulve et dans le plan focal correct.
REMARQUE : Les muscles antérieurs à la vulve sont sélectionnés car ils reflètent les muscles généralement stimulés dans les expériences d'électrophysiologie. - Changer la voie d'image de l'oculaire à la caméra en tirant le basculement et en cliquant en direct dans le logiciel d'acquisition de données ( Tableaudes matériaux).
REMARQUE : Assurez-vous que la voie de stimulation de la lumière bleue est désactivée à ce stade pour vous assurer que la canalrhodopsine ne s'active pas avant de capturer des images. - Concentrez l'image dans le logiciel d'acquisition de données à l'aide de la mise au point fine microscope.
- Une fois que le muscle est clairement au point, éteignez l'image en direct en décochant le bouton Live.
- Cliquez sur le bouton ROI dans le logiciel d'acquisition de données et créez une boîte autour du muscle concentré sur.
- Sur le stimulateur, allumez la voie de stimulation de la lumière bleue qui a été programmée à l'étape 1.10.
- Cliquez sur Acquérir dans le logiciel d'imagerie pour capturer l'image à travers la caméra CMOS. Pour ce faire, régler le temps d'exposition à 10 s avec 1000 images et 2x binning.
3. Analyse des données
- Ouvrez le fichier de données dans le logiciel d'imagerie (Table of Materials) et, à l'aide de l'outil Polygone, décrire le muscle d'intérêt. C'est le retour sur investissement.
- Aller à l'image (fr) Piles ( Tracer le profil de l'axe Z et exporter les points de données qui en résultent dans le logiciel de tableur (Tableau des matériaux). Cette fonction trace la valeur moyenne de sélection de retour sur investissement par rapport au point de temps.
- Déplacez le retour sur investissement musculaire créé avec l'outil Polygon à l'extérieur de l'animal pour obtenir une mesure de fluorescence de fond en utilisant les étapes décrites dans 3.2. Exportez les données résultantes dans le cahier de calcul.
- Dans le cahier de calcul, soustrayez les valeurs de fluorescence de fond des valeurs de fluorescence musculaire à chaque moment. Cela fournit l'arrière-plan soustrait le signal fluorescent.
- Moyenne de l'arrière-plan soustrait la fluorescence pour les 2 premiers s de points de données. Cela donnera la mesure de base de fluorescence, F.
- Utilisez la mesure de base de la fluorescence pour calculer le niveau de fluorescence normalisé à chaque moment. Pour ce faire, utilisez l'équation (F/F) 1. Le F représente (F(t)-F), où F(t) est la mesure de fluorescence à un moment donné et F est la valeur de base. Le numéro 1 est ajouté sous forme de décalage de l'axe y.
- Répétez les étapes 3.2-3.6 pour chaque image musculaire qui est recueillie. L'utilisation de cellules musculaires simples ou multiples par image est à la discrétion du chercheur. Le n de l'expérience peut être déterminé en effectuant une analyse de puissance.
- Utilisez les données traitées des étapes 3.2-3.6 pour faire une trace des valeurs fluorescentes dans le logiciel de graphique selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
- À partir de cette trace, mesurez la cinétique du calcium transitoire, comme l'élévation à l'heure de pointe et le temps de désintégration demi, en utilisant les outils fournis dans le logiciel de graphique selon les instructions du fabricant.
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Representative Results
Cette technique a évalué les changements chez les mutants qui auraient une incidence sur la manipulation du calcium ou la dépolarisation musculaire. Les niveaux de fluorescence de ligne de base et les transitoires fluorescents ont été visualisés et les cinétiques cytosoliques de calcium et de calcium de repos dans le muscle ont été évaluées. Il est important que les animaux aient été cultivés sur la rétine tout-trans pendant au moins trois jours pour assurer l'incorporation réussie de la rétine, activant ainsi par la suite la canalrhodopsine (figure 2A). Si les animaux ne sont pas exposés à la rétine entièrement trans, aucun taux de travail de calcium musculaire n'est déclenché (figure 2B). Bien que ces animaux puissent encore être utilisés pour évaluer les niveaux cytosoliques de calcium de base, aucun changement dynamique dans le calcium ne sera pas capturé. En outre, comme un contrôle interne pour la santé animale ou dissection, l'animal se contractera après stimulation de la lumière bleue. Un enregistrement avec une contraction musculaire qui provoque un mouvement brut minimal du corps du ver a été sélectionné pour la collecte de données lors de l'utilisation de nanoperles pour l'immobilisation. Si le muscle utilisé pour recueillir les valeurs de fluorescence brute se contracte vigoureusement, ce qui provoque le déplacement de l'ensemble du corps du ver, la trace transitoire reflétera cet artefact de mouvement (figure 2C) et devrait être écartée de la quantification.
Une cartographie de mutation au locus de gène de sca-1 a été isolée d'un écran pour des mutations ayant un impact sur la localisation de récepteur nicotinique de muscle de C. elegans. Le gène C. elegans sca-1 code le seul homolog du sarco(endo)plasmique réticule calcium ATPase (SERCA) dans le ver et est la seule pompe SERCA présente dans les muscles de la paroi du corps12,13. Perte de fonction sca-1 mutants ont été prédits pour montrer des changements dans la manipulation du calcium musculaire basé sur le rôle important SERCA joue dans le maintien de l'homéostasie du calcium dans les muscles mammifères14,15,16 ,17,18. Le RCaMP de GECI a été exprimé dans les muscles de mur de corps et la canalrhodopsine lumière-activée bleue a été exprimée dans les neurones cholinergiques excitateurs pour évaluer la dynamique intracellulaire de calcium et de calcium de ligne de base dans les mutants de sca-1. Avec la technique de préparation disséquée, des augmentations des niveaux de base de fluorescence de RCaMP ont été observées dans le mutant sca-1 par rapport au contrôle (figure 3A,B), suggérant que la perte de la fonction SERCA mène à niveaux élevés de calcium cytoplasmique de repos. Lorsque la dynamique du calcium a été examinée, à la suite d'une stimulation présynaptique déclenchée par un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue (Figure 3C), il y avait une diminution significative des niveaux de calcium de pointe dans le sca-1(tm5339) mutants comme par rapport au contrôle (Figure 3D), qui peut refléter la réduction des réserves de calcium dans la SR. Cependant aucun changement n'a été observé dans la montée à l'heure de pointe ou la demi-temps de décomposition (Figure 3E,F). Ceci suggère que les changements évoqués dans le calcium cytosolique de la source externe telle que l'entrée de calcium par des récepteurs d'acétylcholine et/ou des canaux de calcium tension-fermés aussi bien que des magasins internes ne sont pas affectés dans sca-1(tm5339) mutants . Des résultats similaires peuvent être observés à l'aide de la préparation des nanoperles, comme le montre la figure 419. Cette récapitulation des données fournit l'évidence que ces deux techniques sont physiologiques pour mesurer le muscle de corps se reposant des niveaux cytoplasmiques de calcium aussi bien que observant les transitoires stimulés de calcium. Cela démontre également que la dissection du ver ne cause pas de dommages à l'animal qui modifie sa manipulation du calcium ou la capacité de dépolariser les muscles postsynaptiques.
Ce protocole peut également être utilisé pour examiner les mutants qui ont indirectement un impact sur la manipulation du calcium chez C. elegans. La perte des mutants de slo-1 de fonction (par exemple142) ont été évaluées pour démontrer ceci. Le gène slo-1 code un canal de potassium BK activé par le calcium, qui s'exprime à la fois dans les neurones et les muscles20,21. Des études ont déjà décrit un rôle pour SLO-1 dans les muscles de la paroi du corps, démontrant que la perte de mutants de fonction ont un défaut dans la repolarisation postsynaptique suite à des potentiels d'action musculaire20,21. Des changements possibles des niveaux de calcium de ligne de base et de la dynamique transitoire de calcium dues à cette hyperexcitabilité ont été examinés utilisant l'immobilisation de nanobead. Lorsque les niveaux de base de RCaMP ont été mesurés, les mutants slo-1(par exemple142) ont montré une augmentation de la fluorescence par rapport aux témoins (Figure 5A,B)19. Ceci suggère que les canaux de BK puissent également régler des niveaux de ligne de base du calcium cytosolique. Aucun changement des niveaux de calcium de pointe n'a été vu par rapport au contrôle (figure 5C,D) en évaluant les cinétiques du transitoire évoqué de calcium. Les mutants slo-1 (par exemple142) présentaient toutefois une augmentation significative de l'augmentation par rapport à l'heure de pointe par rapport au contrôle (figure 5E). Cela peut refléter une augmentation précédemment rapportée de l'excitabilité présynaptique20,21. Il n'y a toutefois pas eu de changement significatif dans le temps de décomposition des mutants slo-1(par exemple142) par rapport au contrôle (figure 5F). Ensemble, ces données démontrent que cette méthode peut être utilisée pour évaluer les effets des mutations pré- et postsynaptiques sur le calcium de muscle de la paroi corporelle au repos et stimulé.
| Réglage en série | valeur |
| Délai d'arrêt de réponse | 500 |
| Bauds | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handshaking | de |
| parité | aucun |
| StopBits (StopBits) | 1 |
| verbeux | 0 |
Tableau 1 : Réglages de port en série pour le plugin de microcontrôleur, qui contrôle une carte externe de microcontrôleur. Ceci est utilisé pour programmer des impulsions externes de synchronisation pour commander l'excitation de fluorescence.
Figure 1 : Représentation graphique de différentes techniques d'immobilisation. (A) Ce graphique démontre la technique de dissection pour l'immobilisation. Le corps du ver est collé vers le bas (bleu) autour du côté dorsal de l'animal. Une incision dorsale le long de la cuticule génère un rabat de cuticule. Ce rabat a été collé vers le bas pour exposer les NMJ intacts formés entre les synapses du cordon nerveux ventral en vert (canalrhodopsine) et RCaMP exprimant des muscles en rouge. (B) Ce graphique démontre la technique d'immobilisation des nanobilles. Le ver intact est entouré d'une représentation des nanobeles en solution, qui lorsqu'il est comprimé par le glissement de couverture sus-sus-sus- sédition, immobiliser le ver. En raison de la transparence de C. elegans, le cordon nerveux ventral peut être visualisé en vert (canalrhodopsine) et RCaMP exprimant les muscles peuvent être visualisés en rouge. L'ovoïde au milieu du ver représente la vulve, qui est un point de repère identifiant les muscles ventrales de la paroi du corps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Traces représentatives de transitoires de calcium. (A) Représentation à une seule trace d'un transitoire de calcium évoqué par un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue à des intervalles interpulsede de 50 ms, enregistré chez un animal avec un mouvement corporel limité (- mouvement) cultivé en présence detout-trans rétine (tout- rétinienne trans). Les artefacts de pointe sont les impulsions de stimulation de lumière bleue, car les deux LED sont co-illuminées simultanément. (B) Représentation à trace unique montrant l'absence d'un transitoire de calcium en réponse à un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue avec des intervalles d'interpulse de 50 ms chez un animal qui n'a pas été exposé à la rétinetout-trans (-rétine trans , - mouvement). (C) Représentation à trace unique d'un transitoire de calcium qui a été évoqué par un train de 5, 2 ms impulsions de lumière bleue avec des intervalles d'interpulse de 50 ms, enregistré chez un animal qui avait une contraction musculaire significative conduisant à des artefacts de mouvement (mouvement, rétinetrans). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Niveaux de calcium de base et transitoires de calcium évoqués à partir d'échantillons de contrôle et de sca-1(tm5339) préparés à l'aide de la technique de dissection. (A) Images représentatives de la fluorescence RCaMP de base chez les mutants et les témoins sca-1(tm5339). Barre d'échelle de 50 m. (B) Quantification des niveaux de fluorescence de base chez les mutants sca-1(tm5339) (n-13) et de contrôle (n-9). (C) Ensemble, des traces moyennes de transitoires de calcium évoqués pour les mutants et les animaux témoins. (D) Quantification de la fluorescence maximale de RCaMP de la canalrhodopsine a évoqué des réponses de calcium dans sca-1(tm5339) mutants (n -12) et contrôles (n -9). (E) Quantification de l'élévation à l'heure de pointe de la canalrhodopsine a évoqué des transitoires de calcium dans les mutants sca-1(tm5339) (n-12) et les contrôles (n-8). (F) La quantification du temps de désintégration à moitié de la canalrhodopsine évoquait des transitoires de calcium chez les mutants sca-1(tm5339) (n-12) et les témoins (n-7). Les valeurs statistiquement significatives étaient : pas significative p -gt;0.05, p '0,05, 'p '0,01, 'p '0,001. Les barres d'erreur représentent la moyenne - SEM. Les données ont été normalisées à l'aide de tests Shapiro-Wilk et l'importance a été déterminée avec un test Mann-Whitney pour les distributions non normales. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Niveaux de calcium de base et transitoires de calcium évoqués à partir d'échantillons de contrôle et de sca-1(tm5339) préparés à l'aide de l'immobilisation des nanoperles. (A) Images représentatives de la fluorescence de base chez les mutants et les témoins sca-1(tm5339), barre d'échelle 50 m. (B) Quantification des niveaux de fluorescence RCaMP de base chez les mutants sca-1(tm5339) (n-14) et le contrôle (n-13) . (C) Moyenne des transitoires de calcium évoqués pour les mutants et les témoins sca-1(tm5339). (D) Quantification de la fluorescence maximale du RCaMP à la suite de la réponse évoquée du calcium chez les mutants sca-1(tm5339) (n-14) et les témoins (n-13). (E) Quantification de l'élévation à l'heure de pointe des transitoires évoqués de calcium dans les mutants sca-1(tm5339) (n-14) et les contrôles (n-12). (F) Quantification du temps de demi-décomposition des transitoires de calcium évoqués dans les mutants sca-1(tm5339) (n-14) et le contrôle (n-13). Figure est adaptée à partir de19. Les valeurs statistiquement significatives étaient : pas significative p 'gt; 0.05, 'p '0.05, 'p '0.01, 'p '0.001. Les barres d'erreur montrent la moyenne - SEM. La normalité des données a été évaluée à l'aide de tests Shapiro-Wilk et l'importance a été déterminée à l'aide d'un test Mann-Whitney pour les distributions non normales. Ce chiffre a été modifié avec la permission de19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Niveaux de calcium de base et transitoires de calcium évoqués à partir d'échantillons de contrôle et de slo-1(par exemple142) préparés à l'aide de nanoperles d'immobilisation. (A) Images représentatives de la fluorescence de base chez les mutants et les témoins slo-1(par exemple142), la barre d'échelle de 50 m. (B) Quantification des niveaux de fluorescence RCaMP de base chez les mutants slo-1 (par exemple142) (n-29) et le contrôle (n-13). (C) Moyenne des transitoires de calcium évoqués pour les mutants et les témoins slo-1(par exemple142). (D) Quantification de la fluorescence maximale du RCaMP à la suite de la réponse évoquée du calcium chez les mutants slo-1 (par exemple142) (n-29) et les témoins (n-13). (E) Quantification de l'élévation à l'heure de pointe des transitoires évoqués de calcium dans les mutants slo-1 (par exemple142) (n-29) et les contrôles (n-13). (F) Quantification du temps de décomposition demi-decay des transitoires évoqués de calcium dans les mutants slo-1 (par exemple142) (n-11) et les contrôles (n-13). Figure est adaptée à partir de19. Les valeurs statistiquement significatives étaient : pas significative p 'gt; 0.05, 'p '0.05, 'p '0.01, 'p '0.001. Les barres d'erreur montrent la moyenne - SEM. La normalité des données a été évaluée à l'aide de tests Shapiro-Wilk et l'importance a été déterminée à l'aide d'un test Mann-Whitney pour les distributions non normales. Ce chiffre a été modifié avec la permission de19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les GECI sont un outil puissant en neurobiologie de C. elegans. Des travaux antérieurs ont utilisé des techniques d'imagerie calcique pour examiner une grande variété de fonctions dans les neurones et les cellules musculaires, y compris les réponses sensorielles et comportementales, avec des méthodes variées de stimulation. Certaines études ont utilisé des stimuli chimiques pour déclencher les transitoires de calcium dans les neurones sensoriels ASH22,23 ou pour induire des ondes de calcium dans les muscles pharyngés24. Un autre groupe a utilisé la stimulation mécanique tandis que les vers ont été maintenus dans des puces microfluidiques pour examiner les réponses de calcium dans les neurones de récepteur de contact25. Pourtant, d'autres ont utilisé la stimulation électrique pour visualiser les changements de calcium dans les deux neurones26 et les muscles de la paroi du corps27. Ce qui est commun entre ces études est l'exigence de stimuli externes, tels que des solutions ou de l'équipement, pour déclencher des transitoires de calcium. Le protocole décrit ici capitalise sur le contrôle obtenu de la stimulation optogénétique, qui fournit la spécificité neuronale, couplée à l'analyse fonctionnelle des GECIs exprimés par le muscle2 dans le même paradigme expérimental.
Deux formes d'immobilisation des vers sont décrites et, bien que chaque méthode devrait être évaluée lorsqu'il s'agit de répondre aux besoins expérimentaux, les préparations disséquées et physiologiquement intactes produisent des résultats complémentaires permettant aux chercheurs d'utiliser l'une ou l'autre approche. dans leurs recherches. Il y a un défi technique accru à employer la technique de dissection, avec l'utilisateur étant exigé pour maîtriser l'utilisation précise de la colle chirurgicale et la microdissection sans endommager le cordon ou les muscles de nerf. En outre, en raison du niveau de difficulté de la dissection, seuls les adultes gravid devraient être utilisés, ce qui pourrait limiter les points de temps expérimentaux. En outre, la technique de dissection est également beaucoup plus difficile à exécuter sur les mutants qui produisent de petits animaux minces ou maladifs, limitant encore une fois peut-être les paramètres expérimentaux. L'avantage de cette technique est qu'elle limite l'artefact de mouvement de corps résultant de la dépolarisation, le collage empêche le mouvement excessif du corps du ver, et fournit également l'accès au NMJ pour des changements de solution et des applications de drogue. En outre, chaque préparation expose la même zone du ver, ce qui garantit que les muscles de la paroi du corps seront constamment au point. La deuxième technique, utilisant des nanobeles pour immobiliser les vers, est moins impliquée et peut être rapidement apprise. En outre, n'importe quel animal d'âge peut être employé avec cette méthode, permettant des changements dans la manipulation de calcium par le développement pour être surveillés. Il faut faire attention lorsqu'on place les vers dans la solution des nanoperles, car trop de manipulation des animaux peut les faire éclater. En outre, la couverture ne doit pas être déplacée une fois placée sur les animaux, car cela peut causer les animaux à rouler ou à se tordre sur eux-mêmes, conduisant encore une fois aux dommages. Bien que l'utilisation des nanoperles peut fournir un résultat de haut débit dans lequel les animaux pourraient potentiellement être récupérés, il n'y a pas de normalisation de la position du corps de l'animal, de ainsi chaque animal peut ne pas avoir les muscles de la paroi du corps dans un plan focal clair. Si l'expérience nécessite un grand nombre d'animaux, différentes méthodes d'immobilisation peuvent être nécessaires, telles que les micro-puits à base d'agar, qui permettent l'imagerie de fluorescence calcique en vrac28. Indépendamment des limites de ces deux techniques, l'une ou l'autre peut être employée pour obtenir des transitoires fiables et facilement quantifiables de calcium dans les muscles de la paroi du corps de C. elegans.
C. elegans offre de nombreux avantages en tant que système in vivo pour les études d'imagerie fonctionnelle. Les animaux sont transparents, permettant l'appariement de la dépolarisation neuronale optogénétique grâce à l'utilisation de la channelrhodopsine avec le GECI RCaMP pour mesurer les transitoires de calcium postsynaptiques résultantes dans le muscle. Les niveaux de pré-stimulation de la fluorescence de RCaMP peuvent également être employés pour évaluer des niveaux cytosoliques de base de calcium. La tractabilité génétique de C. elegans rend l'étude de nouvelles mutations qui peuvent affecter l'homéostasie du calcium ou la manipulation facile à poursuivre, souvent avec des allèles mutants facilement disponibles. En utilisant les techniques décrites dans ce protocole, les données d'imagerie calcique postsynaptiques peuvent être obtenues efficacement et à un coût relativement faible, ce qui en fait un système attrayant pour un large éventail d'expériences d'imagerie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Alexander Gottschalk pour ZX1659, le RCaMP et la channelrhodopsine contenant la souche de ver, le Dr Hongkyun Kim pour la souche de ver slo-1(eg142), et le National Bioresource Project pour la souche de ver sca-1(tm5339).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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