Summary
Poisson zèbre transgéniques lck:eGFP express GFP fortement dans les lymphocytes T et ont été utilisés pour étudier le développement des lymphocytes T et la leucémie aiguë lymphoblastique. Cette ligne permet aux cellules d’étude B, qui expriment lck aux niveaux inférieurs. Ce protocole décrit la purification de cellules de B malignes et bénignes du poisson-zèbre de lck:eGFP .
Abstract
Poisson zèbre (Danio rerio) sont un puissant modèle pour étudier le développement des lymphocytes. Comme les mammifères, d. rerio possèdent un système immunitaire adaptatif qui inclut des lymphocytes B et T. Études de poisson-zèbre lymphopoïèse sont difficiles parce que les anticorps reconnaissant d. rerio marqueurs de surface cellulaire ne sont généralement pas disponibles, ce qui complique l’isolement et la caractérisation de populations de lymphocytes différents, y compris la lignée B cellules. Des lignées transgéniques avec expression fluorophore lignée spécifiques sont souvent utilisées pour contourner ce problème. La ligne transgéniques lck:eGFP a été utilisée pour étudier le développement des lymphocytes T d. rerio et a également été utilisée pour le développement des lymphocytes T modèle et de la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-T). Bien que les poissons de lck:eGFP ont été largement utilisées pour analyser la lignée T, ils n'ont pas servi à étudier des cellules B. Récemment, nous avons découvert que beaucoup de poisson-zèbre B cellules exprime également lck, quoiqu’à des niveaux inférieurs. En conséquence, les cellules de lck:eGFP B expriment même faibles niveaux de GFP. Fondé sur cette conclusion, nous avons développé un protocole pour purifier les cellules de la lignée B de lck:eGFP poisson-zèbre, dont nous présentons ici. Notre méthode explique comment utiliser un trieur de cellules fluorescentes-activé (FACS) pour purifier les cellules de B de lck:eGFP poisson ou les lignes associées, telles que double-transgéniques rag2:hMYC; LCK:eGFP poissons. Dans ces lignes, cellules B, cellules de B particulièrement immatures, GFP expresse aux niveaux bas mais détectable, leur permettant d’être distingué de lymphocytes T, qui expriment la GFP hautement. B cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse, thymus, rate, sang ou d’autres tissus. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour purifier les cellules B d. rerio , permettant des études axées sur des sujets comme le développement des lymphocytes B et lymphocytes B malignes.
Introduction
Poisson zèbre offrent des attributs puissants, tels que la manipulation génétique, forte fécondité, translucidité optique et un développement rapide qui facilitent l’étude du développement des vertébrés en utilisant des approches génétiques. Ces avantages, ainsi que les caractéristiques partagées de l’hématopoïèse téléostéens et chez les mammifères, font d. rerio idéal pour l’analyse in vivo de la lymphopoïèse et lymphocyte function, depuis leur première apparition chez les larves tout au long de l’âge adulte. Développement de sang chez le poisson zèbre s’appuie sur des processus génétiques bien conservées qui sont partagés avec les mammifères, et ceux-ci portent le système immunitaire adaptatif. En outre, les mécanismes moléculaires qui régissent le développement lymphoïde sont remarquablement conservées entre les mammifères et poissons zèbres1.
Depuis 2 décennies, transgénique d. rerio lignes cette étiquette spécifique sang lignages et lignées mutantes déficientes dans ces lignées ont été créées par2,3,4,5. L’une d'entre elles, la lignée transgénique lck:eGFP , utilise le promoteur zebrafish lymphocytaire protéine tyrosine kinase (lck) pour piloter la GFP expression6. Ce gène, qui est fortement exprimé par les précurseurs de la lignée T et les lymphocytes T matures, permet in vivo par FACS7de suivi du développement des lymphocytes de T thymiques et ex vivo purification de cellules de la lignée T. Auparavant, nous avons utilisé cette ligne dans un écran de mutagenèse ENU avance-génétique pour identifier des mutants de lignée germinale sujettes à T-ALL et d’étudier les phénomènes génétiques somatiquement acquis liés à lymphocytes T oncogenèse8,9.
Récemment, notre laboratoire a prorogé l’utilité du poisson-zèbre de lck:eGFP . Double-transgéniques rag2:hMYC (MYC humain), lck:eGFP D. rerio qui sont connus pour développer lla- 10, nous avons découvert que lignée B se produisent également11. Contrairement au T-ALL dans ce modèle, qui réagissent en couleurs vives en raison de la forte expression de la GFP, B-ALL sont faiblement fluorescentes en raison de faibles niveaux GFP, permettant aux poissons avec B-ALL à distinguer nettement de celles avec T-ALL par microscopie à fluorescence. Cette expression différentielle de la GFP permet aussi la séparation des celluleslo B-ALL GFP de GFPSalut FACS11des cellules T-ALL. En outre, faible lck expression n’est pas unique à poisson zèbre B-ALL, comme humains B-tout aussi express faibles niveaux de LCK11,12. De même, les cellules normales de lignée B de d. rerio, les souris et les humains expriment aussi des faibles niveaux de lck/Lck/LCK, avec des cellules B immatures ayant la plus haute expression11,13. Sur une base par cellule, cellules de la lignée B en lignes de poisson-zèbre ou un dérivé lckeGFP expriment 1-10 % autant GFP comme les lymphocytes T. Ces GFPlo cellules express caractéristique ARNm de lymphocytes B tels que pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzet autres et peut être purifié de la moelle osseuse, thymus, la rate ou périphérique 11de sang. Donc, les deux B-T-lignée et cellules peuvent être isolées du poisson-zèbre de lckeGFP et dans le cas de rag2hMYC, les lckeGFP animaux, les cellules B et T-ALL ainsi11.
Ici, nous présentons notre protocole efficacement FACS-purifier non malignes cellules B de lck:eGFP poisson-zèbre et bénignes ou malignes des cellules de B de rag2hMYC; LCK:eGFP poissons, à l’aide de divers tissus de source. Ces cellules peuvent même être quantifiées par cytométrie en flux sans isolement de FACS, si vous le souhaitez. Découverte d’expression faible lck - et par conséquent, faible expression de la GFP-par B cellules ouvre de nouvelles portes de possibilités expérimentales de lckeGFP poisson-zèbre, tels que les études sur le développement de cellules in vivo B. Ainsi, cette lignée transgénique, pour la première fois en 2004, a nouvelle vie alors que nous cherchons à utiliser pour glaner des nouvelles perspectives relatives à l’immunité adaptative de poisson-zèbre.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant le poisson-zèbre ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isoler Non-malignes B et les Lymphocytes T de transgéniques lck:eGFP poissons
- Anesthésier les poissons à l’aide de 0,02 % de tricaïne (MS-222) dans l’eau du système de poissons.
- Examiner les poissons de 2 à 6 mois pour thymi fluorescent, qui se trouvent dans l’aspect dorsomédian de la cavité branchiale de poissons zèbres et autres téléostéens14. Utiliser un microscope à épifluorescence (470/40 onde d’excitation et d’émission 525/50 filtre) pour détecter la GFP.
- Préparer à l’avance 50 mL de stérilisée par filtration 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) contenant 1 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine (tri médias). Médias tri inutilisés peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 mois.
- Euthanasier le poisson en le plaçant dans un bécher contenant 0,2 % Tricaïne pendant environ 5 min, suivie d’immersion de bain de glace. Confirmer la mort par la cessation du mouvement operculaire (gill).
- Placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et disséquer les organes lymphoïdes d’intérêt, en utilisant le microscope à fluorescence à disséquer la GFP+ thymi14et paramètres de microscopie de champ lumineux de disséquer la moelle osseuse et la rate de rein15. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide de 3 mois poissons. Proportion de lymphocytes et de chiffres absolus varient selon l’âge et le génotype (voir pour plus de détails).
- Placer chaque organe découpé dans un tube de 1,5 mL contenant 500 µL de froid tri médias.
- Homogénéiser le tissu sur la glace à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.
- Passez tissu homogénéisé à travers un filtre de maille de 35 µm pour générer une suspension monocellulaire. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.
2. isoler les Lymphocytes malignes de Double-transgéniques rag2:hMYC ; lck:eGFP poisson-zèbre
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Commençant à 2-4 mois, écran au microscope de rag2:hMYC; LCK:eGFP pêchez modèles anormaux de GFP.
Remarque : les cellules B sont GFPlo dans le fond de lck:eGFP , alors B-ALL nécessite pratique de reconnaître ; T-ALL est évidente, parce que les cellules T sont GFPSalut. En conséquence, l' rag2:hMYC, lck:eGFP ligne double-transgéniques a deux phénotypes : brillamment fluorescent T-ALL, qui habituellement proviennent du thymus et s’étendent dans le corps et faiblement fluorescentes B-ALL.- À l’aide d’un microscope à fluorescence, écran les poissons à l’aide des paramètres « faible exposition » (200 ms, 2,4 x gain) pour identifier les lumineux T-ALL (Figure 1 a) et « exposition élevée » (1,5 s, gain x 3,4) pour identifier dim B-ALL (Figure 1 a). Contrôles WT et poissons pré leucémique ont GFP localisée uniquement dans le thymus (Figure 1 b).
- Une anesthésie et d’examiner le poisson comme décrit aux points 1.1, 1.2.
- Classer le poisson basé sur la mesure de la fluorescence GFP, à l’aide d’un système simple de trois catégories :
Remarque : Niveau 1 : Fluorescence apparaît comme une tumeur thymique avec seulement limitée diffusion locale.
Niveau 2 : Fluorescence apparaît au-delà du thymus, impliquant < 50 % du corps.
Niveau 3 : Fluorescence dépasse 50 % du corps. - Séparez les poissons avec l’ensemble de ceux sans cancer. Surveiller des leucémiques poissons (c.-à-d. sans tumeurs GFP+ ) une fois tous les mois pour le développement de tout nouveau. Par ~ 9 mois, tous les rag2:hMYC, lck:eGFP poissons développent T-ALL, B-ALL, ou les deux.
- Pour tout T - ou B cellule d’isolement, sélectionnez niveau 3 poissons (tous impliquant > 50 % du corps), qui produisent plus de 2 x 106 toutes les cellules et généralement beaucoup plus.
- Euthanasier le poisson comme à l’étape 1.4.
Remarque : Il existe deux méthodes pour obtenir toutes les cellules : corps entier homogénéisation et un lavage péritonéal technique16. Les méthodes diffèrent dans le nombre absolu de cellules recueillies pour le tri, et ainsi, les montants des FACS fois requis et coût (voir pour plus de détails). - Pour chaque méthode, tout d’abord placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et à l’aide d’une lame de rasoir, retirez la tête y compris la région du thymus. Cela peut être traitée séparément, si vous le souhaitez, ou utilisés pour la coloration histologique.
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Méthode de lavage péritonéal
- À l’aide d’une pipette P1000, laver la cavité péritonéale de poisson avec 500 µL de froid tri médias, collecte des cellules et des médias dans un tube de 5 mL.
- Avec une pointe de nouvelle pipette, injecter un µL de 200-300 supplémentaires de médias tri froid dans la cavité du corps. Puis, à l’aide de l’embout de la pipette, appliquez une légère pression sur le corps de poisson pour extruder les cellules dans la cavité du corps. Recueillir ce média et ajouter dans le tube de 5 mL.
- Répétez l’étape 2.8.2 2 à 3 fois. Garder les cellules recueillies dans le tri des médias sur la glace.
- Filtrer la suspension cellulaire mais un maillage de 35 µm filtrer avant écoulement cytometry/FACS et garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.
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Homogénéisation de l’ensemble du corps
- Après avoir enlevé la tête de poisson, placer le corps dans un tube de 1,5 mL contenant 200 µL de tri médias.
- Homogénéiser le corps à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.
- Ajouter une supplémentaire 300 µL de froid tri médias. Filtrer la suspension cellulaire si un filtre de maille de 35 µm. Ajouter des éléments multimédias tri selon les besoins pour laver toutes les cellules à travers le filtre, jusqu'à ce que seulement les débris tissulaires reste sur le filtre. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.
3. par cytométrie en flux analyse des Lymphocytes B normaux ou maligne
- Définissez la cytométrie et/ou des FACS paramètres selon le guide du fabricant.
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Acquérir le nombre désiré d’événements pour caractériser au départ l’échantillon. Analyser 1 x 104 à 5 x 104 événements avant le tri à la détermination des portails spécifiques pour les étapes suivantes de tri.
- Déterminer les portes : définir des lymphocytes et l’ancêtre portes de cellule à l’aide de forward scatter (FSC) et les paramètres de diffusion (SSC) de côté, à l’exclusion des débris cellulaires (Figure 2 a- C)17. FSC et SSC correspondent à la taille/diamètre de la cellule et la granularité, respectivement.
Remarque : GFP–, GFPloet GFPSalut cellules diffèrent de 10 à 100-fois en fonction de leur intensité de fluorescence GFP, rendant la séparation de ces populations simples (Figures 2-5). Mort en direct-discrimination peut être évaluée à ce stade, à l’aide de propidium iode (PI) ou 7-aminoactinomycine D (7-Abdellah) viabilité coloration. Des expériences antérieures avec PI démontrent généralement > viabilité de 95 % des cellules GFP+ après FACS. - Exclure les doublets de la cellule, selon les paramètres de la machine de FACS utilisé.
- Intérieur des portes lymphoïdes ou précurseur, déterminer le nombre et le pourcentage de cellules GFP+ .
- Déterminer les portes : définir des lymphocytes et l’ancêtre portes de cellule à l’aide de forward scatter (FSC) et les paramètres de diffusion (SSC) de côté, à l’exclusion des débris cellulaires (Figure 2 a- C)17. FSC et SSC correspondent à la taille/diamètre de la cellule et la granularité, respectivement.
- Utiliser la phycoérythrine (PE) et l’intensité de la GFP, définir les porte pour GFP– vs GFPlo vsSalut cellules GFP.
Remarque : Cellules B pièce dim fluorescence GFP et cellules T montrent des GFP lumineux en lignes de lck:eGFP . Nombreux organes lymphoïdes ou des échantillons de tumeur contiennent les deux populations de GFP+ . Lignée B cellules/B-ALL sont GFPlo et T-lignée lla/T-cellules sont GFPSalut. Définir gates faire la distinction entre GFP–, GFPloethi cellules GFP et recueillir ces populations séparément (Figure 2 a-C, Figure 3 a-C, Figure 4 a et Figure 5 a). - Le tri de chaque population de cellules dans des tubes en polypropylène différents 15 mL contenant 2 mL de tri médias ou directement dans des tubes de différentes 1,5 mL contenant un tampon approprié pour des analyses plus poussées (p. ex., ARN, ADN ou extraction de protéine, allo-greffe, etc.).
- Garder les cellules purifiées sur la glace avant d’approfondir les analyses.
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Representative Results
Nous avons utilisé la cytométrie de flux pour analyser et FACS pour isoler la GFPlo et GFPSalut cellules du thymus, moelle des reins et la rate de lck:eGFP zebrafish transgénique. Analyse des poissons âgés de 3 mois a révélé que le thymus contenaient principalement des lymphocytes GFP+ . Cellules GFP+ étaient largement confinées à la porte lymphoïde précédemment décrite par Traver Al.17. Deux populations distinctes de GFP+ , GFPloet GFPSalut,peut être observée dans le thymus. Salut lymphocytes GFP représentaient un pourcentage plus élevé, environ 60 %, tandis que GFPlo cellules étaient moins abondantes, ce qui représente environ 40 % des lymphocytes totaux de thymiques (tableau 1). Contrairement aux mammifères, les poissons moelle hématopoïétique est localisée dans le rein, plutôt qu’au sein de l’os. Nous avons déterminé les cellules B résidant au rein moelle également exprimer faibles niveaux de GFP (Figure 2 b et 3 b de la Figure). GFPlo cellules dans la moelle osseuse étaient abondants, alors que les cellules GFPSalut étaient rares (Figure 2 b et 3 b Figure)), indiquant que seul un petit pourcentage de lymphocytes T étaient présents dans la moelle osseuse à l’âge de 3 mois. Spléniques échantillons a montré une plus grande proportion de GFPlo que GFPSalut les cellules (Figure 2 et Figure 3). Nous avons également analysé les lymphocytes non malignes du thymus, moelle osseuse et la rate de poisson-zèbre double-transgéniques lck:eGFP ; rag2:hMYC , qui sont sujettes à deux B - et T-ALL11. Chez les poissons qui ne le n'avait pas encore élaboré de tous, résultats de thymus, moelle osseuse et la rate étaient similaires aux poissons transgéniques single lck:eGFP . Toutefois, le nombre de lymphocytes par orgue était augmenté (Figure 3), probablement en raison de l’expansion axée sur le MYC immatures populations de lymphocytes B et T, où le promoteur rag2 est actif.
Nous avons aussi analysé les poissons double-transgéniques avec B ou T-tout ce qui avait développé des cancers fluorescents en 6 mois. Comme prévu, poisson B-tous atteints de cancers faiblement fluorescentes contenue principalement GFPlo cellules (Figure 4 a). En revanche, brillamment fluorescent poissons peuvent héberger soit isolé T-ALL ou mélangés à des populations de GFPlo B-ALL et GFPSalut cellules T-ALL (Figure 5). Un exemple de mélange tous, qui contient B et T-ALL distinct, est montré ici (Figure 5). Pour confirmer l’identité des GFPlo et cellules GFPSalut comme lignée B et T, respectivement, nous avons analysé les transcriptions de B et T-cellule-spécifiques par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Nos résultats montrent GFPlo cellules expriment des niveaux plus élevés de transcriptions de lymphocytes B et cellules GFPSalut expriment des niveaux plus élevés des gènes des cellules T (Figure 2D,3Dde la Figure, la Figure4 b et Figure 5 b). en outre, expression de lck et GFP dans GFPlo tous correspondent à la fluorescence GFP dim in vivo du B-ALL (Figure 2D,3Dde Figure, la Figure4 b et Figure5 b; qRT-PCR amorces et conditions de séquences précédemment décrites par Borga et al.) 11.
Figure 1 : Modèles de fluorescence distinctes dans lck:eGFP poissons transgéniques. (A) des images de microscopie fluorescente de poissons rag2:hMYC ; lck:eGFP avec brillamment fluorescent lla-T (à gauche) ou faiblement fluorescent B-ALL (à droite). T-ALL est visible avec les paramètres d’exposition faible ; B-tout ne peut être vu à l’aide de fortes expositions. Paramètres d’exposition élevée (B) afficher faible fluorescence thymique (cercles jaunes) à sauvage lck:eGFP poisson (à gauche) et rag2:hMYC ; lck:eGFP double-transgéniques sans tous (droit). Barreaux de l’échelle = 20 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les populations de lymphocytes chez le poisson zèbre lck:eGFP . En haut, les images montrent un 3 mois WT, lck:eGFP poissons avec les réglages d’exposition élevé ou ordinateur-mise en valeur (pour faciliter la visualisation). Barreaux de l’échelle = 20 mm. analyses des cytométrie en flux du thymus (A), moelle osseuse (B) et la rate (C). Panneaux de gauche montre FSC (axe x) et SSC (axe y), avec ovales noirs indiquant portes lymphocytaire. Panneaux moyenne dépeindre basés sur la fluorescence Gate avec GFP (axe x) et PE (axe y). GFPSalut (rectangle bleu), GFPlo (rectangle vert) et les populations de GFP– (noires ovales) sont indiquées. Panneaux de droite affiche les histogrammes de GFPhi etlo cellules GFP. Les lignes en pointillés indiquent gating critères panneaux moyenne. (D) WT lck:eGFP thymi trié pour GFPSalut (bleu) et GFPlo (vert). L’expression du gène de cellules de B (pax5), gènes spécifiques des cellules T (cd4))lck et GFP. Résultats sont normalisées à gènes domestiques (β-actine et eef1a1l1) et car le pli-changement ± écart-type (S.E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les populations de lymphocytes chez le poisson zèbre pré leucémique rag2:hMYC ; lck:eGFP . Les images en haut montrent une 3-mois -vieux rag2:hMYC ; lck:eGFP poissons avec des expositions élevées et informatique améliorée. Echelle = 20 mm. panneaux de pièces A-D est représentés sous une forme identique à la Figure 2. (D) Expression de pax5, cd4, lcket GFP dans purifiés par FACS thymique GFPlo (vert) GFPSalut (bleu) populations de cellules de poissons lck:eGFP . qRT-PCR résultats s’affichent comme pli-changement ± S.E. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse des B-ALL rag2:hMYC ; lck:eGFP poissons transgéniques. Haut (A) : 6-month-old rag2:hMYC ; lck:eGFP poissons avec B-tout en utilisant le réglage d’exposition élevé. Analyses de cytométrie de flux des flux des cellules tumorales isolées du corps du poisson sont au format identique à la Figure 2. (B) l’expression des gènes dans les celluleslo B-ALL GFP (portail vert Figure4 a), rag2:hMYC ; lck:eGFP GFPSalut thymocytes (porte bleue à la Figure 3 a) et cellulesSalut lla-GFP (porte bleue en Figure 5 a ). Expression de B (pax5, cd79a) et gènes spécifiques des cellules T (cd4), lcket GFP. Résultats sont normalisées à gènes domestiques (β-actine et eef1a1l1) et car le pli-changement ± S.E. échelle barre = 20 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse de mélangé tous les rag2:hMYC ; lck:eGFP poissons transgéniques. Haut (A) : 6 mois rag2:hMYC ; lck:eGFP poisson mélangé-tous à l’aide du réglage d’exposition élevé. Analyses de cytométrie de flux des flux des cellules tumorales isolées du corps du poisson sont au format identique à la Figure 2. (B), GFPSalut (bleu) et porteslo (vert) FACS GFP. Expression de B (pax5, cd79a) et gènes spécifiques des cellules T (cd4), lcket GFP. Résultats sont normalisées à gènes domestiques (β-actine et eef1a1l1) et car le pli-changement ± S.E. échelle barre = 20 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons mis au point et fournir un protocole visant à isoler les cellules de B de lck:eGFP zebrafish transgénique, ajoutant cela à d’autres modèles de d. rerio lignée B étiquettes3,4. Étonnamment, l’identification des GFPlo B cellules dans cette rangée est passé inaperçue depuis sa description en 2004. Généralement, lck est considéré comme spécifique à la cellule T6, mais des études récentes trouvent expression inattendue lck par tueuses naturelles et myéloïde cellules, aussi bien que dans les cellules de B comme indiqué ici18,19. En accord avec notre découverte que zebrafish B cellules GFPlo, pré-B, naïf et mature B cellules chez les êtres humains expriment aussi faibles niveaux de LCK11,13.
En raison des différents niveaux GFP dans les cellules B et T de ces poissons, les cellules de deux lignées peuvent maintenant être isolés de cette ligne. Bien que ces animaux ont été classiquement utilisés pour étudier le suivi et le développement des lymphocytes de T thymiques, nous démontrons que des études similaires sont également possibles avec les lymphocytes B. À cette fin, nous identifions les lymphocytes B dans le thymus, moelle des reins et la rate ici et dans le sang périphérique et d’ailleurs dans un travail préalable de11.
Reconnaissant B-tout en rag2:hMYC; LCK:eGFP poisson nécessite un sens aigu, mais avec la pratique, c’est simple. Ensuite, choisir quelle méthode utiliser pour purifier toutes les cellules est essentielle. Nous présentons ici deux méthodes : lavage péritonéal et homogénéisation de l’ensemble du corps. Lavage péritonéal donne un plus faible nombre de cellules totales, mais un pourcentage très élevé de cellules GFP+ . Par conséquent, peu de temps FACS est requis, en minimisant les coûts. Pour les applications en aval, où le rendement total est moins important (p. ex., qRT-PCR), c’est plus efficace. Par ailleurs, homogénéisation de l’ensemble du corps traduit par des suspensions de cellules unique plus grandes contenant beaucoup plus de cellules, mais un plus faible pourcentage de cellules sera GFP+. Ainsi, plus de temps FACS est tenu de percevoir le même nombre de cellules GFP+ comme avec lavage péritonéal, mais des millions plus de cellules peuvent être purifiés. Pour les études en aval, où le rendement élevé est important (par exemple, Western blot), cela peut compenser le surcoût. En outre, pour toutes les études, l’homogénéisation totale du corps capte la diversité des cellules cancéreuses présentes, plus représenter avec précision l’hétérogénéité tumorale. Bien que ne figurent ne pas dans notre protocole, il est également possible de disséquer seulement GFP+ régions/organes des poissons avec tous pour l’homogénéisation de hachage dans une boîte de pétri, diminuant ainsi le total de FACS temps et de coût, apparenté à lavage péritonéal.
Expression de la GFP thymique chez les poissons lck:eGFP a montré que la GFP est détectable dès 5 dpf6. Ici, nos études ont été réalisées chez les poissons adultes 3 mois ou plus et montrent que, à cet âge, les cellules B sont abondants dans la moelle des reins et la rate, mais les cellules T sont rares. Des études ultérieures avec des poissons d’âges différents seront nécessaires afin de déterminer si les cellules T sont plus fréquents à des moments différents. De même, à 3 mois, les cellules T sont enrichis dans le thymus, mais un nombre considérable de cellules B thymiques est également présent. Si ces populations de lymphocytes varient à différents âges est actuellement inconnue, mais fluorescence dans l’ensemble, du thymus s’estompe chez les poissons lck:eGFP , commençant à la maturité sexuelle (~ 3 mois), il est donc probable que le nombre de cellules T diminue avec l’âge, et cellules B peuvent aussi. De même, lorsque les cellules GFPlo B colonisent le thymus de poisson-zèbre est actuellement inconnu. À l’aide de poissons lck:eGFP , il est maintenant possible de surveiller le développement du thymus de lymphocytes B et T, afflux, efflux et la cinétique particulière de ces événements. En outre, ces questions sont également pertinentes vers d’autres sites anatomiques où les cellules B résident, comme la moelle de rein, rate, sang et l’intestin (données non présentées).
En plus d’études sur le développement de cellules de B, nous avons constaté récemment B-tout en lck:eGFP; rag2:hMYC poisson transgénique double11. Transgéniques rag2:hMYC était connu pour induire la lla-10 mais B-tous étaient partis non reconnus. En raison de la pénétrance élevée de cet oncogène, ces deux types d’abord sont répandues chez ces poissons, et beaucoup de poissons effectivement développer les deux tous types simultanément11. Puisque B-ALL sont GFPlo, tandis que T-ALL sont GFPSalut, variant l’expression de la GFP permet à ces deux entités isolés par FACS, même lorsque se produisant chez le même animal (Figure 5 a). C’est essentiel, dans les lymphocytes normaux et malins, qRT-PCRresults démontrent que GFPlo et cellules GFPSalut constamment correspondent à des lignées B et T, respectivement (Figure 2 et Figure 3).
Le potentiel inexploité de lck:eGFP poisson était central à ce travail, en insistant sur le fait que plusieurs lignées transgéniques préexistantes susceptibles ayant utilité au-delà de leur destination. Nous présentons ici un nouveau protocole pour isoler des cellules B et T de d. rerio avec transgéniques lck:eGFP, ouvrant la voie à nouvelles avenues de recherche concernant les lymphocytes B normaux et malins. Les résultats de ces études seront revitaliser sans aucun doute ce qui a déjà été une précieuse ressource pour l’hématopoïèse, lymphopoïèse et champs de la biologie du cancer.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Megan Malone-Perez pour les soins de poisson-zèbre et le noyau de cytométrie de flux OUHSC. Ce travail a été soutenu par des subventions de Hyundai Hope sur roues, le centre de l’Oklahoma pour l’avancement des sciences et de technologie (HRP-067), une sentence de projet pilote de NIH/NIGM INBRE (P20, GM103447). JKF détient le E.L. & Thelma Gaylord Endowed Chair en hémato-oncologie pédiatrique de la fondation de l’hôpital des enfants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
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