Summary
Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.
Abstract
L'organismo modello C. elegans fornisce un ottimo sistema per eseguire l'imaging in vivo del calcio. Il suo corpo trasparente e la sua manipolabilità genetica consentono l'espressione mirata di sensori di calcio geneticamente codificati. Questo protocollo delinea l'uso di questi sensori per l'imaging in vivo della dinamica del calcio nelle cellule mirate, in particolare i muscoli della parete corporea dei vermi. Utilizzando la co-espressione della channelrhodopsin presintica, la stimolazione del rilascio dell'acetilcolina dai motoneuroni eccitatori può essere indotta utilizzando impulsi di luce blu, con conseguente depolarizzazione muscolare e cambiamenti riproducibili nel calcio citoplastico Livelli. Due tecniche di immobilizzazione dei vermi sono discusse con diversi livelli di difficoltà. Il confronto di queste tecniche dimostra che entrambi gli approcci preservano la fisiologia della giunzione neuromuscolare e consentono la quantificazione riproducibile dei transitori di calcio. Associando l'optogenetica e l'imaging funzionale del calcio, i cambiamenti nella manipolazione post-sinaptica del calcio e nell'omeostasi possono essere valutati in una varietà di background mutanti. I dati presentati convalidano entrambe le tecniche di immobilizzazione ed esaminano specificamente i ruoli del c. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase e il canale di potassio BK attivato dal calcio nella regolazione del calcio muscolare della parete corporea.
Introduction
Questo articolo presenta metodi per l'imaging del calcio in vivo dei muscoli della parete corporea di C. elegans utilizzando la stimolazione neuronale optogenetica. L'associazione di un muscolo ha espresso indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) con la depolarizzazione neuronale innescata dalla luce blu e fornisce un sistema per osservare chiaramente i transitori di calcio postsinaptico evocati. Questo evita l'uso della stimolazione elettrica, consentendo un'analisi non invasiva dei mutanti che influenzano la dinamica post-sinaptica del calcio.
I GECI a singolo fluoroforo, come GCaMP, utilizzano una singola molecola proteica fluorescente fusa nel dominio M13 della catena luminosa miosina chinasi all'estremità terminale N e al calmodulin (CaM) al C-terminus. Al momento del legame del calcio, il dominio CaM, che ha un'alta affinità per il calcio, subisce un cambiamento conformazionale che induce un successivo cambiamento conformazionale nella proteina fluorescente che porta ad un aumento dell'intensità fluorescenza1. La fluorescenza GCaMP è eccitata a 488 nm, rendendola inadatta per essere utilizzata in combinazione con la channelrhodopsin, che ha una lunghezza d'onda di eccitazione simile di 473 nm. Pertanto, al fine di accoppiare le misurazioni del calcio con la stimolazione della channelrhodopsin, la proteina fluorescente verde di GCaMP deve essere sostituita con una proteina fluorescente rossa, mRuby (RCaMP). Utilizzando il muscolo espresso RCaMP, in combinazione con l'espressione del neurone motorio colinergico della channelrhodopsin, permette studi presso la giunzione neuromuscolare del verme (NMJ) con l'uso simultaneo di optogenetica e imaging funzionale all'interno dello stesso animale 2.
L'uso della channelrhodopsin bypassa la necessità che la stimolazione elettrica depolarizzi le giunzioni neuromuscolari di C. elegans, che possono essere raggiunte solo in preparati sezionati, rendendo così questa tecnica più facile da impiegare e più precisa quando si prendono di mira tessuti specifici. Ad esempio, la channelrhodopsin è stata precedentemente utilizzata in C. elegans per attivare in modo reversibilizzato neuroni specifici, portando all'attivazione robusta di neuroni eccitatori o inibitori3,4. L'uso della depolarizzazione stimolata dalla luce elude anche il problema dei danni neuronali dovuti alla stimolazione elettrica diretta. Questo offre l'opportunità di esaminare gli effetti di molti protocolli di stimolazione diversi, tra cui stimolazioni sostenute e ripetute, sulla dinamica post-sinaptica del calcio4.
La natura trasparente di C. elegans lo rende ideale per l'analisi funzionale dell'imaging fluorescente. Tuttavia, quando si stimolano i neuroni eccitatori di acetilcolina al NMJ, gli animali sono tenuti a rispondere con una contrazione muscolare immediata4, rendendo l'immobilizzazione dei vermi critici nella visualizzazione dei cambiamenti discreti di calcio. Tradizionalmente, gli agenti farmacologici sono stati utilizzati per paralizzare gli animali. Uno di questi farmaci utilizzati è levamisole, un agonista recettore acetilcolina colinergico5,6,7. Poiché levamisole porta all'attivazione persistente di un sottotipo di recettori muscolari eccitatori, questo reagente non è adatto per lo studio della dinamica del calcio muscolare. L'azione di levamisole induce depolarizzazione post-sinaptica, elevando il calcio citosolico, e osservazioni occlude a seguito di stimolazione pressinaptica. Per evitare l'uso di farmaci paralizzanti, abbiamo esaminato due metodi alternativi per immobilizzare C. elegans. Gli animali sono stati incollati e poi sezionati aperti per esporre i muscoli della parete del corpo, simile al metodo elettrofisiologia C. elegans NMJesistente 8, o nanosfere sono state utilizzate per immobilizzare gli animali intatti9. Entrambe le procedure hanno permesso le misurazioni riproducibili dei transitori di calcio muscolare a riposo ed evocate che erano facilmente quantificabili.
I metodi in questo documento possono essere utilizzati per misurare i livelli di calcio citosolico di base e transitori nelle cellule muscolari post-sinaptiche della parete del corpo in C. elegans. Vengono forniti esempi di dati che utilizzano le due diverse tecniche di immobilizzazione. Entrambe le tecniche sfruttano l'optogenetica per depolarizzare le cellule muscolari senza l'uso di stimolazione elettrica. Questi esempi dimostrano la fattibilità di questo metodo nella valutazione delle mutazioni che influenzano la manipolazione post-sinaptica del calcio nei vermi e sottolineano i pro e i contro dei due approcci di immobilizzazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configurazione del microscopio
- Utilizzare un microscopio composto con capacità di fluorescenza. Per questo studio, sono stati raccolti dati su un microscopio verticale (Tabella dei materiali) dotato di LED per l'eccitazione.
- Al fine di visualizzare correttamente i cambiamenti di fluorescenza nei muscoli della parete del corpo, utilizzare un obiettivo di ingrandimento elevato.
- Per i preparati sezionati, utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x NA 1.0 (Tabella dei materiali).
- Per i preparati utilizzino nanosfere, utilizzare un obiettivo di immersione dell'olio 60x NA 1.4 (Tabella dei materiali). Questo ingrandimento garantisce una risoluzione sufficiente dei muscoli sul sensore della fotocamera.
- Utilizzare una fotocamera ad alta sensibilità collegata al microscopio per catturare immagini ad alta frequenza fotogrammi al fine di monitorare i rapidi cambiamenti nei livelli di calcio. Per questo studio, l'immagine con un sistema sCMOS (Tabella dei materiali) in grado di immagini complete del telaio a 100 Hz, in quanto i tempi di salita per i segnali Ca2 o possono essere rapidi quanto decine di millisecondi.
- Controllare l'acquisizione della telecamera e l'eccitazione a fluorescenza a LED con un software di micro-manager in esecuzione in ImageJ10 secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
- Utilizzare un plug-in della piattaforma elettronica open source, che collega una scheda microcontrollore open source esterna (Table of Materials), per gestire gli impulsi di temporizzazione esterni per controllare l'eccitazione a fluorescenza.
NOTA: i digital out sono disponibili da pin digitali da 8 a 13 che forniscono bit di uscita da 0 a 5. Questi possono essere indirizzati come valori di base 2 di 1, 10, 100, ecc. Le impostazioni delle porte seriali sono indicate nella tabella 1 e sono disponibili dal sito web del micro-manager ( Tabelladei materiali). Il firmware per la scheda microcontroller è disponibile in modo analogo su questo sito Web. - Per controllare la logica di temporizzazione, attivare il protocollo di acquisizione del micromanager nel software secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
NOTA: Questo avvia contemporaneamente una durata preimpostata del fotogramma della fotocamera e il numero di fotogrammi da attivare, così come l'otturatore logico e il LED ambra preimpostato per l'eccitazione a fluorescenza. In questo caso, l'interruttore a stato solido a LED ambra è controllato dall'uscita del microcontrollore bit 1 attraverso il pin 9. La fotocamera inquadra il TTL (piastra posteriore su 3 connettore) attiva uno stimolatore. Questo è spesso l'attivazione del LED a luce blu per l'attivazione della channelrhodopsin in un momento prestabilito dopo l'attivazione della sequenza di imaging. - Per stimolare la channelrhodopsin con la luce blu e registrare i cambiamenti RCaMP, utilizzare due LED. Attivare channelrhodopsin con un LED con una lunghezza d'onda di picco di emissione di 470 nm e un filtro passabanda (455 a 490 nm) ed eccitare RCaMP con un LED con una lunghezza d'onda di picco di emissione di 594 nm e un filtro passabanda (da 570 a 600 nm).
- Al fine di attivare contemporaneamente channelrhodopsin e catturare i cambiamenti nei livelli fluorescenti RCaMP, co-illuminare entrambi i LED e trasmettere la luce allo stesso percorso ottico utilizzando un combinatore di fascio dicroico.
- Controllare la temporizzazione dell'illuminazione a LED con interruttori a stato solido (Tabella dei materiali) controllati da segnali TTL (tempo di accvito con punteggio massimo, 1 ms, tempo di spegnimento di 0,3 ms: da 0 a 90% di acconto e tempo di spegnimento di < 100 s).
- Impostare l'intensità del LED con gli alimentatori lineari a basso rumore controllati (Tabella dei materiali).
- Per garantire la tempistica precisa del LED a luce blu, attivarlo direttamente con l'impulso TTL al relè allo stato solido da uno stimolatore. Programmare il protocollo di stimolazione della luce blu in uno stimolatore (Tabella dei materiali), che agisce come un timer preciso dall'inizio dell'acquisizione dell'immagine all'illuminazione LED blu. In questo esperimento, attivare la stimolazione della luce blu dopo 2 s di catturare solo la fluorescenza RCaMP e utilizzare un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu con intervalli interpulsivi 50 ms per attivare la channelrhodopsin.
NOTA: il ritardo prima degli impulsi di luce blu, la durata degli impulsi della luce blu, il tempo tra gli impulsi e il numero di impulsi nel treno possono essere tutti impostati a questo punto e devono riflettere i parametri specifici di interesse sperimentale.
2. Preparazione e acquisizione di dati del campione di C. elegans
- Per stimolare otticamente i neuroni presintici, ottenere animali che esprimono channelrhodopsin in neuroni colinergici eccitatori, guidati con la regione promotrice unc-17, e RCaMP espresso in tutti i muscoli della parete del corpo guidati con il promotore myo-3 regione2.
NOTA: Si raccomanda solo l'uso di animali con transgeni integrati e robusti livelli di fluorescenza, in quanto l'espressione variabile nei tipi di cellule corrispondenti può influire sull'affidabilità dell'acquisizione dei dati. - Fare uno stock di lavoro di tuttala retina dissuasivo diluindo la polvere retinica ( Tabelladei materiali) in etanolo per creare una concentrazione finale di 100 mM e conservare a -20 gradi centigradi. Questo stock di lavoro sarà stabile per circa un anno.
- Creare uno stock di OP50 E. coli, coltivato in supporti LB, integrato con retieria tuttatrans dal magazzino di lavoro realizzato al punto 2.2, ad una concentrazione finale di 80 M. Il volume utilizzato per lo stock di OP50-retinale dipenderà dal numero di lastre necessarie per l'esperimento.
- Piastre di prosciugamento del nematode (NGM) con circa 300 -L del brodo OP50-retinale e permettono alle piastre di asciugarsi durante la notte a temperatura ambiente al buio.
- Coltiva ceppi di C. elegans fino all'età desiderata al buio su piastre NGM OP50-retinali a 20 gradi centigradi. Per questo esperimento, utilizzare vermi adulti.
- Per l'esperimento che utilizza la preparazione sezionata, utilizzare solo vermi adulti gravidi come eseguire la dissezione su animali più giovani e più piccoli è estremamente impegnativo. Lasciare gli animali sulle placche op50-retinale per un minimo di 3 giorni per un'attivazione efficace della channelrhodopsin.
- Se si utilizza la preparazione sezionata8,11 (Figura 1A), eseguire dissezioni in condizioni di scarsa illuminazione.
- Mettere gli animali in un piatto di dissezione con una base in vetrittaio rivestito in silicone che viene riempito con una soluzione extracellulare da 1 mM Ca2 o più composta da 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM di glucosio, 5 mM di saccarosio e 15 mM HEPES (pH 7.3 , -340 Osm).
- Incolla gli animali usando l'adesivo della pelle topica liquida con colorazione blu lungo il lato dorsale del verme e fai un'incisione cuticola laterale lungo l'interfaccia colla/verme utilizzando aghi di vetro.
- Utilizzare una pipetta bocca per cancellare le viscere interne dalla cavità del verme.
- Incollare il lembo cuticola dell'animale per esporre i muscoli ventrali della parete corporea per l'imaging.
- Se si utilizza la preparazione della nanosfera (Figura 1B)
- Fare una soluzione fusa 5% agarose utilizzando ddH2O ad un volume finale di 100 mL.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, mettere una goccia di soluzione agarose fusa su uno scivolo di vetro e posizionare immediatamente un secondo vetrino sopra la parte superiore, perpendicolare al primo, utilizzando una leggera pressione per creare un pad agarose uniforme. Rimuovere la diapositiva superiore prima dell'uso.
- Aggiungere circa 4 -L di nanosfere di polistirolo (Tabella dei materiali) al centro del cuscinetto di agarose.
- Nella luce bassa, scegli 4-6 C. elegannella nella soluzione di nanosfera, assicurandoti che gli animali non si sdraino l'uno sull'altro e posiziona con attenzione un coperchio sulla parte superiore.
- Posizionare il piatto di scivolo o dissezione preparato al microscopio e trovare e mettere a fuoco su un verme utilizzando l'ingrandimento 10x e l'illuminazione del campo luminoso fioca.
- Passare all'ingrandimento 60x e all'eccitazione a fluorescenza RCaMP per identificare un muscolo della parete corporea ventromediale che si trova anteriormente alla vulva e nel piano focale corretto.
NOTA: I muscoli anteriori alla vulva vengono selezionati in quanto riflettono i muscoli comunemente stimolati negli esperimenti di elettrofisiologia. - Modificare il percorso dell'immagine dall'oculare alla fotocamera estraendo l'interruttore e facendo clic su Live all'interno del software di acquisizione dati (Tabella dei materiali).
NOTA: Assicurarsi che il percorso di stimolazione della luce blu sia disattivato a questo punto per assicurarsi che la channelrhodopsin non venga attivata prima di acquisire le immagini. - Mettere a fuoco l'immagine all'interno del software di acquisizione dati utilizzando la messa a fuoco fine del microscopio.
- Quando il muscolo è chiaramente a fuoco, disattiva l'immagine dal vivo deselezionando il pulsante Live.
- Fare clic sul pulsante ROI nel software di acquisizione dati e creare una casella intorno al muscolo su cui ci si concentra.
- Sullo stimolatore, attivare il percorso di stimolazione della luce blu che è stato precedentemente programmato nel passaggio 1.10.
- Fare clic su Acquisisci nel software di imaging per acquisire l'immagine tramite la fotocamera CMOS. A tale scopo, impostare il tempo di esposizione su 10 s con 1.000 fotogrammi e 2x binning.
3. Analisi dei dati
- Aprire il file di dati nel software di imaging (Tabella dei materiali) e, utilizzando lo strumento Polygon, delineare il muscolo di interesse. Questo è il ROI.
- Vai all'immagine . Proprietà Stacks . Tracciare il profilo dell'asse z ed esportare i punti dati risultanti nel software del foglio di calcolo ( Tabella deimateriali). Questa funzione traccia il valore medio di selezione del ROI rispetto al punto temporale.
- Spostare il ROI muscolare creato con lo strumento Poligono all'esterno dell'animale per ottenere una misurazione della fluorescenza di fondo utilizzando i passaggi descritti nella versione 3.2. Esportare i dati risultanti nella cartella di lavoro del foglio di calcolo.
- Nella cartella di lavoro del foglio di calcolo, sottrarre i valori di fluorescenza di sfondo dai valori di fluorescenza muscolare in ogni punto temporale. Questo fornisce lo sfondo sottratto segnale fluorescente.
- Media dello sfondo sottratto fluorescenza per i primi 2 s di punti dati. Questo darà la misurazione della fluorescenza di base, F.
- Utilizzare la misurazione della fluorescenza linea di base per calcolare il livello di fluorescenza normalizzato in ogni punto temporale. A tale scopo, utilizzare l'equazione (F/F) . La F rappresenta (F(t)-F), dove F(t) è la misurazione della fluorescenza in un determinato punto temporale e F è il valore della linea di base. L'1 viene aggiunto come offset dell'asse y.
- Ripetere i passaggi da 3.2 a 3.6 per ogni immagine muscolare raccolta. Utilizzando singole o più cellule muscolari per immagine è a discrezione del ricercatore. La n dell'esperimento può essere determinata eseguendo un'analisi di potenza.
- Utilizzare i dati elaborati dai passaggi 3.2-3.6 per tracciare i valori fluorescenti nel software grafico secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
- Da questa traccia, misurare la cinetica del calcio transitorio, come ad esempio l'aumento al tempo di picco e il tempo di decadimento, utilizzando gli strumenti forniti nel software grafico secondo le istruzioni del produttore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questa tecnica ha valutato i cambiamenti nei mutanti che si ritiene influenzino la manipolazione del calcio o la depolarizzazione muscolare. Sono stati visualizzati i livelli di fluorescenza di base e i transitori fluorescenti e sono stati valutati il calcio citosolico a riposo e la cinetica di calcio all'interno del muscolo. È importante che gli animali siano stati coltivati su una retina tutta trans per almeno tre giorni per garantire la corretta incorporazione della retina, attivando così successivamente la channelrhodopsin (Figura 2A). Se gli animali non sono esposti a retieria trans, non viene attivato alcun transitorio di calcio muscolare (Figura 2B). Anche se questi animali possono ancora essere utilizzati per valutare i livelli di calcio citosolico di base, eventuali cambiamenti dinamici nel calcio non saranno catturati. Inoltre, come controllo interno per la salute degli animali o della dissezione, l'animale si contrarrà seguendo la stimolazione della luce blu. Una registrazione con una contrazione muscolare che causa il minimo movimento lordo del corpo del verme è stata selezionata per la raccolta dei dati quando si utilizzano nanosfere per l'immobilizzazione. Se il muscolo utilizzato per raccogliere i valori di fluorescenza grezza si contrae vigorosamente, causando lo spostamento di tutto il corpo del verme, la traccia transitoria rifletterà questo artefatto di movimento (Figura 2C) e dovrebbe essere scartato dalla quantificazione.
Una mappatura delle mutazioni al locus genico sca-1 è stata isolata da uno schermo per le mutazioni che hanno un impatto sulla localizzazione del recettore nicotinico muscolare di C. elegans. Il gene C. elegans sca-1 codifica l'unico omolog del calcio reticolare plasmica sarco(endo)plasmic ATPase (SERCA) nel verme ed è l'unica pompa SERCA presente nei muscoli della parete corporea12,13. I mutanti sca-1 di perdita di funzione sono stati previsti per mostrare cambiamenti nella manipolazione del calcio muscolare in base al ruolo importante che SERCA svolge nel mantenere l'omeostasi di calcio nei muscoli dei mammiferi14,15,16 ,17,18. Il GECI RCaMP è stato espresso nei muscoli della parete corporea e la channelrhodopsin a luce blu attivata dalla luce è stata espressa in neuroni collinergici eccitatori per valutare sia la dinamica intracellulare del calcio di base che della dinamica del calcio nei mutanti sca-1. Con la tecnica di preparazione sezionata, sono stati osservati aumenti dei livelli di base della fluorescenza RCaMP nel mutante sca-1 rispetto al controllo (Figura 3A,B), suggerendo che la perdita della funzione SERCA porta a elevati livelli di calcio citoplasmaso a riposo. Quando sono state esaminate le dinamiche del calcio, a seguito di stimolazione presinaptica innescata con un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu (Figura 3C), c'è stata una significativa diminuzione dei livelli di calcio di picco nei mutanti sca-1(tm5339) come rispetto al controllo (Figura 3D), che può riflettere depositi di calcio ridotti nella SR. Tuttavia non è stato riscontrato alcun cambiamento nell'aumento dell'ora di punta o nel tempo di semidecano(Figura 3E,F). Ciò suggerisce che i cambiamenti evocati nel calcio citononico da una fonte esterna come l'ingresso di calcio attraverso i recettori dell'acetilcolina e/o i canali di calcio legati alla tensione, nonché dai depositi interni, non sono influenzati nei mutanti sca-1(tm5339) . Risultati simili possono essere osservati utilizzando la preparazione della nanofara, come mostrato nella Figura 419. Questa ricapitolazione dei dati fornisce la prova che entrambe queste tecniche sono fisiologiche per misurare i livelli di calcio citoplasmico a riposo del muscolo del corpo e per osservare i transitori di calcio stimolati. Questo dimostra anche che la dissezione del verme non causa danni all'animale che altera la sua manipolazione di calcio o la capacità di depolarizzare i muscoli post-sinaptici.
Questo protocollo può essere utilizzato anche per esaminare i mutanti che indirettamente influenzano la manipolazione del calcio in C. elegans. La perdita di mutanti slo-1(eg142) è stata valutata per dimostrarlo. Il gene slo-1 codifica un canale di potassio BK attivato dal calcio, che è espresso sia nei neuroni che nei muscoli20,21. Gli studi hanno descritto in precedenza un ruolo per SLO-1 nei muscoli della parete del corpo, dimostrando che la perdita di mutanti di funzione hanno un difetto nella ripolarizzazione postsinaptica a seguito di potenziali di azione muscolare20,21. Possibili cambiamenti nei livelli di calcio di base e nelle dinamiche transitorie del calcio a causa di questa ipereccitabilità sono stati esaminati utilizzando l'immobilizzazione delle nanosfere. Quando sono stati misurati i livelli di base di RCaMP, i mutanti slo-1(eg142) visualizzati aumentano la fluorescenza rispetto ai controlli (Figura 5A,B)19. Ciò suggerisce che i canali BK possono anche regolare i livelli di base del calcio citosolico. Nessun cambiamento nei livelli di calcio di picco sono stati visti rispetto al controllo (Figura 5C,D) quando si valuta la cinetica del calcio evocato transitorio. I mutanti slo-1(eg142), tuttavia, hanno mostrato un aumento significativo al momento di picco rispetto al controllo (Figura 5E). Ciò può riflettere un aumento precedentemente segnalato dell'eccitabilità pressinaptica20,21. Tuttavia, non vi è stato alcun cambiamento significativo nel tempo di semidecano nei mutanti slo-1(eg142) rispetto al controllo (Figura 5F). Insieme, questi dati dimostrano che questo metodo può essere utilizzato per valutare gli effetti delle mutazioni pre e post-sinaptiche sia sul calcio muscolare della parete del corpo a riposo che su quello stimolato.
| Impostazione seriale | valore |
| Timeout risposta | 500 |
| Baud rate | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| procedura di sincronizzazione delle comunicazioni | via |
| parità | nessuno |
| Stopbits | 1 |
| verboso | 0 |
Tabella 1: Impostazioni della porta seriale per il plug-in microcontroller, che controlla una scheda microcontroller esterna. Questo viene utilizzato per programmare impulsi di temporizzazione esterni per controllare l'eccitazione a fluorescenza.
Figura 1: Rappresentazione grafica di diverse tecniche di immobilizzazione. (A) Questo grafico dimostra la tecnica di dissezione per l'immobilizzazione. Il corpo del verme è incollato (blu) intorno al lato dorsale dell'animale. Un'incisione dorsale lungo la cuticola genera un lembo di cuticola. Questo lembo è stato incollato per esporre le NMJ intatte formate tra le sinapsi del cordone nervoso ventrale in verde (channelrhodopsin) e RCaMP esprimendo muscoli in rosso. (B) Questo grafico dimostra la tecnica di immobilizzazione delle nanosfere. Il verme intatto è circondato da una rappresentazione delle nanosfere in soluzione, che quando compressi dal coperchio sovrastante, immobilizzano il verme. Grazie alla trasparenza di C. elegans, il cordone nervoso ventrale può essere visualizzato in verde (channelrhodopsin) e RCaMP esprimendo i muscoli possono essere visualizzati in rosso. L'ovoide al centro del verme rappresenta la vulva, che è un punto di riferimento che identifica i muscoli ventrali della parete del corpo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tracce rappresentative di transitori di calcio. (A) Rappresentazione singola di un transitorio di calcio evocato da un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu a intervalli interpulsivi di 50 ms, registrati in un animale con movimento del corpo limitato (- movimento) coltivato in presenza di trans retinica). Gli artefatti del picco sono gli impulsi di stimolazione della luce blu, poiché entrambi i LED sono co-illuminati contemporaneamente. (B) Traccia singola che mostra l'assenza di un transitorio di calcio in risposta a un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu con intervalli di 50 ms interpulse in un animale che non è stato esposto a tutto-trans retinico (-tutto- trans retinale , - movimento). (C) Rappresentazione singola di un transitorio di calcio che è stata evocata da un treno di 5, 2 ms impulsi di luce blu con intervalli interpulsivi di 50 ms, registrati in un animale che aveva una significativa contrazione muscolare che porta a artefatti di movimento tuttotrans retinica). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli di calcio al basato ed evocati transitori di calcio dal controllo e campioni sca-1(tm5339) preparati utilizzando la tecnica di dissezione. (A) Immagini rappresentative della fluorescenza RCaMP di base nei mutanti e nei controlli sca-1(tm5339). Barra di scala - 50 m. (B) La quantità di fluorescenza di base livelli quantificazione in sca-1(tm5339) mutanti e di controllo (n.9). (C) Ensemble tracce medie di transitori di calcio evocati per sca-1(tm5339) mutanti e animali di controllo. (D) La quantificazione del picco di fluorescenza di RCaMP da channelrhodopsin ha evocato risposte di calcio in sca-1(tm5339) mutanti (n.12) e controlli (n.9). (E) La quantificazione dell'aumento al momento di punta della channelrhodopsin ha evocato transitori di calcio in mutanti sca-1(tm5339) (n.12) e controlli (n.8). (F) Metà decadimento del tempo di quantificazione della channelrhodopsin evocato transitori di calcio in sca-1(tm5339) mutanti (n.12) e controlli (n.7). I valori statisticamente significativi sono stati: p>0,05 non significativi, 0,05, 0,01 USD, p>0,001 USD. Le barre di errore rappresentano la media: i dati sono stati normalizzati utilizzando i test Shapiro-Wilk e il significato è stato determinato con un test Mann-Whitney per distribuzioni non normali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Livelli di calcio al basato ed evocavano i transitori di calcio dal controllo e i campioni di sca-1(tm5339) preparati utilizzando l'immobilizzazione delle nanosfere. (A) Immagini rappresentative della fluorescenza di base nei mutanti e nei controlli sca-1(tm5339), barra della scala 50 m. (B) Quantificazione dei livelli di fluorescenza di base di RCaMP nei mutanti sca-1(tm5339) (n.14) e il controllo (n.13) . (C) Media dei transitori di calcio evocati per i mutanti e i controlli sca-1(tm5339). (D) Quantificazione del picco di fluorescenza RCaMP in seguito a una risposta al calcio evocata nei mutanti sca-1(tm5339) (n.14) e controlli (n.13). (E) Quantificazione dell'aumento fino al momento di punta dei transitori di calcio evocati nei mutanti sca-1(tm5339) (n. 14) e controlli (n.12). (F) Quantificazione del tempo di mezza decadenza dei transitori di calcio evocati in sca-1(tm5339) mutanti (n.14) e di controllo (n.13). La figura è adattata a partire da19. I valori statisticamente significativi sono stati: p > 0,05, , 0,05, 0,01, 0,01 usd, p, 0,001 USD, 0,001 USD. Le barre di errore indicano che la normalità dei dati è stata valutata utilizzando i test Shapiro-Wilk e il significato è stato determinato con un test Mann-Whitney per distribuzioni non normali. Questa cifra è stata modificata con il permesso da19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Livelli di calcio al basato ed evocati transitori di calcio dal controllo e campioni di slo-1(eg142) preparati utilizzando l'immobilizzazione delle nanosfere. (A) Immagini rappresentative della fluorescenza di base nei mutanti e nei controlli di slo-1(eg142), barra della scala 50 m. (B) Quantificazione dei livelli di fluorescenza di base di RCaMP nei mutanti slo-1(eg142) (n.29) e il controllo (n.13). (C) Media dei transitori di calcio evocati per mutanti e controlli slo-1(eg142). (D) Quantificazione del picco di fluorescenza RCaMP in seguito a una risposta al calcio evocata in mutanti slo-1(eg142) (n.29) e controlli (n.13). (E) Quantificazione dell'ascesa al momento di punta dei transitori di calcio evocati nei mutanti slo-1(eg142) (n. 29) e controlli (n.13). (F) Quantificazione del tempo di mezza decadenza dei transitori di calcio evocati in slo-1(eg142) mutanti (n. 11) e controlli (n.13). La figura è adattata a partire da19. I valori statisticamente significativi sono stati: p > 0,05, , 0,05, 0,01, 0,01 usd, p, 0,001 USD, 0,001 USD. Le barre di errore indicano che la normalità dei dati è stata valutata utilizzando i test Shapiro-Wilk e il significato è stato determinato con un test Mann-Whitney per distribuzioni non normali. Questa cifra è stata modificata con il permesso da19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I GECI sono un potente strumento nella neurobiologia di C. elegans. Il lavoro precedente ha utilizzato tecniche di imaging del calcio per esaminare un'ampia varietà di funzioni sia nei neuroni che nelle cellule muscolari, comprese le risposte sensoriali e comportamentali, con vari metodi di stimolazione. Alcuni studi hanno utilizzato stimoli chimici per innescare transitori di calcio nei neuroni sensoriali ASH22,23 o per indurre le onde di calcio nei muscoli fallingei24. Un altro gruppo ha utilizzato la stimolazione meccanica mentre i vermi sono stati tenuti in chip microfluidici per esaminare le risposte di calcio nei neuroni recettori touch25. Ancora, altri hanno impiegato stimolazione elettrica per visualizzare i cambiamenti di calcio in entrambi i neuroni26 e muscoli della parete del corpo27. Ciò che è comune tra questi studi è il requisito di stimoli esterni, come soluzioni o attrezzature, per innescare transitori di calcio. Il protocollo qui descritto sfrutta il controllo ottenuto dalla stimolazione optogenetica, che fornisce specificità neuronale, accoppiato con l'analisi funzionale dei GECI espressi dal muscolo2 nello stesso paradigma sperimentale.
Vengono descritte due forme di immobilizzazione dei vermi e, mentre ogni metodo deve essere valutato quando si affrontano le esigenze sperimentali, sia sezionate che preparati fisiologicamente intatti producono risultati complementari che consentono agli sperimentatori di utilizzare entrambi gli approcci nella loro ricerca. C'è una maggiore sfida tecnica per l'utilizzo della tecnica di dissezione, con l'utente che viene richiesto di padroneggiare sia l'uso preciso della colla chirurgica che la microdissezione senza danneggiare il cordone nervoso o i muscoli. Inoltre, a causa del livello di difficoltà della dissezione, dovrebbero essere utilizzati solo adulti graviditi, che potrebbero limitare i punti temporali sperimentali. Inoltre, la tecnica di dissezione è anche molto più difficile da eseguire sui mutanti che producono animali piccoli, sottili o malatici, ancora una volta limitando i parametri sperimentali. Il vantaggio di questa tecnica è che limita l'artefatto del movimento del corpo derivante dalla depolarizzazione, incollaggio impedisce il movimento in eccesso del corpo del verme, e fornisce anche l'accesso al NMJ per i cambiamenti di soluzione e applicazioni farmacologiche. Inoltre, ogni preparazione espone la stessa area del verme, che garantisce i muscoli della parete del corpo saranno costantemente a fuoco. La seconda tecnica, usando le nanosfere per immobilizzare i vermi, è meno complessa e può essere appresa rapidamente. Inoltre, qualsiasi animale di età può essere utilizzato con questo metodo, consentendo di monitorare i cambiamenti nella manipolazione del calcio attraverso lo sviluppo. La cura deve essere presa quando si posizionano i vermi nella soluzione nanofara, in quanto una manipolazione eccessiva degli animali può causarne l'esplosione. Inoltre, il coperchio non deve essere spostato una volta posizionato sopra gli animali, in quanto ciò può causare gli animali a rotolare o torsione su se stessi, ancora una volta portando al danno. Anche se l'utilizzo delle nanosfere può fornire un test ad alto throughput in cui gli animali potrebbero potenzialmente essere recuperati, non c'è standardizzazione della posizione del corpo dell'animale, quindi ogni animale potrebbe non avere muscoli della parete del corpo in un piano chiaro focale. Se l'esperimento richiede un gran numero di animali, possono essere necessari diversi metodi di immobilizzazione, come i micro-pozzi a base di agar, che consentono l'imaging della fluorescenza di calcio sfuso28. Indipendentemente dalle limitazioni di queste due tecniche, entrambi possono essere utilizzati per ottenere transitori di calcio affidabili e facilmente quantificabili all'interno dei muscoli della parete corporea di C. elegans.
C. elegans offre molti vantaggi come sistema in vivo per gli studi di imaging funzionale. Gli animali sono trasparenti, permettendo l'accoppiamento della depolarizzazione neuronale optogenetica attraverso l'uso di channelrhodopsin con il GECI RCaMP per misurare i transitori di calcio post-sinaptico risultanti nel muscolo. I livelli di pre-stimolazione della fluorescenza RCaMP possono essere utilizzati anche per valutare i livelli di calcio citosolico al basale. La trattabilità genetica di C. elegans rende lo studio di nuove mutazioni che possono influenzare l'omeostasi del calcio o la manipolazione facile da perseguire, spesso con alleli mutanti prontamente disponibili. Utilizzando le tecniche descritte in questo protocollo, i dati post-imaging del calcio possono essere ottenuti in modo efficiente e a costi relativamente bassi, rendendolo un sistema interessante per una vasta gamma di esperimenti di imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Alexander Gottschalk per la SX1659, la RCaMP e la channelrhodopsin contenente ceppo di verme, dr. Hongkyun Kim per il ceppo di vermi slo-1(eg142) e il National Bioresource Project per il ceppo di vermi sca-1(tm5339).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
