Summary
Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .
Abstract
Pez cebra (Danio rerio) son un poderoso modelo para estudiar el desarrollo de linfocitos. Como mamíferos, D. rerio poseen un sistema inmune adaptativo que incluye linfocitos B y T. Estudios de linfopoyesis de pez cebra son difíciles porque anticuerpos reconociendo D. rerio marcadores de superficie celular generalmente no están disponibles, que complica el aislamiento y caracterización de poblaciones de diferentes linfocitos, incluyendo B-linaje células. Líneas transgénicas con expresión fluoróforo específico de linaje se utilizan a menudo para eludir este desafío. La línea transgénica lck:eGFP se ha utilizado para estudiar el desarrollo de las células T D. rerio y se ha utilizado también para el desarrollo del modelo de la célula de T y leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Aunque lck:eGFP peces se han utilizado ampliamente para analizar el linaje T, no ha utilizado para estudiar las células de B. Recientemente, hemos descubierto que muchas células de pez cebra B también expresan lck, aunque a niveles más bajos. Por lo tanto, las células lck:eGFP B además expresan bajos niveles de GFP. Basado en este hallazgo, hemos desarrollado un protocolo para purificar células B linaje de peces cebra lck:eGFP , que se presenta aquí. Nuestro método describe cómo utilizar un clasificador célula fluorescente activada (FACS) para purificar las células de B de pescado lck:eGFP o líneas relacionadas, tales como doble transgénico rag2:hMYC; Lck:EGFP de pescado. En estas líneas, las células B, células B particularmente inmaduras, GFP expreso en niveles bajos pero detectables, lo que les permite distinguirse de las células T que expresan GFP altamente. B células pueden ser aisladas de médula ósea, timo, bazo, sangre u otros tejidos. Este protocolo proporciona un nuevo método para purificar células B D. rerio , permitiendo estudios enfocados en temas como el desarrollo de las células B y linfocitos B malignos.
Introduction
Pez cebra ofrecen poderosos atributos, como manipulability genético, alta fecundidad, transparencia óptica y desarrollo rápido que facilitan el estudio del desarrollo de vertebrados utilizando enfoques genéticos. Estas ventajas, junto con las características compartidas de teleósteos y mamífera hematopoyesis, hacen D. rerio ideal para análisis in vivo de la linfopoyesis y linfocito función, desde su más temprana aparición en larvas a lo largo de la edad adulta. Desarrollo de sangre en el pez cebra depende de procesos genéticos bien conservados que se comparten con los mamíferos, y estos se extienden al sistema inmune adaptante. Además, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo linfoide se conservan notable entre el pez cebra y mamíferos1.
En las últimas 2 décadas, transgénicos D. rerio líneas linajes de sangre específicos de etiqueta y las líneas mutantes deficientes en estos linajes se han creado2,3,4,5. Uno de ellos, la línea transgénica lck:eGFP , utiliza el promotor de pez cebra linfocitos proteína tirosina quinasa (lck) para unidad de expresión de GFP6. Este gen, que es altamente expresada por precursores de linaje T y los linfocitos T maduros, permite seguimiento de desarrollo de la célula de T tímico y ex vivo de purificación de las células de linaje T por FACS7en vivo. Anteriormente, utilizamos esta línea en una pantalla de mutagénesis ENU avance genético para identificar a mutantes del germline propensos a todo T y para estudiar fenómenos genéticos adquiridos somáticamente vinculados a la célula de T oncogénesis8,9.
Recientemente, nuestro laboratorio extendido más la utilidad del pez cebra lck:eGFP . En doble transgénico rag2:hMYC (MYC humano), lck:eGFP D. rerio que son conocidos por desarrollar todo T 10, descubrimos que B linaje también ocurren11. A diferencia de la T-ALL en este modelo, que es fluorescente brillante debido a la alta expresión de GFP, B-todos son débilmente fluorescente debido a niveles bajos de la GFP, que pescado con B-todo distinguirse groseramente de los T-todo por microscopia fluorescente. Esta expresión de GFP diferencial también permite la separación de GFPlo -todas las células desde GFPHola células T-todos usando FACS11. Por otra parte, expresión de lck de baja no es exclusiva de pez cebra B-ALL, como humanos-todas también expresan bajos niveles de LCK11,12. Asimismo, células normales B-linaje de D. rerio, ratones y seres humanos también expresan niveles bajos de lck/Lck/LCK, células B inmaduras con la más alta expresión11,13. Sobre una base por celular, las células de linaje B en líneas de pez cebra o derivado de lckeGFP expresan 1-10% tanto GFP como los linfocitos T. Estos GFPlo expresa característica mRNAs de la célula de B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzy otros de las células y puede ser purificado de la médula ósea, timo, bazo o periférico la sangre11. Por lo tanto, ambos linaje B y T las células pueden ser aisladas de pez cebra lckeGFP y en caso de rag2hMYC, lckeGFP animales, células B y T todos así11.
Aquí, presentamos nuestro protocolo eficiente FACS purificar células no malignas B de pez cebra lck:eGFP y las células de B no malignos o malignas de rag2hMYC; Lck:EGFP peces, con varios tejidos de origen. Tales células pueden cuantificarse por el flujo cytometry sin aislamiento de FACS, además si lo desea. Descubrimiento de la expresión de lck de baja- y en consecuencia, la baja expresión de GFP-b células abre nuevas puertas de posibilidades experimentales del pez cebra lckeGFP , como vivo en B estudios del desarrollo de la célula. Así, esta línea transgénica, primero divulgada en 2004, tiene nueva vida al intentar utilizarlo para obtener ideas frescas sobre inmunidad adaptativa de pez cebra.
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Protocol
Todos los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el Universidad de Oklahoma Health Sciences Center.
1. aislar no malo B y los linfocitos T de transgénicos lck:eGFP pescado
- Anestesiar los peces Metanosulfonato de 0.02% (MS-222) en el agua del sistema de pescado.
- Examinar el pescado de 2 a 6 meses para thymi fluorescente, que se encuentran en el aspecto dorsomedial de la cavidad branquial del pez cebra y otros teleósteos14. Usar un microscopio de epifluorescencia (470/40 longitud de onda de excitación y emisión de 525/50 filtro) para detectar la GFP.
- Prepara con antelación 50 mL de 1 filtro esterilizado x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) que contiene 1% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina (clasificación media). Sin utilizar medios de clasificación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por 2 meses.
- Eutanasia a los peces colocando en un vaso de precipitados que contiene 0.2% Metanosulfonato de aproximadamente 5 minutos, seguido por la inmersión del baño de hielo. Confirman muerte por el cese del movimiento opercular (gill).
- Coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y diseccionar órganos linfoides de interés, utilizando el microscopio de fluorescencia para disecar la GFP+ thymi14y ajustes de microscopía de campo brillante disección del riñón médula y bazo15. Resultados aquí presentados fueron obtenidos usando 3 meses pescado. Proporciones de linfocitos y números absolutos varían por edad y genotipo (véase discusión para más detalles).
- Colocar cada órgano disecado en un tubo de 1,5 mL conteniendo 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación.
- Homogeneizar el tejido sobre el hielo usando un homogeneizador de micro tubo de mortero.
- Pasar el tejido homogeneizado a través de un filtro de malla de 35 μm para generar una suspensión unicelular. Mantener las células en hielo hasta su análisis.
2. aislamiento de linfocitos malignos de doble transgénico rag2:hMYC; lck:eGFP pez cebra
-
Microscópico a partir en 2-4 meses, pantalla rag2:hMYC; Lck:EGFP pescado de patrones anormales de la GFP.
Nota: las células de B son GFPlo en el fondo de lck:eGFP , B-todo requiere práctica de reconocer; T-todo es obvio, porque las células T son GFPHola. En consecuencia, el rag2:hMYC, lck:eGFP línea doble transgénico tiene dos fenotipos: brillantemente fluorescentes T-ALL, que generalmente se derivan del timo y extender en el cuerpo y débilmente fluorescente-todas.- Usando un microscopio de fluorescencia, los peces utilizando la configuración de "baja exposición" (200 ms, ganancia de 2,4 x) identificar brillante T-ALL (figura 1A) y "exposición" de la pantalla (1,5 s, 3,4 x ganancia) para identificar dim-todas (figura 1A). Controles de peso y pescado pre leucémico tiene GFP localizada únicamente en el timo (figura 1B).
- Anestesiar y examinar el pescado tal como se describe en los pasos 1.1 – 1.2.
- Categorizar los peces basados en la medida de la fluorescencia de GFP, usando un simple sistema de tres Categoría:
Nota: Nivel 1: Fluorescencia aparece como un tumor tímico con sólo limitada propagación local.
Nivel 2: Fluorescencia aparece más allá del timo, que < 50% del cuerpo.
Nivel 3: Fluorescencia se extiende más allá del 50% del cuerpo. - Separe el pescado con todos de los que no tienen cáncer. Monitor pre leucémico peces (es decir, sin tumores GFP+ ) una vez cada mes para el desarrollo de nuevo todo. ~ 9 meses, todos rag2:hMYC, lck:eGFP peces desarrollan T-ALL, B-ALL, o ambos.
- Para el aislamiento de la célula T o B todos, seleccione nivel 3 peces (todo con > 50% del cuerpo), que producen más de 2 x 106 todas las células y por lo general muchos más.
- Eutanasia a los peces como en el paso 1.4.
Nota: Existen dos métodos para obtener todas las células: cuerpo entero de homogeneización y una lavado peritoneal técnica16. Los métodos difieren en el número absoluto de células recogidas para la clasificación, y así, las cantidades de FACS tiempo necesario y coste (véase discusión para más detalles). - Para cualquiera de los métodos, primero coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y utilizando una hoja de afeitar, retirar la cabeza incluyendo la región tímica. Esto puede ser procesado por separado, si lo desea, o tinción histológica.
-
Método de lavado peritoneal
- Con una pipeta P1000, lavar la cavidad peritoneal de pescado con 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación, recoger las células y los medios de comunicación en un tubo de 5 mL.
- Utilizando una nueva pipeta, inyectar un adicional 200 – 300 μL de medios clasificación frío en la cavidad del cuerpo. Entonces, utilizando la punta de la pipeta, aplique presión suave sobre el cuerpo de los pescados para extruir las células fuera de la cavidad del cuerpo. Recoger este medio y añadir al tubo de 5 mL.
- Repita el paso 2.8.2 2 – 3 veces. Mantener las células recogidas en la clasificación de los medios de comunicación en el hielo.
- Filtrar la suspensión de células aunque una malla de 35 μm filtro antes de citometría de flujo/FACS y mantener las células en hielo hasta su análisis.
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Homogeneización de todo el cuerpo
- Después de quitar la cabeza de pescado, coloque el cuerpo en un tubo de 1,5 mL que contiene 200 μL de la clasificación de los medios de comunicación.
- Homogeneizar el cuerpo, utilizando un homogeneizador de micro tubo de mortero.
- Agregar un adicional de 300 μL de fría clasificación de los medios de comunicación. Filtrar la suspensión de células, aunque un filtro de malla de 35 μm. Agregue media clasificación para lavar todas las células a través del filtro, hasta que quede sólo restos de tejido en el filtro. Mantener las células en hielo hasta su análisis.
3. cytometric del análisis de los linfocitos B normales o malignas
- Definirse el análisis cytometric del flujo y parámetros de FACS según manual del fabricante.
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Adquirir el número deseado de eventos inicialmente caracterizar la muestra. Analizar 1 x 104 5 x 104 eventos antes de la clasificación para determinar puertas específicas para pasos posteriores de clasificación.
- Determinar puertas: definir puertas célula linfocito y progenitoras utilizando forward scatter (FSC) y parámetros de scatter (SSC) de lado, excepto los detritos celulares (figura 2A-C)17. FSC y SSC corresponden al diámetro de la célula y granularidad, respectivamente.
Nota: GFP–, GFPloy GFPHola las células difieren doble 10 a 100 en cuanto a su intensidad de fluorescencia de GFP, haciendo separación de estas poblaciones sencillas (figuras 2-5). Muertos viven discriminación puede ser evaluada en este punto con yodo de propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) tinción de viabilidad. Experimentos anteriores con PI demuestran típicamente > 95% de viabilidad de células GFP+ después de FACS. - Excluir los dobletes de la célula, según los parámetros de la máquina de FACS se utiliza.
- Dentro de las puertas linfoides o precursor, determinar el número y porcentaje de células GFP+ .
- Determinar puertas: definir puertas célula linfocito y progenitoras utilizando forward scatter (FSC) y parámetros de scatter (SSC) de lado, excepto los detritos celulares (figura 2A-C)17. FSC y SSC corresponden al diámetro de la célula y granularidad, respectivamente.
- Uso ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir puerta para GFP– vs GFPlo vs células GFPHola .
Nota: Células B presentan fluorescencia de GFP dim y las células T muestran brillante GFP en líneas lck:eGFP . Muchos órganos linfoides o muestras tumorales contienen ambas poblaciones de GFP+ . B linaje células, B-todo son GFPlo y células de linaje T, T-todo son GFPHola. Definir puertas distinguir entre GFP–, GFPloy GFPHola las células y recoger por separado las poblaciones(Figura 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A y figura 5A). - Ordenar cada población celular en tubos de polipropileno de diferentes 15 mL que contiene 2 mL de la clasificación de los medios de comunicación, o directamente en tubos de 1,5 mL diferentes con un tampón adecuado para análisis adicionales (por ejemplo, ARN, ADN o extracción de proteínas, allo-trasplante, etcetera).
- Mantener las células purificadas en hielo antes de mayores análisis.
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Representative Results
Hemos utilizado la citometría de flujo para analizar y FACS para aislar GFPlo y GFPHola células de timo, médula ósea riñón y bazo de pez cebra transgénico lck:eGFP . El análisis de peces 3 meses reveló que el timo contiene principalmente linfocitos GFP+ . Las células GFP+ fueron confinadas en gran parte a la puerta linfoide descrita por Traver et al17. Dos poblaciones distintas de la GFP+ , GFPloy GFPHola, sepuede observar en el timo. Hola linfocitos GFP representan un porcentaje mayor, ~ 60%, mientras que células GFPlo eran menos abundantes, que representan ~ 40% de total linfocitos tímicos (tabla 1). A diferencia de los mamíferos, peces médula hematopoyética se localiza en el riñón, en lugar de dentro del hueso. Determinamos las células de B que residen en riñón médula también expresan bajos niveles de GFP (figura 2B y 3B de la figura). GFPlo células en médula ósea eran abundantes, mientras que GFPHola células eran escasas (figura 2B y figura 3B)), indicando que sólo un pequeño porcentaje de linfocitos T estaban presentes en la médula ósea a los 3 meses de edad. Muestras de bazo demostraron además un mayor porcentaje de GFPlo que GFPHola las células (figura 2 y figura 3). También analizamos los linfocitos no maligna de timo, médula ósea y bazo de pez cebra transgénico doble lck:eGFP; rag2:hMYC , que son propensos a ambos B y T todos con11. En los peces que aún no se habían desarrollado todo, resultados de bazo, timo y médula ósea fueron similares a peces transgénicos solo lck:eGFP . Sin embargo, el número de linfocitos por órgano fue aumentado (figura 3), probablemente debido a la expansión basada en MYC de poblaciones de células B y T inmaduras donde está activo el promotor rag2 .
También se analizaron peces transgénicos doble con B o T-todo lo que había desarrollado cánceres fluorescentes por 6 meses. Como era de esperarse, pescado todas con cánceres débilmente fluorescente contuvo sobre todo GFPlo las células (Figura 4A). Por el contrario, peces fluorescentes brillantes pueden albergar cualquiera aislado T-ALL o mezclado a poblaciones de GFPlo B-todos y GFPHola células T-ALL (figura 5). Un ejemplo de mezcla todos, que contiene todo distinto de B y T, se muestra a continuación (figura 5). Para confirmar las identidades de GFPlo yhi células GFP como B-T-linaje y, respectivamente, se analizaron las transcripciones de B y T-célula-específica por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Nuestros resultados muestran GFPlo células expresan niveles más altos de las transcripciones de la célula de B y GFPHola células expresan niveles más altos de los genes de la célula de T (Figura 2D, figura3D, figura4B y figura 5B). Además, expresión de lck y GFP en GFPlo todos corresponden a la fluorescencia de GFP dim en vivo de B-ALL (Figura 2D, figura3D, figura4B y figura5B; qRT-PCR condiciones y cebadores secuencias descritas por Borga et al.) 11.
Figura 1: Patrones de fluorescencia distinta en peces transgénicos lck:eGFP . Imágenes de microscopía fluorescente (A) de peces rag2:hMYC; lck:eGFP con T-ALL (izquierda) o débilmente fluorescente fluorescente brillantemente todos B (derecha). T-todo es visible con los ajustes de exposición baja; B-todo puede verse sólo con alta exposición. (B) ajustes de exposición muestran débil fluorescencia tímica (círculos amarillos) tipo lck:eGFP (izquierda) y rag2:hMYC; lck:eGFP peces transgénicos doble sin todos (derecha). Barras de escala = 20 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Poblaciones linfocitarias en el pez cebra lck:eGFP . Imágenes en la parte superior muestran un 3 meses peso, pescado lck:eGFP con ajustes de alta exposición o mejora de equipo (para facilitar la visualización). Barras de escala = 20 mm. Análisis de citometría de flujo de timo (A), la médula ósea (B) y el bazo (C). Paneles de la izquierda muestran FSC (eje x) y SSC (eje y), con óvalos negros indicando puertas de linfocitos. Paneles mediados representan basada en fluorescencia que bloquean con GFP (eje x) y PE (eje y). GFPHola (rectángulo azul), GFPlo (rectángulo verde) y poblaciones de GFP– (óvalos negros) se muestran. Paneles de la derecha Mostrar histogramas de GFPHola ylo células GFP. Las líneas punteadas indican criterios bloquea en los paneles de mediados. (D) peso lck:eGFP thymi ordenado para GFPHola (azul) y GFPbajo (verde). Expresión del gen de la célula de B (pax5), los genes específicos de células T (cd4))lck y GFP. Resultados se normalizan a los genes housekeeping (β-actina y eef1a1l1) y se muestra como doblar-cambio ± Error estándar (S.E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Poblaciones linfocitarias en el pez cebra pre leucémico rag2:hMYC; lck:eGFP . Imágenes en la parte superior muestran un 3-mes - pescadoviejo rag2:hMYC; lck:eGFP con exposiciones altas y mejorado por computadora. Barra de escala = 20 mm. paneles partes A-d se representan en formato idéntico a la figura 2. (D) expresión de GFP en FACS purificada, pax5, cd4y lck tímico GFPbajo (verde) GFPHola (azul) poblaciones celulares de peces lck:eGFP . se muestran los resultados de qRT-PCR como doblez-cambio ± S.E. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de peces transgénicos rag2:hMYC; lck:eGFP de B-ALL. (A) superior: pescado 6 meses rag2:hMYC, lck:eGFP con todas con ajuste de alta exposición. Análisis de citometría de flujo de células tumorales aisladas del cuerpo de los pescados son formato idéntico a la figura 2. (B) expresión de Gene de GFP todaslo células (puerta verde en la Figura 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP GFPHola timocitos (puerta azul en la Figura 3A) y T-ALL GFPHola células (puerta azul en figura 5A ). Expresión de B (pax5, cd79a) y los genes específicos de células T (cd4), lcky GFP. Resultados se normalizan a los genes housekeeping (β-actina y eef1a1l1) y se muestra como doblar-cambio ± S.E. escala bar = 20 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de mezclan todo rag2:hMYC; lck:eGFP peces transgénicos. (A) superior: 6 meses rag2:hMYC; lck:eGFP los peces con todo mezclado con ajuste de alta exposición. Análisis de citometría de flujo de células tumorales aisladas del cuerpo de los pescados son formato idéntico a la figura 2. (B) GFPHola (azul) y puertasbajo (verde) FACS GFP. Expresión de B (pax5, cd79a) y los genes específicos de células T (cd4), lcky GFP. Resultados se normalizan a los genes housekeeping (β-actina y eef1a1l1) y se muestra como doblar-cambio ± S.E. escala bar = 20 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desarrollamos y proporcionar un protocolo para aislar las células de B de pez cebra transgénico lck:eGFP , añadir esto a otros modelos de D. rerio con linaje B etiquetas3,4. Sorprendentemente, la identificación de GFPlo B células en esta línea pasó desapercibida desde su descripción en el año 2004. Generalmente, lck es considerada específica de la célula de T6, pero estudios recientes encontraron expresión inesperada lck por natural killer y mieloide de las células, así como en las células B como se muestra aquí18,19. De acuerdo con el descubrimiento que pez cebra B células GFPlopre-B, ingenuo y maduran B células en los seres humanos también expresan niveles bajos de LCK11,13.
Debido a los diferentes niveles GFP en células B y T de estos peces, las células de ambos linajes ahora puede aisladas de esta línea. Aunque estos animales se han utilizado clásicamente para el estudio de seguimiento y desarrollo de linfocitos T tímico, demostramos que estudios similares también son posibles con las células de B. Para ello, identificamos las células de B en el bazo, timo y médula renal aquí y en sangre periférica y en otros lugares en el trabajo previo de11.
Reconocimiento B-todo en rag2:hMYC; Lck:EGFP pescado requiere un buen ojo, pero con la práctica, es sencillo. A continuación, elegir qué método debe utilizar para purificar todas las células es fundamental. Aquí, presentamos dos métodos: lavado peritoneal y la homogeneización de todo el cuerpo. Lavado peritoneal produce un mucho menor número de células totales, pero un porcentaje muy alto de células GFP+ . En consecuencia, poco tiempo de FACS es requerido, minimizando el costo. Para aplicaciones posteriores, donde el rendimiento total es menos importante (por ejemplo, qRT-PCR), es más eficiente. Por otra parte, homogeneización de todo el cuerpo resulta en mayores suspensiones unicelular que contiene muchas más células, pero un porcentaje menor de las células será GFP+. Por lo tanto, más tiempo de FACS es necesaria para recoger el mismo número de células GFP+ con lavado peritoneal, pero millones más de células pueden ser purificadas. Para estudios posteriores, donde el alto rendimiento es importante (por ejemplo, Western blot), esto puede compensar el costo añadido. Además, todos los estudios, homogeneización de cuerpo total captura la diversidad de las células cancerosas presentes, más exactamente que representa la heterogeneidad del tumor. Aunque no aparece en nuestro protocolo, también es factible para disecar sólo GFP+ regiones/órganos del cuerpo del pescado con todos para homogeneización por picar en una placa Petri, disminuyendo total FACS tiempo y costo, similar al lavado peritoneal.
Tímica expresión de GFP en peces lck:eGFP demostró que la GFP es detectable tan temprano como 5 PD6. Aquí nuestros estudios fueron realizados en peces adultos 3 meses de edad o más y muestran que a esta edad, las células de B son abundantes en riñón médula y bazo, pero las células T son raras. Estudios posteriores con peces de diferentes edades será necesarios determinar si las células T son más frecuentes en diferentes puntos temporales. Asimismo, a los 3 meses, se enriquecen las células T en el timo, pero también existen un número considerable de linfocitos tímicos. Si estas poblaciones linfocitarias varían en diferentes edades es actualmente desconocido, pero general, tímica fluorescencia se desvanece en peces lck:eGFP comienza en la madurez sexual (aproximadamente 3 meses), por lo que es probable que un número de células T disminuye con el aumento de la edad, y las células de B pueden Además. Asimismo, cuandolo B células GFP colonizan el timo del pez cebra se desconoce. Utilizando peces lck:eGFP , ahora es posible monitorizar el desarrollo tímico de células B y T, afluencia, emanación y la cinética específica de estos eventos. Además, estas cuestiones también son pertinentes para otros sitios anatómicos donde residen las células B, como la médula del riñón, bazo, sangre y el intestino (datos no mostrados).
Además de estudios del desarrollo de la célula de B, encontramos recientemente-todas en lck:eGFP; RAG2:hMYC peces transgénicos doble11. Transgénico rag2:hMYC era conocido para inducir T-todo10 pero -todas habían sido reconocidos. Debido a la alta penetrancia de este oncogén, ambos tipos de todo son frecuentes en estos peces, y muchos peces realmente desarrollan ambos simultáneamente todos los tipos de11. TODAS son GFPlo, mientras que T-ALL GFPHola, variando de expresión de GFP permite estas dos entidades a ser aislado por FACS, incluso al ocurrir en el mismo animal (figura 5A). Fundamentalmente, en los linfocitos normales y malignos, qRT-PCRresults demostrar que GFPlo y GFPHola células constantemente corresponden a los linajes B y T, respectivamente (figura 2 y figura 3).
El potencial económico de los peces lck:eGFP fue fundamental para este trabajo, destacando el hecho de que muchas líneas transgénicas preexistentes probablemente tienen utilidad más allá de su propósito previsto. Aquí, presentamos un nuevo protocolo para aislar las células B y T de D. rerio con transgénicos lck:eGFP, abriendo la puerta a nuevas vías de investigación sobre los linfocitos B normales y malignos. Los resultados de dichos estudios serán, sin duda, revitalizar lo que ya ha sido un valioso recurso para los campos de Biología del cáncer, hematopoyesis y linfopoyesis.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Megan Malone-Perez para el cuidado del pez cebra y la base de cytometry del flujo OUHSC. Este trabajo fue financiado por becas del Hyundai Hope sobre ruedas, el centro de Oklahoma para el avance de la ciencia y la tecnología (HRP-067), un premio de proyecto piloto de INBRE NIH/NIGMS (P20 GM103447). JKF sostiene el E.L. & Thelma Gaylord Cátedra en hemato-oncología pediátrica de la Fundación del Hospital de los niños.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
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