Summary
Questo protocollo dettaglia la metodologia per quantificare il comportamento motorio e sonno nella caverna messicano. Le analisi precedenti vengono estesi per misurare questi comportamenti socialmente Accasata pesce. Questo sistema può essere ampiamente applicato per lo studio di sonno e attività in altre specie di pesci.
Abstract
Attraverso phyla, sonno è caratterizzata da altamente conservate caratteristiche comportamentali che includono la soglia di eccitazione elevata, rimbalzo dopo privazione di sonno e consolidato periodi di immobilità del comportamento. La caverna messicano, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), è un modello per studiare l'evoluzione del tratto in risposta a perturbazioni ambientali. A. mexicanus esiste come in eyed superficie-abitazione forme e popolazioni di caverne ciechi multiple che sono robuste differenze morfologiche e comportamentali. Si è verificato la perdita di sonno in popolazioni multiple, caverna si è evoluta in modo indipendente. Questo protocollo descrive una metodologia per quantificare il sonno e attività locomotrice in grotta a. mexicanus e pesci di superficie. Un conveniente sistema di monitoraggio video consente per l'imaging del comportamento del pesce adulto o larvale individualmente-ospitato per periodi di una settimana o più. Il sistema può essere applicato a pescare invecchiato 4 giorni post fecondazione fino all'età adulta. L'approccio può essere adattato anche per misurare gli effetti delle interazioni sociali sul sonno registrando più pesce in una singola arena. A seguito del comportamento registrazioni, dati vengono analizzati utilizzando automated software di monitoraggio e analisi del sonno viene elaborata utilizzando script personalizzati che quantificare più variabili di sonno inclusi durata, lunghezza di bout e incontro. Questo sistema può essere applicato a misura sonno, comportamento circadiano e attività locomotrice in quasi ogni specie di pesci tra cui zebrafish e Spinarelli.
Introduction
Sonno è altamente conservata in tutto il Regno animale ai livelli fisiologici, funzionali e comportamentali1,2,3. Mentre il sonno in animali da laboratorio dei mammiferi in genere è valutato utilizzando gli elettroencefalogrammi, registrazioni elettrofisiologiche sono meno pratiche sistemi di piccolo modello geneticamente suscettibili e così sonno in genere viene misurata in base il comportamento3 , 4. caratteristiche comportamentali associate con il sonno sono altamente conservate in tutto il Regno animale e comprendono la soglia di risveglio aumentato, reversibilità con stimolazione e prolungata quiescenza comportamentale5. Queste misure possono essere utilizzate per caratterizzare il sonno negli animali che vanno dal worm del nematode c. elegans, attraverso gli esseri umani6.
L'uso di quiescenza comportamentale per la caratterizzazione di sonno richiede il software di rilevamento automatizzato. Con software di monitoraggio, periodi di immobilità e di attività sono determinati su un numero di giorni, e lunghi periodi di inattività sono classificati come dormire7,8. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati molteplici sistemi di monitoraggio per l'acquisizione di dati relativi all'attività tra una diversità di sistemi piccolo modello geneticamente suscettibili; tra cui vermi, moscerini della frutta e pesce9,10,11. Questi programmi sono accompagnati da software che consente il rilevamento automatizzato del comportamento animale, tra cui sia opensource freeware e software disponibili in commercio7,12,13,14 . Questi sistemi si differenziano per la loro flessibilità e consentono lo screening efficiente e caratterizzazione dei fenotipi di sonno nei numerosi modelli geneticamente modificabili.
Indagine genetica di sonno in zebrafish, Danio rerio, ha portato all'identificazione di numerosi geni e circuiti neurali che regolano il sonno15,16. Mentre questo ha fornito un potente sistema per indagare le basi neurali di sonno in un animale di laboratorio vertebrati, tanto meno è conosciuto circa come si evolve il sonno e come naturale variazione contribuisce a dormire regolamento. La caverna messicano, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), si sono evolute le differenze drammatiche nel sonno, attività locomotrice e ritmi circadiani17,18. Questi pesci esistano come popolazioni intorno alla regione della Sierra Del Abra del Messico nord-orientale19,20,21di eyed fish superficiale che abitano i fiumi del Messico e Texas meridionale e almeno 29 cave. Sorprendentemente, molte differenze comportamentali, tra cui la perdita di sonno, sembrano sono emerse in modo indipendente in più caverna popolazioni14,22. Di conseguenza, caverna fornisce un modello per studiare l'evoluzione convergente di sonno, circadiano e i comportamenti sociali.
Questo protocollo descrive un sistema per misurare il sonno e il comportamento motorio nell'A. mexicanus larve e adulti. Un sistema di registrazione su misura basati su infrarossi permette per la registrazione video di animali in condizioni di luce e buio. Software disponibile in commercio può essere utilizzato per misurare l'attività e le macro personalizzate vengono utilizzate per quantificare i diversi aspetti di inattività e determinare i periodi di sonno. Questo protocollo descrive anche le modifiche sperimentali per la verifica dell'attività di più animali all'interno di un serbatoio, con la possibilità di esaminare le interazioni tra il sonno e i comportamenti sociali. Questi sistemi possono essere applicati a misura sonno, comportamento circadiano e attività locomotrice in specie ittiche aggiuntive tra cui zebrafish e Spinarelli.
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Protocol
Nota: Impostare sistemi per il monitoraggio del comportamento in larve e adulti.
1. costruzione di un sistema di sonno per le larve
Nota: Il sistema di monitoraggio per il rilevamento larvale attraverso i pesci giovani di età compresa tra 4 giorni post fertilizzazione (dpf) attraverso 30 dpf a. mexicanus richiede più pezzi di attrezzature tra cui illuminazione a infrarossi (IR), diffusori di luce acrilico IR, automatizzato luce controlli (timer), computer, macchine fotografiche e materiali secondari come cablaggio e regolatori di potenza (Figura 1A). Le seguenti istruzioni verranno informerà come costruire un sistema per monitorare con precisione il comportamento motorio per studiare il sonno e ritmi circadiani in larvale a. mexicanus.
- Costruire un sistema di illuminazione costituito da IR e luce bianca diodi luminescenti (LED): posizionare tre luci a infrarossi in un triangolo circa 7,62 cm gli uni dagli altri su un dissipatore di calore in metallo sottile piattaforma 30,5 x 30,5 cm. Luci in serie del legare con filo elettrico e connettersi a una fonte di alimentazione.
- Posizionare un singolo LED a luce bianca al centro delle tre luci IR e allegarli alla fonte di alimentazione.
- Collegare la sorgente di alimentazione per i LED per un luce timer impostato su un tempo circadiano standard.
- Costruire una piattaforma per il sistema di rilevamento larvale. Utilizzare acrilico di spessore segno bianco 0,33 cm per tutti i componenti della piattaforma.
- Posizionare la piattaforma di registrazione sopra il dissipatore quadrato illuminato su cui arenas contenenti pesce risiederà durante il tracciamento comportamentale.
-
Posto un acrilico secondo dentro la scatola tra le luci e gli animali per diffondere l'IR per l'illuminazione ottimale e contrasto.
Nota: le dimensioni per la scatola chiara larvale è come segue: due 18 x 8,5 cm e due 17 cm x 8,5 cm LED che sono chimicamente legati insieme per formare un 18 cm x 18 cm quadrato che è 8,5 cm di altezza. Inoltre, acrilico può essere facilmente tagliato o forato utilizzando gli strumenti adeguati per il dimensionamento personalizzato.- Posizionare la fase larvale intera di rilevamento e l'installazione di illuminazione all'interno di un tunnel di plastica chiuso e quindi posizionare la fotocamera sulla parte superiore del tubo.
Nota: È importante mantenere le riflessioni di illuminazione di apparire sul video, il rilevamento come questo potrebbe compromettere la precisione di rilevamento. Il posizionamento delle telecamere sulla cima di un tubo che circonda piattaforma migliora illuminazione e nitidezza per le telecamere che sono utilizzati per questi esperimenti.
- Posizionare la fase larvale intera di rilevamento e l'installazione di illuminazione all'interno di un tunnel di plastica chiuso e quindi posizionare la fotocamera sulla parte superiore del tubo.
- Manipolare una webcam (Vedi Tabella materiali) per la registrazione basata su IR. Rimuovere l'obiettivo del produttore utilizzando un utensile rotante (Vedi Tabella materiali).
- Rimuovere le viti argentate piccole sul lato posteriore della fotocamera per smontare la scatola interna.
- Rimuovere le piccole viti nere all'interno del corpo della fotocamera per allentare il resto della lente. Utilizzare un piccolo cacciavite per rimuovere parti di alloggiamento dell'obiettivo che rimane dopo il taglio della lente.
- Rimuovi il LED blu sulla parte superiore di carica accoppiata alloggiamento device (CCD).
- Mettere insieme la fotocamera posteriore posizionando l'alloggiamento interno al suo orientamento originale e avvitando le due viti d'argento nella loro posizione originale.
- Itinerario all'interno della fotocamera utilizzando una piccola sega per adattarsi con un bit di routing di plastica arrotondati. Liscio giù la plastica supplementare fino a quando non si può andare bene un adattatore per obiettivo.
- Installare un filtro passa-IR all'interno della fotocamera più vicino il CCD possibile senza fare contatto diretto con la fotocamera.
Nota: Fare attenzione a non per danneggiare il chip CCD all'interno dell'alloggiamento della macchina fotografica. Essere sicuri di mantenere il taglio più orizzontale possibile. Sigillare qualsiasi spazio aperto tra l'esterno del filtro IR e il corpo della fotocamera per mantenere la luce di raggiungere il CCD senza essere filtrato. - Collegare la fotocamera a un obiettivo 35mm fissata (Vedi Tabella materiali) avvitando l'adattatore nella parte anteriore della fotocamera nella parte posteriore della lente.
- Posizionare la fotocamera e la lente nel foro trapanato il coperchio sulla parte superiore del tubo che ospita il palco e le luci e collegare il cavo USB al computer da che gli animali saranno registrati.
Nota: Mettere il pesce in una camera di comportamento che è separata da dove sono ospitati pesci di riserva per garantire minime interruzioni durante le registrazioni del comportamento. Fare attenzione a ridurre al minimo le fluttuazioni in temperatura e ventilazione che può confondere gli esperimenti comportamentali.
2. sistema di sonno per adulti
- Costruire un sistema di illuminazione IR per il monitoraggio di pesci adulti dal taglio di IR strisce a intervalli di circa 46 cm. Una striscia di 46 cm è sufficiente per ogni 10 litri di comportamento.
- Ogni striscia insieme in una serie, ogni striscia di filo elettrico DC di saldatura a filo e collegare a una fonte di alimentazione 9 V.
- Fissare ogni striscia di IR per un pezzo di 51 cm x 5,1 cm di alluminio che fungerà da un dissipatore di calore.
- Collocare un 46 cm x 5 cm, 0,32 cm spessore 9% luce-pass segno bianco acrilico foglio direttamente di fronte a ogni striscia di luce IR per diffondere il IR luce.
- Posizionare tutti i carri armati su una cremagliera che supporta l'illuminazione di IR montato posteriormente.
- Utilizzare divisori in plastica opache in carri armati di vetro 10 L per creare singoli arene.
Nota: La dimensione di arena può essere variata in base il numero di divisori utilizzato e la dimensione del serbatoio. Dimensione Arena influisce su attività locomotrice e dormire in grotta e superficie pesce23. - Montare telecamere circa 4-6 metri di distanza serbatoi. Ogni telecamera può registrare in genere da 3 serbatoi in un momento di fornire una risoluzione sufficiente per l'inseguimento.
Nota: Registrazioni del comportamento adulte generalmente non richiedono un sistema di illuminazione bianca separata per controllare i cambiamenti di giorno-notte. Semplicemente utilizzando standard plafoniere in una stanza del comportamento collegato ad un timer è probabile che sia sufficiente.
3. registrazione attività locomotrice
Nota: Tutte le registrazioni comportamentali sono realizzate utilizzando un computer portatile standard o il desktop con una fonte di batteria di backup. A causa delle dimensioni di file di grandi dimensioni di una 24 ore di registrazione (60-100 GB), è possibile salvare tutte le registrazioni su dischi rigidi esterni.
- Acclimatare pesci dpf di età 4-30 per 18-24 h prima di iniziare le registrazioni. Mangiare pesci larvale con Artemia dal vivo quando in primo luogo inserito nella camera di registrazione e 1 h prima di iniziare la registrazione. Acclimatare pesci adulti 4-5 giorni prima registrazione comportamento e nutrire una volta al giorno con mangime in fiocchi o dal vivo si.
Nota: Assicuratevi di posizionare larvale pesci in acqua dolce prima della registrazione, come avanzi di Artemia causerà problemi di rilevamento durante le analisi successive. Co-coltura con rotiferi fornisce un'opzione alternativa, come le loro piccole dimensioni non interferiscano con il rilevamento. - Posto pesce di età compresa tra 4-6 dpf in piastre di coltura del tessuto 24 pozzetti. Pesce di casa di età compresa tra 20-30 dpf in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti per la registrazione.
- Adulti record in 10 L serbatoi in forma con divisori per ospitare cinque pesci alloggiati individualmente, o senza divisori per registrare sonno e di attività in un contesto sociale.
Nota: Fare attenzione a mettere a fuoco la fotocamera prima di iniziare la registrazione al fine di massimizzare la precisione di rilevamento. Non aprire il diaframma dell'obiettivo della fotocamera troppo lontano, come questo ridurrà drasticamente la nitidezza dell'immagine. C'è un equilibrio, tuttavia; Se il diaframma è chiuso troppo lontano, il frame rate del video scenderà sotto fps 15,00. È essenziale per un'analisi successiva che il frame rate rimane 15,00 fotogrammi al s per l'uso con alcuni sonno personalizzato scritto script23,24. - Impostare luminosità e illuminazione Illuminazioni di sfondo.
- Ottimizzare l'illuminazione prima dell'inizio della registrazione. Sempre mantenere il contrasto al livello più alto possibile e utilizzare la luminosità e l'Illuminazione di sfondo per regolare la luminosità fino a quando gli animali sono più chiari.
- Pesce record per 24 o 48 ore.
Nota: Emergenza backup battery pack che alimentano tutti gli illuminazione, computer e macchine fotografiche devono essere acquistati in caso di interruzioni dell'alimentazione. Tutti i pacchi batteria anche dovrebbero essere collegati a prese di alimentazione d'emergenza, se possibile. Pacchi batteria saranno generalmente non alimentare l'apparecchiatura per più di pochi minuti a un'ora al massimo e servire da ponte tra la perdita di alimentazione principale e trasferimento al sistema di alimentazione di emergenza.
4. analisi dell'attività locomotrice in singolarmente ospitato pesce utilizzando Automated Software di monitoraggio
- Per iniziare l'analisi del comportamento, aprire il software di monitoraggio, selezionare Nuovo esperimento da modello, quindi selezionare applica un modello di tasti.
- Come il programma ora vi chiederà quale specie per tenere traccia, selezionare il pesce. Utilizzare la casella a discesa per selezionare entrambi Zebrafish larve di Zebrafish adulto secondo il paradigma sperimentale.
- Impostare le arene in cui ogni animale sarà tenuta traccia. Per le larve, selezionare ben piatto, rotondo bene e Nessun modello di zona. Per gli adulti, utilizzare campo aperto, Piazza con Nessun modello di zona. Quindi determinare il numero corretto di arenas, uno per ciascun animale monitorata nel video.
- Selezionare il modello per il rilevamento ottima, fare clic su traccia centro-punto, ed essere sicuri che il colore degli animali sia selezionato per essere più scuro rispetto allo sfondo. Applicare il frame rate in cui è stato acquisito il video. Il software di monitoraggio dovrebbe rilevare automaticamente questo.
- Disegnare una scala per calibrare la distanza reale di un oggetto per determinare con precisione il comportamento motorio del pesce utilizzando Impostazioni di Arena.
- Modificare le arene per assicurarsi che l'intera area che i pesci sono in verrà monitorata; in caso contrario i campioni saranno persi durante l'acquisizione.
Nota: Prestare attenzione durante l'impostazione di aree. Larvale pesce soprattutto sono sensibili agli errori di rilevamento, se le arene sono troppo grandi o piccole. Cattiva illuminazione nell'esperimento può anche creare ombre sulle pareti delle piastre a pozzetti, che il programma potrebbe pensare è un animale, creando un falso positivo. - Fare clic su Avanzate. In Metodo nell'Impostazione di rilevamento, selezionare Dynamic sottrazione, poi fai clic sullo sfondo e selezionare Start Learning. Regolare il rapporto di segnale/rumore di contrasto scuro finché gli animali vengono monitorati bene, e lo sfondo non è causa di rilevamento saltare.
Nota: Qualità video può variare tra esperimenti, quindi potrebbe essere necessario utilizzare impostazioni diverse, di conseguenza ogni prova. Utilizzando le funzionalità di Contorno del soggetto e Dimensioni del soggetto può migliorare significativamente i risultati della ricerca. - Selezionare elenco Trial e caricare i parametri corretti prima di iniziare a registrare i dati nel programma.
- Fare clic nella scheda di acquisizione , selezionare Traccia tutte le prove in programma e fare clic sul pulsante di registrazione.
- Sotto il Profilo di analisi, assicurarsi che siano selezionate distanza, tempo e movimento .
Nota: In ordine per un'analisi successiva di sonno, è fondamentale che queste impostazioni siano corrette, come la perla file deve leggere questi dati nell'ordine corretto per calcolare il sonno. - In Esporta, selezionare Dati grezzi, esportare i dati come testo Unicode.
5. tracking ospitato socialmente pesce
- Seguire i passaggi 4.1-4.4 impostare l'esperimento nel software di monitoraggio.
- Nel menu a discesa, selezionare il numero di animali per tenere traccia per l'esperimento.
- Nelle impostazioni di Arena , disegnare la scala corretta per calibrare la distanza reale.
- In impostazioni di rilevamento , utilizzare Dynamic sottrazionee regolare il contrasto scuro per monitorare meglio l'animale.
- Regolare le dimensioni del soggetto sotto le impostazioni di rilevamento, in modo che solo una porzione molto piccola dell'animale viene tenuta traccia.
Nota: Registrando solo una piccola parte dell'animale, questo ridurrà la quantità di commutazione tra animali quando essi si incrociano durante l'acquisizione. - Una volta acquisite le tracce, è possibile utilizzare il Track Editor per correggere manualmente volte dove i pesci possono attraversare percorsi.
6. estrazione dei dati di sonno da attività locomotrice
Nota: La definizione del comportamento di sonno in sia larvale e adulto a. mexicanus è 1 minuto o più di quiescenza. Questa definizione è stata determinata utilizzando esperimenti di soglia di eccitazione, dove un maggiore stimolo sensoriale è necessaria per avviare una risposta comportamentale in uno stato dormiente (> 60 s) rispetto al risveglio14,17. Per tenere conto di piccoli movimenti e alla deriva comune a pescare specie, ci sono soglie di velocità applicate per separare il movimento reale da rumore o deriva. Queste soglie sono informaticamente derivato confrontando le correlazioni tra distanza e durata del sonno per trovare il più alto R-squared valori; quindi determinare la velocità più precisa per il movimento e il sonno. Per pesce larvale, i limiti superiori e inferiori sono entrambe 12 mm/s come c'è poco da nessuna deriva. Per gli adulti il limite inferiore è 2 cm/s con un limite superiore di 4 cm/s per tenere conto di drift.
- Installare Cygwin per l'analisi del computer per effettuare l'esecuzione degli script personalizzati scritti per estrarre locomotore e comportamento di dormire.
- Creare una nuova cartella di esperimento all'interno della directory home di Cygwin.
- Importare i dati Unicode non elaborati dal software di monitoraggio ed eseguire il file. sh in Cygwin per convertire la codifica da UTF-16 in UTF-8.
- Eseguire il file della perla in Cygwin per estrarre i dati di sonno.
- Aprire il file di macro e seguire le istruzioni all'interno del foglio di calcolo per finalizzare l'analisi dei dati come desiderato.
Nota: Un livello base di codifica della riga di comando sarà necessario effettuare questa porzione di analisi. General Linux comandi saranno sufficiente. Se ci sono problemi con i programmi che leggono i dati correttamente, controllare i dati dal software in qualsiasi editor di testo liberamente disponibile di monitoraggio per essere sicuri che la codifica e ordine sia corretto per i file eseguibili di scrivere correttamente.
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Representative Results
Età di larve 4-30 dpf può essere attendibilmente registrato nel sistema chiuso personalizzati descritto nella Figura 1. Il sistema comprende IR e illuminazione visibile per consentire le registrazioni in condizioni di luce e buia, sotto diverse condizioni di luce visibile (Figura 1A). I video sono poi analizzati utilizzando il software di monitoraggio (Figura 1BC) e post-elaborazione utilizzando una macro personalizzata sonno (Vedi Download supplementare). Larvale pesce da tre popolazioni indipendenti caverna visualizzare una riduzione significativa nel sonno rispetto ai pesci di superficie (Figura 1) e 20 dpf, e questa perdita di sonno è coerenza in stadi di sviluppo. L'età dei pesci analizzati per sonno dipende spesso la manipolazione sperimentale. Ad esempio, a. mexicanus non consumare cibo in 4 giorni, modo esperimenti esaminando le interazioni tra il sonno e alimentazione in genere si verificano in età superiore larve25. Al contrario, morpholinos sono efficaci in primi avannotti (in genere più giovane di 4 dpf) solo così questa età è usato per asini sonno24,26,27.
A. mexicanus può vivere fino a 30 anni in laboratorio, ma gli esperimenti usando gli adulti vengono in genere eseguiti in pesci dai 6 mesi ai 3 anni. Pesce può essere registrato in una varietà di dimensioni di serbatoio a seconda dell'esperimento e illuminazione IR consente registrazioni durante i periodi di luce e buio (Figura 2A). Arene individuali sono etichettati in rilevamento per consentire il rilevamento di pesce, e post-elaborazione utilizzando una macro personalizzata consente una lettura del sonno (Figura 2BC). Sonno è ridotto significativamente nella caverna Pachón, Molino e Tinaja, rispetto ai pesci di superficie (Figura 2D). Inoltre, questo sistema consente registrazione pesci multipli in una singola arena (in genere 10 galloni serbatoi), per consentire analisi delle interazioni sociali come influenzano il sonno (Figura 2EF). Social housing robustamente riduce il sonno nei pesci di superficie, senza influenzare il sonno in caverna Pachón (Figura 2). La mancanza di effetto in caverna è probabilmente a causa di un effetto di seminterrato, dove la caverna dorme poco, specialmente nelle più grandi arene utilizzate per esaminare il comportamento sociale.
Figura 1: Comportamento di sonno di registrazione in larvale e giovanile a. mexicanus. (A) schema di installazione di comportamento di sonno larvale: Larva sono posizionati su una piattaforma all'interno di un tubo di luce controllata. Sistemi di illuminazione a raggi infrarossi e bianco sedersi sotto il pesce nella parte inferiore del tubo. Una telecamera IR-pass si trova nella parte superiore del tubo ed è collegata a un computer portatile su cui è registrato il video. Tutti i sistemi alimentati (illuminazione e portatili) siano collegati alla alimentazione di backup. (B) le impostazioni di Arena in software di monitoraggio. Le larve individuali sono tenute in pozzetti in una piastra di coltura del tessuto, e arene (ciano) sono realizzati per ogni animale. (C) locomotore tracce di comportamento motorio dei pesci dopo aver acquisito i dati nel software di monitoraggio. Le tracce rosse rappresentano 10 s di attività in 20 - giorno-vecchio pesce. (D) risultante dormire dati dal software di monitoraggio. Caverna giovanile convergenza su comportamento di sonno ridotto rispetto alla superficie pesce Morph (One-way ANOVA F(3, 116) = 76,12; Analisi post-hoc Dunnett è stato applicato per confrontare ogni popolazione di caverna con i pesci di superficie, P < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sistema adulto a. mexicanus per sonno e comportamento circadiano. (A) diagramma di sistema di sonno-registrazione: pesci sono tenuti in carri armati su una cremagliera di fronte di monitoraggio delle telecamere. Un sistema di illuminazione a raggi infrarossi è collocato dietro i serbatoi di pesce, mentre passa-IR telecamere sono collegati a un computer portatile per la registrazione di comportamento. Tutti i sistemi di alimentazione sono collegati a un sistema di batteria di backup in caso di sbalzi di tensione. (B) Arena configurazione nel software di monitoraggio. Singoli pesci sono contrassegnati creando separato arenas (ciano) per tracciare il comportamento dell'apparato locomotore. (C) brani locomotore rappresentativi (linee rosse) del singolo pesce dopo l'acquisizione di una registrazione del comportamento il software di monitoraggio. Le tracce rappresentano 20 s di attività. Durata di sonno totale (D) oltre 24 h è ridotta significativamente in tre distinte popolazioni di caverna rispetto ai pesci di superficie (One-way ANOVA F(3, 106) = 52,66; Test post-hoc Dunnett sono state applicate tra pesci di superficie e popolazione ogni grotta, P < 0,001). (E) A singolo serbatoio contenente più pesce in cui uno arena (arancione) è fatto per tenere traccia di sonno e le interazioni sociali. (F) locomotore tracce di pesce più dopo acquisizione dati nel software (ogni colore rappresenta un singolo pesce) di monitoraggio. (G) dati rappresentativi della superficie e Pachón caverna nel sonno sociale di rilevamento. Pesce superficiale ridurre significativamente il sonno in vasche 10L rispetto a arenas 2 L; Superficie pesce sonno è ridotta ulteriormente quando pesce socialmente sono alloggiati. Caverna di sonno non è significativamente alterata in qualsiasi condizione (Two-way ANOVA F(2,46) = 4.545; analisi post-hoc è stata eseguita all'interno di ogni popolazione di testare l'effetto della dimensione del serbatoio e stato sociale sul totale di sonno 10 L singolo, P = 0,013; 10 sociale L, P = 0.0003). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un sistema personalizzato per quantificare il sonno e l'attività locomotrice in caverna larvale e adulto. Caverna è emersi come un modello di punta per studiare l'evoluzione del sonno che può essere utilizzato per studiare la base genetica e neurale di sonno regolamento1. I passaggi critici nel presente protocollo comprendono l'ottimizzazione dell'illuminazione e qualità video al fine di assicurare il monitoraggio accurato che è necessario quantificare il sonno. Il sistema di acquisizione e analisi descritti qui sono completamente funzionale, così come molti altri sistemi sia commerciali che costruito su misura, per quantificare la locomozione e comportamento28,29,30. L'analisi precedente esame di sonno nel singolo pesce può essere esteso per consentire per l'analisi dei pesci stabulati in gruppo. Un aspetto significativo da considerare quando Trouble-Shooting o la progettazione di saggi è la confonde comportamento sociale può avere sul sonno di un individuo. Ad esempio, aggressione è comune in Astianatte, e livelli di aggressività differiscono tra superficie pesce e caverna31. Ottimizzare il numero di pesci, dimensioni dell'arena e rapporto del sesso, al fine di minimizzare l'aggressione permetterà per misurazioni riproducibili del regolamento di sonno.
Una limitazione della tecnica, come descritto, è una mancanza di affidabilità seguendo singoli pesci durante tutto il test. Rilevamento automatizzato animale passa spesso animali quando entrano in stretto contatto. Questo può essere affrontato da un'attenta ottimizzazione delle soglie, o correggendo manualmente le opzioni. Inoltre, il sistema descritto non è un sistema di flusso continuo, e di conseguenza, la qualità dell'acqua può diventare un problema dopo le registrazioni durano più di un paio di giorni. Sono stati descritti altri attraversano sistemi in zebrafish13 e questi potrebbe essere facilmente applicati a porcile della caverna messicano.
La metodologia descritta è significativa a causa della sua ampia applicabilità per misurare il comportamento in specie di pesci diversi. Sonno deve ancora essere caratterizzato in quasi qualsiasi pesce di acqua dolce o marini tra cui Spinarelli, ciclidi e Portaspada32,33,34. La versatilità di questo sistema di misura sleep in a. mexicanus e altri modelli di pesce può rivolgere diverse domande circa l'evoluzione e le basi genetiche di sonno. L'hardware connesso con questo sistema è altamente conveniente, rendendolo altamente accessibile e fornendo potenziale per analisi di rendimento elevato di farmacologico e l'analisi di ecotoxilogical di sonno e di attività locomotrice.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non hanno nessun interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da premio NIGMS GM127872 ACK, NINDS award 105072 ERD e ACK e NSF award 1656574 di ACK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
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