Summary
Detta protokoll Detaljer metoden för att kvantifiera rörelseapparaten beteende och sova i den mexikanska släktet. Tidigare analyser förlängs för att mäta dessa beteenden i socialt inrymt fisk. Detta system kan i stor utsträckning för att studera sömn och aktivitet i andra fiskarter.
Abstract
Över phyla kännetecknas sömn av mycket beteendemässiga egenskaper som inkluderar förhöjda upphetsning tröskel, rebound efter sömnbrist och konsoliderade perioder av beteendemässiga orörlighet. Den mexikanska släktet, Astyanax mexicanus (A. mexicanus),, är en modell för att studera drag evolution bemöta miljömässiga störning. A. mexicanus finns liksom eyed yta-bostad former och flera blinda grottboende populationer som har robust morfologiska och beteendemässiga skillnader. Sömnbrist har inträffat i flera, självständigt utvecklade släktet populationer. Det här protokollet beskriver en metod för att kvantifiera sömn och rörelseaktivitet i A. mexicanus grotta och ytan fisk. Ett kostnadseffektivt videoövervakningssystem möjliggör beteendemässiga avbildning av individuellt inrymt larver eller vuxen fisk för perioder på en vecka eller längre. Systemet kan användas för att fiska år 4 dagar efter befruktning genom vuxenlivet. Metoden kan även anpassas för att mäta effekterna av sociala interaktioner på sömn genom att registrera flera fisk i en enda arena. Efter beteendevetenskapliga inspelningar, data analyseras med automatiserad mjukvara och sömn analys bearbetas med hjälp av anpassade skript som kvantifiera flera sömn variabler inklusive varaktighet, bout längd och skjutningen nummer. Detta system kan tillämpas på åtgärd sömn, dygnsrytm beteende och rörelseaktivitet i nästan alla fiskarter som bland annat Zebrafiskar och spiggar.
Introduction
Sömn är mycket bevarad i hela djurriket på fysiologiska, funktionella och beteendemässiga nivåer1,2,3. Medan sömn hos däggdjur försöksdjur bedöms vanligtvis använder elektroencefalogram, elektrofysiologiska inspelningar är mindre praktisk i små genetiskt mottaglig modellsystem och därmed sova normalt mäts utifrån beteende3 , 4. beteendemässiga egenskaper som förknippas med sömn bevaras mycket i hela djurriket och inkluderar ökade upphetsning tröskel, reversibilitet med stimulering och långvarig beteendemässiga rofylld5. Dessa åtgärder kan användas för att karaktärisera sömn hos djur alltifrån nematoder masken, C. elegans, genom människor6.
Användning av beteendemässiga rofylld att karakterisera sömn kräver automatiserad mjukvara. Med spårning programvara, perioder av aktivitet och orörlighet bestäms över ett antal dagar och långa perioder av inaktivitet klassificeras som sova7,8. Under senare år har har flera tracking system utvecklats för att förvärva aktivitetsdata bland en mångfald av små genetiskt-mottaglig modellsystem; bland annat maskar, bananflugor och fisk9,10,11. Dessa program åtföljs av programvara som möjliggör automatisk spårning av djurs beteende, inklusive både öppen källkod freeware och inköpt programvara7,12,13,14 . Dessa system skiljer sig åt i deras flexibilitet och möjliggör effektiv screening och karakterisering av sömn fenotyper i många genetiskt parkeringsleverantörer modeller.
Genetisk utredning av sömn i Zebrafiskar, Danio rerio, har lett till identifiering av många gener och neurala kretsar som reglerar sömn15,16. Medan detta har gett ett kraftfullt system för att undersöka personlighetens grund i sömn i ett laboratorium som vertebrate djur, mycket mindre är känt om hur sömn utvecklas och hur naturliga bidrar variationen till att sova förordning. Den mexikanska släktet, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), har utvecklats dramatiska skillnader i sömn, rörelseaktivitet och dygnsrytmen17,18. Dessa fiskar finns som eyed yta fisk som bebor floder av Mexico och södra Texas och minst 29 cave befolkningar runt regionen Sierra Del Abra nordöstra Mexiko19,20,21. Anmärkningsvärt verkar många beteendemässiga skillnader, inklusive sömn förlust, har uppstått oberoende av varandra i flera släktet populationer14,22. Släktet ger därför en modell för att undersöka den konvergent evolutionen av sömn, dygnsrytm, och sociala beteenden.
Det här protokollet beskriver ett system för att mäta sömn och rörelseapparaten beteende i A. mexicanus larver och vuxna. En specialbyggd IR-baserade inspelningssystem möjliggör videoinspelning av djur under ljusa och mörka förhållanden. Inköpt programvara kan användas för att mäta aktivitet och anpassade makron används för att kvantifiera flera aspekter av inaktivitet och bestämma perioder av sömn. Det här protokollet beskriver också experimentella modifieringar för att spåra aktiviteten av flera djur inom en tank, som ger möjlighet att undersöka samspelet mellan sömn och sociala beteenden. Dessa system kan tillämpas på åtgärd sömn, dygnsrytm beteende och rörelseaktivitet i ytterligare fiskarter inklusive Zebrafiskar och spiggar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Inrätta system för beteendemässiga spårning på larver och vuxna.
1. att konstruera ett Sömnsystem för larver
Obs: Övervakningssystemet för spårning larval genom ungfisk åldern 4 dagar efter befruktning (dpf) genom 30 dpf A. mexicanus kräver flera delar av utrustning inklusive infraröd (IR) belysning, akryl IR ljus diffusorer, automatisk ljus kontroller (timers), datorer, kameror och sekundära material såsom ledningar och power controllers (figur 1A). Följande anvisningar kommer att informera hur man bygger ett system för att spåra rörelseapparaten beteende för att studera sömn och dygnsrytm i larval A. mexicanus.
- Konstruera en belysningssystem bestående av IR och vita lysdioder (LED): Placera tre IR-lamporna i en triangel cirka 7,62 cm från varandra på en 30,5 x 30,5 cm tunn metall plattform kylfläns. Tråd-lampor i serie med elektrisk tråd och ansluta till en strömkälla.
- Placera en enda vitt ljus LED i mitten av de tre IR-ljus och bifoga dem till strömkällan.
- Anslut strömkällan för att lampan ska en ljus timer inställd på en standard dygnsrytm tid.
- Konstruera en plattform för larval spårningssystem. Använda 0,33 cm tjock vit skylt akryl för alla komponenter av plattformen.
- Placera den inspelning plattformen ovanpå upplysta torget kylflänsen på vilka arenor som innehåller fisk kommer att finnas under beteendemässiga spårning.
-
Placera en andra akryl inuti rutan mellan lamporna och de djur som diffust IR för optimal belysning och kontrast.
Obs: dimensionerna för larval ljuslåda är följande: två 18 cm x 8,5 cm och två 17 x 8,5 cm lysdioder som är kemiskt sammanbundna till form en 18 x 18 cm kvadrat som är 8,5 cm lång. Dessutom, kan akryl vara enkelt klippa eller borrade med rätt verktyg för anpassade dimensionering.- Placera hela larval spårning scenen och ljusteknik inom en sluten plast röret, och sedan placera kameran på toppen av röret.
Obs: Det är viktigt att hålla belysning reflektioner visas på spårning video, eftersom detta kommer att försvåra spårning noggrannhet. Placeringen av kamerorna på toppen ett rör som omger plattform förbättrar belysningen och skärpa för kameror som används för dessa experiment.
- Placera hela larval spårning scenen och ljusteknik inom en sluten plast röret, och sedan placera kameran på toppen av röret.
- Manipulera en webbkamera (se Tabell för material) för IR-baserade inspelning. Ta bort tillverkaren linsen med roterande verktyg (se Tabell för material).
- Ta bort små silver skruvarna på baksidan sidorna av kameran för att ta bort den inre bostäder.
- Ta bort de små svarta skruvarna inuti kroppen av kameran för att lossa resten av linsen. Använd en liten skruvmejsel för att ta bort delar av linsen höljet som är kvar efter styckning linsen.
- Ta bort blå ledde på den övre delen av den laddade kopplad enhet (CCD) bostäder.
- Sätta tillbaka kameran ihop genom att placera den inre bostäder tillbaka till dess ursprungliga orientering och skruva två silverskruvarna tillbaka till sin ursprungliga position.
- Rutten insidan av kameran med en liten såg som passar med lite för rundad plast routing. Smidig ner extra plast tills det kan passa en lins adapter.
- Installera ett IR-pass filter inuti kameran så nära CCD som möjligt utan att göra direkt kontakt med kameran.
Obs: Se till att inte skada CCD-chipet inom höljet på kameran. Var noga med att hålla snittet så vågrätt som möjligt. Täta eventuella öppna ytor mellan utsidan av IR-filter och kroppen av kameran att hålla ljuset från att nå CCD utan filtreras. - Montera kameran på en 35 mm fast objektiv (se Tabell för material) genom att skruva adaptern framsidan av kameran på baksidan av objektivet.
- Placera kameran och objektivet i hålet borras ner locket ovanpå röret som inrymmer scenen och lampor och bifoga USB till datorn djuren registreras från.
Obs: Placera fisken i ett beteende-rum som är separat från där lager fisk är inhysta för att säkerställa minimala störningar under beteendemässiga inspelningar. Var noga med för att minimera fluktuationer i temperatur och ventilation som kan förvirra beteende experiment.
2. sömn System för vuxna
- Konstruera en IR belysning för att spåra vuxna fiskar genom att skära IR remsor till cirka 46 cm intervall. För varje 10 L beteende tank räcker en 46 cm remsa.
- Tråd varje remsa tillsammans i en serie, lödning varje remsa till DC elektrisk tråd och bifoga till ett 9 V-strömkälla.
- Fäst varje IR remsa en 51 x 5,1 cm bit av aluminium som fungerar som en kylfläns.
- Placera ett 46 cm x 5 cm, 0,32 cm tjock 9% ljus-pass vit skylt akryl blad direkt framför varje IR ljus strip till diffus IR ljus.
- Placera alla tankar på ett rack som stöder bakmonterad IR belysning.
- Använd ogenomskinlig plast avdelare i 10 L glas tankar för att skapa individuella arenor.
Obs: Arena storleken kan varieras beroende på antalet avdelare används och storleken på tanken. Arena storlek påverkar rörelseaktivitet och sömn i både grotta och ytan fisk23. - Montera kameror cirka 4-6 m från tankar. Varje kamera kan vanligtvis spela in från 3 tankar samtidigt för att ge tillräcklig upplösning för spårning.
Obs: Adult beteendemässiga inspelningar generellt kräver inte en separat vit belysningssystem för att styra dag-natt förändringar. Helt enkelt utnyttja standard overhead lampor i en beteendevetenskaplig rum ansluten till en timer är sannolikt att vara tillräcklig.
3. inspelning rörelseaktivitet
Obs: Alla beteendemässiga inspelningar görs med en vanlig bärbar dator eller stationär med en backup batterikälla. På grund av stora storleken på en 24 h inspelning (60-100 GB), spara alla inspelningar på externa hårddiskar.
- Acklimatisera fisk åldrar 4-30 dpf för 18-24 h innan inspelningar. Foder larval fisk med levande Artemia när först placeras i inspelning kammaren och 1 h innan du påbörjar inspelningen. Acklimatiserar sig vuxen fisk 4-5 dagar innan inspelningen beteende och mata en gång dagligen med flake mat eller med levande blackworms.
Obs: Var noga med att placera larval fisk i sötvatten innan inspelning, eftersom överblivna Artemia kommer att orsaka tracking problem under senare analys. Samtidig odling med rotifers ger ett alternativ, som deras liten storlek inte stör spårning. - Plats fisk i åldern 4-6 dpf i 24-väl vävnadsodling plattor. Hus fisk i åldern 20-30 dpf i 12-väl vävnadsodling plattor för inspelning.
- Spela in vuxna i 10 L tankar passar med avdelare för att rymma fem individuellt inhysta fisk, eller utan avdelare för att registrera sömn och aktivitet i en social miljö.
Obs: Var noga med för att fokusera kameran innan inspelningen för att maximera noggrannhet för aktivitetsmätning. Öppna inte iris i kameralinsen för långt, eftersom detta kommer att drastiskt minska skärpan i bilden. Det finns en balans, dock; om iris är stängd för långt, kommer att videon bildfrekvens understiga 15.00 fps. Det är viktigt för senare analys att bildfrekvensen förblir 15.00 bildrutor per s för användning med vissa anpassade skriftliga sömn script23,24. - Ställa in belysning/ljusstyrka bakgrund illuminations.
- Optimera belysningen före start av inspelning. Alltid hålla kontrasten på högsta nivå möjligt och Använd ljusstyrka och Bakgrundsbelysning för att justera ljusstyrkan tills djuren är mest tydlig.
- Rekord fisk för 24 eller 48 timmar.
Obs: Nödsituation backup batterier som driver alla belysning, datorer och kameror bör köpas vid strömavbrott. Alla batterier ska också anslutas till akut eluttag, om möjligt. Batteripaket kommer generellt inte power utrustning för mer än ett par minuter till en timme på mest och servera till bro mellan att förlora huvudströmmen och överföra till reservkraft-systemet.
4. analys av rörelseaktivitet i individuellt inrymt fisk använder automatiserad mjukvara
- Påbörja en analys av beteende, öppna spårning programvara, Välj Nytt Experiment från mall, sedan tillämpa en Pre-Defined mall.
- Som programmet frågar nu vilka arter att spåra, Välj fisk. Använd den nedrullningsbara rutan för att välja antingen Zebrafiskar larver av Zebrafisk vuxen beroende experimentella paradigm.
- Ställ in de arenor där varje djur kommer att spåras. För larver, Välj väl platta, runda väl och Nr zon mall. För vuxna, med öppna fält, torget Nr zon mall. Sedan bestämma rätt antal arenor, en för varje djur som spåras i videon.
- Välj modell för optimal spårning, klicka på spåra mittpunkten, och se till att djur färg väljs att vara mörkare än bakgrunden. Applicera den bildhastighet som videon förvärvades. Mjukvara bör automatiskt upptäcka detta.
- Rita en skala för att kalibrera det verkliga avståndet för ett objekt att exakt fastställa beteendet rörelseapparaten med fisken med hjälp av Arena inställningar.
- Redigera arenorna att se till att hela området som fisken kommer att spåras; annars kommer prover att försvinna vid förvärvet.
Obs: Var försiktig när du ställer in områden. Larval fisk är särskilt känsliga för spårning fel om arenorna är antingen för stort eller litet. Dålig belysning i experimentet kan också skapa skuggor på väggarna i plattor, som programmet kanske tror är ett djur, att skapa ett falskt positivt. - Klicka på Avancerat. Enligt metoden i Upptäckt inställning, Välj Dynamiska subtraktion, sedan klicka på bakgrunden och välj Starta lärande. Justera mörk kontrast signal/brusförhållandet tills djuren spåras väl, och bakgrunden inte orsakar spårning att hoppa.
Obs: Videokvaliteten kan variera mellan experiment, så varje prövning kan behöva använda olika inställningar, med detta. Använda funktionerna Ämne kontur och Ämne storlek kan avsevärt förbättra spårning resultat. - Välj rättegång lista och ladda rätt parametrar innan du börjar registrera data i programmet.
- Klicka på fliken förvärv och välj Spår alla planerade studier Klicka på inspelningsknappen.
- Kontrollera under Analys profil, distans och tid & rörelse är markerad.
Obs: För att senare sömn analys är det viktigt att dessa inställningar är korrekta, som .perl filen måste läsa dessa data i rätt ordning för att beräkna sömn. - Under exportera, Välj Raw Data, exportera data som Unicode-text.
5. spårning inrymt socialt fisk
- Följ steg 4.1-4.4 ställa in experimentet i mjukvara.
- I rullgardinsmenyn väljer du hur många djur att spåra för experimentet.
- Rita den rätt skalan för att kalibrera det verkliga avståndet i inställningarna för Arena .
- I Inställningar, använder Dynamisk subtraktionoch justera mörka kontrasten för att bäst spåra djuret.
- Justera motivet storlek under detection inställningar, så att endast en mycket liten del av djuret spåras.
Obs: Spåra endast en liten del av djuret, kommer att detta minska mängden växling mellan djur när de korsar vägar under förvärv. - När spåren förvärvas, använda Track Editor för att manuellt fixa tider där fisk kan korsas.
6. utvinning av Sömndata från rörelseaktivitet
Obs: Beteendemässiga definitionen av sömn i både larver och vuxna A. mexicanus är 1 min eller mer av rofylld. Denna definition bestämdes med hjälp av upphetsning tröskel experiment, där en större sensoriska stimulus krävs för att initiera en beteendemässiga svar i ett sovande tillstånd (> 60 s) jämfört med vakna14,17. Hänsyn till små rörelser och drifting gemensamma fiskarter, det används velocity tröskelvärden för att segregera verklig rörelse från buller eller drift. Dessa trösklar är beräkningsmässigt framställda genom att jämföra korrelationer mellan avstånd och sömn tid att hitta de högsta R-kvadratvärden; så sätt fastställa den mest exakta hastigheten för rörelse och sömn. För larval fisk, de övre och lägre gränserna är både 12 mm/s eftersom det finns lite att ingen drift. För vuxna fiskar är nedre gränsen 2 cm/s med en övre gräns på 4 cm/s för drift.
- Installera Cygwin analys datorn att utföra körning av de anpassade skrivna skript att extrahera rörelseapparaten och sova beteende.
- Skapa en ny mapp för experiment inom Cygwin arbetskatalogen.
- Importera Unicode-rådata från spårningsprogram och verkställa den .sh fil i Cygwin konvertera kodning från UTF-16 till UTF-8.
- Köra filen .perl i Cygwin att extrahera sömndata.
- Öppna filen makro och följ instruktionerna i kalkylbladet att slutföra dataanalysen som önskas.
Obs: En grundläggande nivå av kommandoraden kodning kommer att vara nödvändigt att genomföra denna del av analysen. General Linux-kommandon kommer att räcka. Om det finns problem med de program som läser data korrekt, kontrollera data från spårning programvara i någon fritt tillgänglig text redaktör till kodning och beställningen är korrekt för körbara att skriva ordentligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larverna åldrar 4-30 dpf tillförlitligt kan registreras i skräddarsy slutna systemet beskrivs i figur 1. Systemet innehåller både IR och synlig belysning för att möjliggöra inspelningar under ljusa och mörka förhållanden, under olika synliga ljusförhållanden (figur 1A). Videor och sedan analyseras med spårningsprogramvara (figur 1BC) och efter bearbetning med en anpassad sömn makro (se Kompletterande Hämta). Larval fisk från tre oberoende släktet befolkningen visar en betydande minskning i sömn jämfört med surface fisk (figur 1 d) och 20 dpf och denna sömnbrist är konsekvent över utvecklingsstadier. Åldern av fisk analyseras för sömn är ofta beroende av experimentella manipulation. Till exempel förtär A. mexicanus inte mat på 4 dagar, så experiment att undersöka samspelet mellan sömn och utfodring skulle uppstår vanligtvis i äldre larver25. Däremot är morpholinos endast effektiva i tidig fry (vanligtvis yngre än 4 dpf) så denna ålder används till åsnor sömn24,26,27.
A. mexicanus kan leva i upp till 30 år i laboratoriet, men experiment med vuxna utförs vanligtvis i fisk i åldern 6 månader till 3 år. Fisk kan registreras i en mängd tank storlekar beroende på experiment och IR belysning möjliggör inspelningar under ljusa och mörka perioder (figur 2A). Enskilda arenor är märkta i spårning för att möjliggöra spårning av fisk, och efter bearbetning med hjälp av ett anpassat makro ger en avläsning av sömn (figur 2BC). Sömn är betydligt i Pachón, Molino och Tinaja släktet, jämfört med surface fisk (figur 2D). Dessutom tillåter detta system inspelning flera fisk i en enda arena (vanligtvis 10 gallon tankar), möjliggör analys av hur sociala interaktioner påverkar sömn (figur 2EF). Sociala bostäder kraftfullt minskar sömn i ytan fisk, utan att påverka sömn i Pachón släktet (figur 2 g). Avsaknaden av effekt i släktet beror sannolikt på en källare effekt, där släktet sova lite, särskilt i de största arenorna som används för att undersöka sociala beteende.
Figur 1: Inspelning sömn beteende i larver och juvenil A. mexicanus. (A) Schematisk bild av larval sömn beteende setup: larven placeras på en plattform inom en ljus-kontrollerade tube. IR och vit belysningssystem sitter nedanför fisk på botten av röret. En IR-pass kameran sitter på toppen av röret och är ansluten till en laptop som videon spelas in. Alla motordrivna system (belysning och laptop) är ansluten till reservkraft. (B) Arena inställningar i spårning programvara. Enskilda larver hålls i brunnar i en vävnadskultur tallrik och arenor (cyan) är gjorda för varje djur. (C) rörelseapparaten spår av fisk rörelseapparaten beteende efter att förvärva data i spårning programvara. Rött spår representerar 10 s verksamhet i 20 - dag-gammal fisk. (D) resulterande sova data från spårning programvara. Juvenil släktet konvergerar vid minskad sömn beteende jämfört med surface fisk morphs (envägsavgift ANOVA F(3, 116) = 76.12; Dunnett post-hoc analys användes för att jämföra varje släktet befolkningen med surface fisk, P < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vuxen A. mexicanus system för sömn och dygnsrytm beteende. (A) Diagram av sömn-inspelning system: fisk hålls i tankar på en rack mittemot tracking kameror. En infraröd belysning placeras bakom fisketankar, medan IR-pass kameror är kopplade till en laptop för inspelning beteende. Alla motordrivna system är anslutna till en backup batterisystemet vid power fluktuationer. (B) Arena ställer i spårning programvara. Enskilda fiskar markeras genom att skapa separata arenor (cyan) för att spåra rörelseapparaten beteende. (C) representativa rörelseapparaten spår (röda linjer) för individuella fiskar efter att förvärva en beteendevetenskaplig inspelning på spårning programvara. Spår representerar 20 s verksamhet. (D) totala sömn varaktighet över 24 h är betydligt minskas i tre distinkta populationer av släktet jämfört med surface fisk (envägsavgift ANOVA F(3, 106) = 52.66; Dunnett post hoc-test tillämpades mellan surface fisk och varje grotta befolkningen, P < 0,001). (E) A enda tank som innehåller flera fisk där en arena (orange) görs att spåra sociala interaktioner och sömn. (F) rörelseapparaten spår flera fisk efter datainsamling i spårning programvara (varje färg representerar en individuell fisk). (G) representativa uppgifter av yta och Pachón släktet i sociala sömnspårning. Yta fisk avsevärt minska sömn i 10 L tankar jämfört med 2 L arenor; Yta fisk sömn reduceras ytterligare när fisken är socialt inrymda. Släktet sömn är inte signifikant i någon skick (dubbelriktad ANOVA F(2,46) = 4.545; post hoc-analys utfördes inom varje befolkning att testa effekten av Tankstorlek och välfärdsstaten på sovit totalt 10 L singel, P = 0,013; 10 L sociala, P = 0.0003). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver ett anpassat system för kvantifiering av sömn och rörelseaktivitet i larver och vuxna släktet. Släktet har dykt upp som en ledande modell för att studera utvecklingen av sömn som kan användas för att undersöka den genetiska och neurala grunden för sömn förordning1. De kritiska steg i detta protokoll inkluderar optimering av belysning och video kvalitet för att säkerställa korrekt spårning som är nödvändig för att kvantifiera sömn. Systemet för förvärv och analys som beskrivs här är fullt funktionell, liksom många andra system, både kommersiella och specialbyggda, att kvantifiera locomotion och beteende28,29,30. Den föregående analysen undersöker sömn i enda fisk kan förlängas för att möjliggöra analys av gruppen-inrymt fisk. En betydande faktor när felsökning eller utforma analyser är det förvirrar sociala beteende kan ha på sömnen av en individ. Exempelvis aggression är vanligt i Astyanax, och aggression nivåer variera mellan surface fisk och släktet31. Optimera antalet fiskar, storlek av arena och könskvot, möjliggör för att minimera aggression reproducerbara mätningar av sömn förordning.
En begränsning av tekniken, är som beskrivs, bristande tillförlitlighet efter individuella fiskar under hela analysen. Automatiserad animal tracking växlar ofta djuren när de kommer i nära kontakt. Detta kan åtgärdas genom noggrann optimering av trösklar, eller genom att manuellt korrigera några växlar. Dessutom det beskrivna systemet är inte en genomströmmande system, och därför vattenkvaliteten kan bli ett problem efter inspelningar som varar mer än några dagar. Andra flöde genom system har beskrivits i Zebrafiskar13 och dessa lätt kan tillämpas på sty av mexikanska släktet.
De metoder som beskrivs är betydande på grund av dess breda tillämplighet att mäta beteende i olika fiskarter. Sömn har ännu att präglas i nästan någon Marina eller färskt vatten fisk inklusive spiggar, ciklider och swordtails32,33,34. Mångsidigheten hos detta system att mäta sömn i A. mexicanus och andra fisk-modeller kan behandla olika frågor om evolution och genetiska underbyggnad av sömn. Den maskinvara som är associerad med detta system är mycket kostnadseffektivt, vilket gör det mycket tillgänglig och ger potential för hög genomströmning analys av farmakologiska och ecotoxilogical analys av sömn och rörelseaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIGMS award GM127872 ACK, NINDS award 105072 ERD och ACK, och NSF award 1656574 till kvitt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J.
- Allada, R., Siegel, J. M.
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B.
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
