Summary
여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.
Abstract
초기에 관련 신 경계 의약품의 심사와 그들의 침투와 장벽와 뇌 실질의 상호 작용에 대 한 cellulo BBB 모델에서 신뢰할 수 있는 여전히 충족된 필요. 이 간격을 채우기 위해 우리는 폴 리 에스테 트라이-인간의 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 문화에 의해 형성 된 다공성 멤브레인 문화 삽입 인간의 BBB 모델은 Minibrain와 결합 하 여 BBB-Minibrain, cellulo 모델에서 2D 설계 되었습니다. BBB-Minibrain BBB, 뉴런에이 분자의 특정 대상으로 확인 하 고 약물의 신경 보호 속성 후 보존 되었다 표시를 통해 신경 보호 약물 후보 (예: Neurovita), 전송 테스트를 허용 약 BBB를 교차 했다. 우리 또한 그 BBB-Minibrain 내 피 세포 장벽을 가로질러 바이러스 입자의 흐름을 감지 하 고 neuroinvasive 바이러스 입자는 Minibrain의 감염을 모니터링 하는 재미 있는 모델을 구성 하는 설명 했다. BBB-Minibrain은 신뢰할 수 있는 시스템, 쉽게 치료 또는 모욕 후 연구원 셀 문화 기술에서 훈련 및 뇌 세포 고기의 예측에 대 한 처리. Cellulo 테스트 등의 관심은 두 가지 것: 소개 하는 한편 약물 개발의 초기 단계를 derisking 하 고 다른 한편으로 테스트 하는 동물의 사용을 줄이고.
Introduction
두뇌는 뇌 실질과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 이라는 혈액의 교류를 제한 하는 비 투과성 구조에 의해 조직의 순환에서 분리 된다. 주로 대뇌 내 피 세포의 구성, BBB는 동적 이다, 혈관 주위 microglia 및 이웃 뇌 실질의 신경 상호 작용 합니다. BBB의 세 가지 주요 기능은 생성 및 유지 관리의 영양소와 독성 부상 방지와 뇌의 공급 또는 병원 체1,2에 공헌 하는 신경 기능에 대 한 이온 항상성 뇌 항상성 및 그 기능3의 유지 보수. 이 그래서 몇 가지 약물만 BBB4,5교차 수 있습니다 효율적입니다. 현재, 분자 BBB 통과 되며 뇌에 확산 여부를 예측 하기 위해 사용할 수 있는 방법을 ex vivo 연구 부검 소재, 이미지 추적 MRI (자기 공명 영상) 또는 애완 동물 (위치 방출에 의해 인간의 자원 봉사자의 두뇌에서에 구성 단층 촬영) 또는 pharmacodynamics와 동물6,,78pharmacokinetic 전 임상 연구. 이러한 기술 및 모델 애완 동물의 제한 된 해상도 MRI6,8, 분자 (즉, 예를 들어 항 체 기반 분자)는 가난 하 게 계량 하기 어려움의 낮은 감도 같은 몇 가지 한계를가지고 7뇌 관통 하 고는 전 임상에 대 한 그들의 높은 비용 및 동물 실험의 연구.
마지막 포인트는 3R의 규칙, (대체, 감소 및 동물 실험의 상세) 규제 행정 질문이 연구원은 급히 동물에 과학적으로 정확한 대안을 개발 하기 때문에 중요 한 실험9,10,11,12,13,,1415.
지난 수 십년 동안 여러 체 외 모델 BBB의 제안 되었습니다16,,1718 필터에 배양 하 여 막 마우스, 쥐, 소, 돼지 등 다른 종에서 내 피 세포를 삽입. 마찬가지로 지금까지 인류의 관한 1 차 셀의 부족 하 고 어려운 여부 메시지가 불멸 하 게 뇌 내 피 세포 또는 줄기 세포 인간 파생19,20, 기반 인체 모델을 개발 하는 연구원 21. 이러한 장벽을 BBB의 적절 한 생체 외에서 서로게이트는 내 피 세포 마커, 긴밀 접합 마커, 경과 전송기, 용 질 운반대, 수용 체, 표현 하 고 내 피 자극 20에 응답. 내 피 세포와 다른 세포 유형 (즉, 이다, 신경 또는 pericytes22,23,24) 코팅 필터 막 삽입을 사용 하 여 몇 가지 BBB 모델 분석 했다. 이러한 공동 문화의 목표 이다/신경 또는 pericytes 수용 성 요인의 분 비를 이용 하 여 BBB 물리적 특성을 증가 했다.
그럼에도 불구 하 고, 이러한 모델의 연구 하 고 장벽 통과 되 면 마약 후보자의 운명을 예측 뇌 실질을 포함 되어 있습니다. 따라서, 우리의 목표는에 cellulo를 건설 했다 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, 하나의 키트로 BBB 모델과 혼합된 뇌 세포의 문화를 결합 하 여. BBB-Minibrain multiwell 셀 문화 접시의 우물에 삽입 된 다공성 필터 구성 된 문화 시스템을 사용 합니다. 필터는 인간의 뇌 내 피 세포 선 BBB 약25,,2627, BBB를 테스트에 대 한 신뢰성이 입증 되었습니다 hCMEC/D3 셀으로 입힌 다. Minibrain, 인간의 뉴런의 공동 차별화 된 문화 그리고 이다 NTera/Cl2.D1 셀 선28,29 에서 파생 된 인간 microglial 셀 라인 함께 혼합 켐/Cl530 비율에 해당 하는 microglia31뇌 신경 이다 비율 대 접시의 바닥에 잘 재배 이다.
BBB와 그들의 운명은 실질에 약물의 통로 공부, 외 cellulo 모델에는 혈액-뇌 인터페이스 두뇌 (neuroinvasiveness), 뇌 (neurotropism)에 분산에 병원 체의 항목을 해결 하기 위해 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그리고 그들은 뇌 실질 세포에 독성 (neurovirulence)을 발휘할 수 있다. Neurovirulence 및 neuroinvasiveness 연구는 효율적인 cellulo 모델에서의 개발에서 유익 하 고 대체 동물 모델을 것 이다. 우리 프랑스 Neurotropic 바이러스 스트레인 황열병 바이러스 (즉, FNV YFV33,34)의 준비 하는 데 사용에 드문 바이러스 돌연변이의 neuroinvasive 표현 형 시연 BBB-Minibrain 키트32를 사용 하는 라이브 YFV 백신과 neuroregenerative 및 신경 biomolecule 라는 Neurovita (라고 NV 이제 원고)35의 통행 중단. 때문에 네바다도 자연스럽 게 세포 막 십자가 BBB, NV BBB를 포함 하 여 생물 막 십자가 관통 분자 (CPM)36셀으로 라마의 단일 체인 항 체의 가변 부분 (VHH)와 융합 했다. CPM 속성의 VHH 전자 점과 VHH37의 길이에 의존 것으로 보인다.
Cellulo 테스트에서이 pharmacokinetic 수행 및 동물, 및 이상적으로 긴장에서 그들의 행동을 예측할 수 있을 것 같은 시간에 pharmacodynamics 분석 하기 전에 잠재적으로 BBB를 교차 수 있는 분자 정렬 가능 하 게 한다 실질입니다. 이 시스템은 생물학적으로 적절 하 고 쉽게 설정 하 고 셀 문화26,29,,3038에 잘 훈련 된 전문가 의해 처리. Cellulo 테스트에서 그러한 관심 두 배 것: 한 손으로 전 임상 시험의 비용을 절감 하 고 반면에 동물 실험의 사용을 줄이고.
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Protocol
1. 세포의 Ntera/CL2 문화 작품. D1 포스트 mitotic hNeurons 및 hAstrocytes (NT2-없음)의 공동 문화를 준비 하
참고: 이것은 Minibrain (그림 1)의 구성 요소입니다.
- Ntera/Cl2.D1을 배양
- 액체 질소 탱크에서 냉동된 셀의 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
- 37 ° C 물 욕조에 빠르게 셀 동
- 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 (Dulbecco의 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 매체) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린와 100 µ g 스 보충 (즉, 완료 DMEM F12 매체)입니다.
- 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 완전 한 DMEM F12 매체의 2 mL에 펠 릿 해리
- 민감한 부착 세포에 대 한 구체적인 치료와 폴리스 티 렌에서 T75 조직 배양 플라스 크에 전송 (T75Cell+) 포함 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 13 mL.
- 문화 인큐베이터 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 와 95% 습도 유지에 셀 (즉, 약 5 일). 보통 2-3 일 마다 변경 합니다.
- Subculturing Ntera/Cl2.D1 및 증폭
- 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
- EDTA 솔루션 (실시간 유지) 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
- 트립 신-EDTA 솔루션 (0.05 %trypsin, 0.02 %EDTA)의 3 개 mL를 추가 하 고 실시간에 2 분을 품 어
- 플라스 크를 흔들어 하 고 셀은 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
- 비활성화는 트립 신, 15 mL 튜브에 실시간에 200 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 전송 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL을 추가
- 완전 한 매체의 10 mL와 펠 릿을 해리 하 고 1 mL를 사용 하 여 각 새로운 플라스 크를 포함 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL 접종.
참고: 30 T75 셀+ 플라스 크는 각 차별화 필요 합니다. - 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 플라스 크를 품 어.
- 인간의 신경-사이토 공동 문화에 NTera/Cl2.D1의 차별화
참고:이 Minibrain의 구성 하는 주요 요소입니다.- 0 일에서 트립 신-EDTA 1.2 단계에서 설명한 대로 셀을 해리 하 고 완전 한 DMEM F12 매체의 2 mL와 함께 각 플라스 크의 셀 펠 릿 해리.
- 완전 한 DMEM F12 매체의 11 mL를 포함 하는 85 m m 지름의 60 플라스틱 접시에 세포 현 탁 액 (5 x 106 셀에 해당)의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 셀 플라스틱에 첨부 하지 것입니다 및 양식 의사 neurospheres ( 그림 1의 아래쪽 패널에 사진 참조)를 집계 합니다. 1 일 동안 37 ° C, 5% CO2 와 95% 습도 60 페 트리 접시를 품 어. - 하루 1, 모든 트랜스 Retinoic 산 (ATRA) 페 트리 접시 (최종 농도 ATRA 10 µ M) 당 130 µ M로 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 24 h에 대 한 95% 습도에서 요리를 반환 합니다.
- 하루 2, 매우 신중 하 게 각 Petri Dish 50 mL 튜브에 50 x g 에서 10 분 원심 분리기 및 실시간 Dissociate 셀 분야를 신중 하 게 10 µ M ATRA와 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 13 mL와 느슨한 펠 릿 포함 하는 매체를 전송 하 고 일 추가 e 새로운 85 m m 직경 페 트리 접시 13 mL.
참고: 다른 구절입니다 (즉, 약 70%의 밀도) 주 2에서 얻은 밀도 높은 영역 밀도 유지 하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 영역 밀도 낮추는 경우 셀의 수에 따라 접시의 총 수를 줄입니다. - 4, 6, 8 일에는 위 절차 (1.3.4 단계)를 반복 합니다.
- 10 일, 위의 절차를 반복 하지만 T75 셀+ 플라스 크 배양 접시 대신에 구체를 추가. 한 페 트리 접시에서 한 T75 셀+ 플라스 크에 셀을 추가 합니다.
- 일 11, 13, 15, 17, 10 µ M ATRA와 보완 하는 완전 한 DMEM F12의 14 mL와 함께 사용 된 매체를 변경 합니다.
- 하루 19 14 mL 플라스 크 당 ATRA 없이 완전 한 DMEM F12 매체와 매체를 변경 합니다.
- 하루 20 해리 부드럽게 트립 신/EDTA와 셀 다음과 같습니다.
- 각 T75 셀+ 플라스 크에 10 mL PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +; 보충의 셀 린스 실시간 5 분 EDTA의 4 l 셀을 품 어
- EDTA를 신중 하 게 제거 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 및 실시간 쉐이크 아주 부드럽게 플라스 크에서 7 분을 품 어 하며 완전 한 DMEM F12 매체의 신중 하 게 8 mL을 추가
- 원심 분리기 10 g 및 실시간 x 160 분에 대 한 완전 한 DMEM F12 매체의 13 ml에서 셀 펠 릿 및 전송 T75 셀+ 플라스 크에서 해리.
참고: 트립 신-EDTA와 매우 부드러운 분리 플라스틱 도자기에 강력 하 게 연결 된 원래 teratocarcinoma 세포에서 세포 분화는 ATRA 복구 수 있게 됩니다.
- 하루 21, 매체와 죽은 세포를 제거 합니다. 추가 5% 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL FBS, 2 mM 글루타민 100 IU 페니실린, 100 µ g 스, 아크 (시 토 신 β-D-arabinofuranoside)의 0.5 µ M (완료 5% FBS DMEM F12-아크).
- 일 23, 25, 28, 바꾸기 사용 매체 14 mL 5% FBS DMEM F12-아크.
- 49 (매 2 일)까지 일 29, 바꾸기 사용 14 mL 5% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 IU 페니실린, 100 µ g 스, FudR (5-플 루 오로-2' deoxyuridine)의 5 µ M 및 10 µ M로 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체와 매체 Urd (Uridine) (전체 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
- 하루에 50, 5 %FBS, 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린, 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL와 함께 사용 하는 바꾸기 매체에서 100 µ g 스와 10 µ M Urd (완료 5% FBS DMEM F12-Urd).
- 95 (주 2 회)까지 일 51, 바꾸기 사용 매체 전체 5%의 14 mL FBS DMEM F12-Urd.
참고: 하루 51에서에서 실험에 대 한 사용 하지만 95 보다 나중이 아니라 셀 수 있습니다. 유사 분열 억제제와 직렬 처리를 사용 하 여 포스트 mitotic hNeuron 및 hAstrocytes (NT2-없음)의 공동 문화의 순수한 인구를 복구 수 있습니다. - 셀을 시드하 진행 부드러운 trypsinization 하루 20에 대 한 설명 된 대로.
2. 세포 문화 작품 인간 microglial의 세포 켐/Cl5
참고: 이것은 microglial 구성 요소는 Minibrain의 (그림 1).
- 켐/Cl5 세포 배양 인간 microglial
- 액체 질소 탱크에서 냉동된 셀의 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
- 37 ° C 물 욕조에 빠르게 녹여.
- 5% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 IU 페니실린와 100 µ g 스 (즉, 전체 5% FBS DMEM F12 매체) 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.
- 전체 5% FBS DMEM F12 매체의 2 mL와 펠 릿 실시간 Dissociate에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
- 포함 하는 완전 한 5% FBS DMEM F12 매체의 13 mL T75 셀+ 플라스 크에 전송 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 와 90% 합류까지 95% 습도에 문화 세포. 보통 2-3 일 마다 변경 합니다.
- Subculturing 인간 microglial 셀 켐/Cl5
- 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
- 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충 PBS의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
- EDTA 솔루션 (실시간 유지) 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
- 트립 신-EDTA 솔루션의 3 개 mL를 추가 하 고 실시간에 2 분을 품 어
- 플라스 크를 흔들어 하 고 셀은 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
- 비활성화는 트립 신, 한 15 mL와 g 및 실시간 x 200에서 5 분 동안 원심 분리기 전송 완료 5% FBS DMEM F12 매체의 10 mL을 추가
- 완전 한 매체의 10 mL와 펠 릿을 해리 하 고 1 mL를 사용 하 여 각 새로운 플라스 크를 포함 하는 완전 한 5% FBS DMEM F12 매체의 14 mL 접종.
- 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 플라스 크를 품 어.
3. 문화 사용 코트 다공성 삽입 및 BBB 준비 hCMEC/D3
- 인간의 내 피 세포 hCMEC/D3 (그림 2) 경작
- 유형 1:30 살 균 증류수 (셀 문화 등급)와 함께 콜라겐을 쥐를 희석.
- T75 셀+ 플라스 크에 10 mL를 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도 인큐베이터에 2 h를 품 어.
- 콜라겐 솔루션을 제거 하 고 내 피 세포 매체 10 mM HEPES (완전 한 내 피 세포 매체 라고도 함)의 보충의 15 mL와 함께 그것을 대체.
- 액체 질소 탱크에서 셀의 cryo 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
참고: 셀 성장, 그리고 씨앗 많은 제조 업체에 의해 설명 되었다. 셀 라인 생물학 자료 전송 계약에 의해 덮여 있다. 셀 통로 번호 25에서 가져온 고 통과 35 보다 더 사용할 수 없습니다. - 37 ° C 물 욕조에 빠르게 녹여.
- T75 셀+ 플라스 크에 세포를 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 2 ~ 4 h 95% 습도에 플라스 크를 반환 합니다.
- 또는 셀을 제거 하지 않고 신중 하 게 매체를 제거 합니다. 한 번 완전 한 내 피 세포 매체의 10 mL와 함께 셀 린스.
- 완전 한 내 피 세포 매체의 15 mL를 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 와 매체를 변경 하지 않고 100% 합류 (4 일 미만)까지 95% 습도에 문화 세포.
- Subculturing hCMEC/D3 BBB의 삽입을 준비 하
- 새로운 T75 셀+ 플라스 크 코트 또는 삽입 유형 나 쥐 콜라겐 (3.1 단계) 위에서 설명한 대로.
- 플라스 크에서 매체를 제거 합니다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충 PBS의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
- 트립 신-EDTA 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에서 5 분을 품 어
- 플라스 크를 흔들어 하 고 세포가 완전히 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
- 비활성화 된 트립 신을 완전 한 내 피 세포 매체의 4 mL를 추가 합니다.
- 플라스틱 피 펫 5 mL와 기계적으로 발음 하 고 플라스 크의 바닥에 5 mL 피 펫 5 배 이상 유지 하는 동안 세포 현 탁 액을 내뿜는 여 셀 해리.
- 셀의 개수 및 사용 5 x 104 셀/12 잘 폴 리 에스테 르 막 문화에 대 한 삽입 삽입 삽입 및 T75 셀+ 플라스 크에 대 한 2 x 106 셀. 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입과 함께 PELy (즉, 단락 4.2 아래 노란색 루시퍼 참조에 내 피 세포 침투성) 실험에 대 한 셀 없이 3 개의 필터를 준비 합니다.
- 플라스 크 또는 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 삽입 100% 합류까지 품 어.
- 새로운 통로까지 T75 셀+ 플라스 크에 대 한 매체를 변경 하지 마십시오. 폴 리 에스테 르 막 문화에 BBB에 대 한 반대로 삽입: 2-4 일에 매체를 변경, 실험을 위한 BBB를 사용 하 여 주 6에서.
4. 건설 및 BBB-Minibrain (그림 2)의 품질 관리
- BBB-Minibrain 폴리에스터 설정 막 문화 삽입 장치 (그림 2B)
- 12 hCMEC/D3 셀 잘 폴리에스터 성장 막 문화 실험을 위해 그들을 사용 하기 전에 내 피 세포 매체에 6 일에 대 한 필터를 삽입.
- 폴 리-D-라이 신 (1 mL/음, 10 µ g/mL, RT에서 4 h)와 다음 (1 mL/음, RT에서 하룻밤 1 µ g/mL) laminin 12 잘 플레이트 코트.
- Laminin를 제거 하 고 추가 5% 보완 하는 내 피 세포 매체의 1 mL FBS (5% 내 피 세포 매체).
- 1 h 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 품 어.
- 부드럽게 NT2-없음 (단계 1.3.9에서에서와 같이) 및 켐/Cl5 (단계 2.2에서에서와 같이) trypsinize와 완전 한 내 피 세포 매체와 셀 펠 릿 해리.
- 계산 셀, 믹스 3.6 × 105 NT2-없음, 105 켐/Cl5 셀/잘 씨 12 잘 플레이트 x 0.4.
- T = 24 h (시드 후 24 h): 신선한 완전 한 내 피 세포 매체 (Minibrain 세포와 내 피 세포)와 사용 된 매체를 변경 하 고 hCMEC/D3 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 Minibrain 셀 상단 전송. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
참고: BBB-Minibrain 다음 이루어져 있을 것 이다 인간 내 피 세포 hCMEC/D3 luminal 구획 (또는 "혈액" 구획)를 분리 하는 필터와 인간 세포 hNT2-n/A 및 잘 정의의 밑에 hCHME/Cl5 (Minibrain)의 혼합된 문화 계층 abluminal 구획 (또는 "두뇌" 구획) (그림 2B).
- BBB-Minibrain (품질 관리) (그림 2C)의 내 피 침투성의 유효성 검사
- 전송 버퍼 (TB)는 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 10 mM HEPES와 1mm 나트륨 pyruvate 보충 HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼를 준비 합니다.
- 잘 당 전송 버퍼의 1.5 mL 12 잘 접시를 준비 합니다.
- T = 0, 신선한 확인 전송 버퍼 루시퍼 노란색 (LY-TB) 50 µ M으로 보충.
- 각 필터는 내 피 세포 장벽을 영향을 주지 않고 매체를 신중 하 게 제거를 거꾸로 되돌립니다.
- 필터를 채워진된 12 잘 접시에 놓고 LY TB의 0.5 mL를 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 접시를 품 어.
- T = 10 분 전송에서 새로운 TB에 필터 12 잘 접시 가득 하 고 OD 독서에 대 한 첫 번째 접시의 abluminal 구획을 유지.
- T = 25 분, 4.2.7 단계를 반복 합니다.
- T = 45 분, 격판덮개에서 필터를 제거 하 여 전송을 중지 합니다. 외경 측정에 대 한 luminal 구획과 abluminal를 유지.
- 전송 어두운 96에서 잘 접시 샘플: 190 µ L 결핵 luminal 구획과 히 결핵에 대 한 abluminal 구획에 대 한 샘플의 200 µ L 10 µ L.
- LY-TB의 형광을 측정 λ428 nm λ535 nm에 다른 샘플에 존재 (여기 및 방출 길이 파도 각각).
- LY-TB (PeLY) Siflinger-Birnboim, A 외. (1987)39 와 다 코스타, 수식을 사용 하 여 A 외. (2018)34 쪽으로 내 피 침투성 (Pe)을 계산.
1/PSe = (1/태평양 표준시)-(1/PSf)와 PeLY= PSe/미
참고: PSf는 셀 없이 필터의 침투성, PSt는 세포와 필터의 침투성, PSe는 단층, S의 표면에 단층의 표면 이다 내 피 단층에 침투성 (12 잘 필터 = 1.12 m2 ), Pe정 은 cm/min로 표시 됩니다. HCMEC/D3 PeLY 0.7 1.2 x 10 사이 여야는 실험에 사용-3 cm/min에 따라 주로 FBS. 중요: PeLY 보다 1.2 의미 BBB는 꽉 충분히 일부 누설은 관찰 될 수 있다. 이 방 벽을 삭제 합니다.
5. BBB-Minibrain 황열병 바이러스 백신 샘플, 프랑스 Neurotropic 바이러스, YFV-FNV 34 (그림 3) 에서 신경 침입 바이러스 성 입자의 존재를 강조 하기 위해 사용
- BBB 건너와는 Minibrain에 있는 황열병 바이러스의 곱셈
- 준비 단계 4.1.7 24 h; 바이러스의 추가 하기 전에에서 설명 된 대로 BBB-Minibrain를 사용 하 여 2 %FBS 내 피 세포 매체에 의해 매체를 교체 합니다.
참고: 바이러스를 추가 하기 전에 단지 매체를 변경 하는 피하기 위해 매우 중요 하다. 매체 변경 인간의 내 피 세포를 활성화 하 고 정도 바이러스의 통과 수 있도록 장벽을 열 수 있습니다. 여기는 매체 실험을 시작 하기 전에 24 시간을 변경 됩니다. - T = 0, 3500 플 라크 형성 단위 (PFU) YFV-FNV의 2%의 50 µ L에 희석 FBS 내 피 세포 매체 luminal 구획 위에 매우 신중 하 게 추가 합니다. BBB-Minibrain 컨트롤 바이러스 없이 2 %FBS 내 피 세포 매체의 50 µ L로 접종 이다. 동반자에 PeLY 를 잘 확인 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
- 24 시간 후 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 장치를 제거 하 고 PeLY, 샘플 1 mL abluminal 구획에서 결정 한 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 바이러스 적정. 신선한 2 %FBS 내 피 세포 매체와 매체를 교체 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
- 72 h 후 샘플 abluminal 구획에서 매체 바이러스, 적정 및/또는 유전자 표정 분석 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 대 한 Minibrain 세포에서 RNA를 추출.
- 준비 단계 4.1.7 24 h; 바이러스의 추가 하기 전에에서 설명 된 대로 BBB-Minibrain를 사용 하 여 2 %FBS 내 피 세포 매체에 의해 매체를 교체 합니다.
- YFV-FNV Minibrain 셀 직렬 구절에의 neurotropic 이체의 증폭
- 사용 Minibrain 셀 12 잘 플레이트 (즉, 단계 4.1.6 4.1.7) 코팅.
- 시간 0 h 포인트 3500 플 라크 형성 단위의 YFV-FNV (luminal 구획) 셀 위에 매우 신중 하 게 2 %FBS 내 피 세포 매체의 50 µ L에 희석 추가.
- 1 시간 후 바이러스 inoculum와 매체를 제거 하 고 신선한 2 %FBS 내 피 세포 매체를 바꿉니다.
- 48 h 후 문화 매체의 500 µ L를 샘플 하 고 신선한 Minibrain 세포를 감염
- 120 h 후 문화 매체의 500 µ L를 샘플 하 고 신선한 Minibrain 세포를 감염.
- 192 h 후 배양 (바이러스 주식 농축 =) 저장 하 고 유전자 표정 분석 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 대 한 Minibrain 세포에서 RNA를 추출 합니다.
6. BBB-Minibrain BBB 교차와 뇌 세포는 biomolecule의 대상으로 공부 하기의 사용
- 타겟팅 biomolecule 신경의 BBB를 통해 전송
- Minibrain-BBB 4.1.7 설명 단계로 준비를 사용 합니다.
- 시간 시점 0 h는 biomolecule 추가 (예제 삽입 58.75 ng/BBB 셀 permeant NeuroTag NV 분자의 BBB-Minibrain 당 추가 된 결과 섹션에서 제공 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
- 24 시간 후 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 장치를 제거 하 고 PeLY, 결정 hNeurons neurofilament Nf200 Minibrain 셀을 얼룩 그리고 (결과에 제공 된 예제에서에서 Minibrain에는 biomolecule의 존재를 감지 섹션, NeuroTag-NV 검색 되었습니다35,40포함 Strep 태그에 대 한 지시는 항 체를 사용 하 여).
- biomolecule BBB 넘 후 neuroregenerative biomolecule는 Minibrain 분석 결과 후속 신경의 BBB를 통해 전송
- Minibrain-BBB 준비 단계 4.1.7에에서 설명 된 대로 사용 합니다.
참고: 신경만을 대상으로 하는 분자에 대 한 Minibrain 세포는 신경 세포 (NT2-N)만38로 교체할 수 있습니다. - 시간이 시점에서 0 h, 셀 permeant NV 분자 (활성 폼 CPM-NeuroTag-NV, 비활성 양식 CPM-NeuroTag-NVΔ) C. Prehaud 그 외 여러분 (2014)35에 의해 설명 된의 58.75 ng/BBB-Minibrain를 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
- 4 h 후 주사 바늘 개별 상처 확인 (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, 벨기에) Minibrain 세포에. 각 개인에 적어도 10 스크래치를 잘 확인 합니다. 동반자에 PeLY 를 잘 확인 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
- 8 h 후 신선한 완전 한 내 피 세포 매체에 의해 abluminal 구획에 매체를 교체 합니다.
참고: 그것은 Minibrain 세포의 부상으로 이어질 수 있습니다 세포 죽음 그리고 세포 독성 화합물의 릴리스 이후이 단계에서 매체를 대체 하는 것이 중요. - 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
- 48 h 후 hNeurons C. Prehaud 그 외 여러분 (2013)40에 의해 설명 된 대로 축 삭 재생을 위해 셀 스테인드.
- Minibrain-BBB 준비 단계 4.1.7에에서 설명 된 대로 사용 합니다.
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Representative Results
BBB-Minibrain에서 cellulo 실험은 혈액-뇌 인터페이스의 모델.
BBB-Minibrain는 상위 레벨에 혈액 구획 및 혈액-뇌 인터페이스 (그림 2AB)의 낮은 수준에 두뇌 구획을 모방 하기 위해 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 시스템에 설정 됩니다. BBB 형성 필터에 hCMEC/D3 내 피 세포와 luminal 구획 및 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 Minibrain 인간의 트라이 문화를 포함 하는 abluminal 구획 그것에 의하여 이루어져 있다. Minibrain 셀 클래식 트라이 문화 인구 표현 형 (그림 1, 하단 오른쪽 패널)과 급행 특정 셀 다 코스타 A. 외 알., 201834에서 같이 각 유형의 혼합을 전시 한다.
BBB-Minibrain에서 hCMEC/d 3 층의 사용 0.95e의년 평균 Pe와 함께 강한 방 벽을 취득 허용-03 cm/min과는 말은 트랜스 내 피 전기 저항 (TEER) 51.89 Ω/c m2의. 이러한 값은 이러한 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 시스템 (그림 2C)에 인간 내 피 세포 선27,41 에 대 한 설명도 최고의 값의 범위입니다. 이러한 세포 조 1 등 cadherin 침투성 정량화 (데이터 표시 되지 않음)으로 예상 대로 꽉 접합 단백질 마커를 표현 한다. 그들은 또한 표현 하는 수용 체, 경과의 모든 하위 집합 전송기 또는 전송기 [수용 체: LDLR, 저밀도 지 단백질 수용 체; LRP1, 저밀도 지 단백질 수용 체 관련 된 단백질 1; INSR, 인슐린 수용 체; LEPR, leptin 수용 체; 루, 기저 세포 접착 분자; TFRC, CD71 항 원; 어른, glycosylation 최종 제품 수용 체 고급 경과 전송기: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 단백질; ABCC5, ABCC5 단백질 전송기: STRA6, retinoic 산 성 유전자 6 단백질;에 의해 자극된 SLC2A1, 포도 당 운송업 자 입력 1; SLC7A5, 큰 중립 아미노산 운송업 자 1; SLC1A1 용 질 운반대 가족 1 단백질; SLC38A5, 용 질 운반대 가족 38 회원 5 단백질; SLC16A1, monocarboxylate 수송 단백질 1], 그들의 생물 학적 기능 (그림 2D)21에 대 한 주요 관련 단백질입니다.
BBB-Minibrain 선택, 증폭 및 라이브 바이러스 백신 준비에서 드문 neuroinvasive 바이러스 변종 수 있습니다.
BBB-Minibrain 문화 장치에 cellulo 테스트할 수 있도록 격리와 드문 neuroinvasive/neurovirulent 이체의 증폭 잠재적으로 현재 황열병 바이러스에서 (YFV) 라이브 바이러스 백신42로 사용 되었다. YFV은 viscerotropic 바이러스를 대상으로 효율적으로 BBB를 교차 하지 않는 간. 프랑스 neurotropic 바이러스, FNV, 1980 년대33,43까지 라이브 YFV 백신으로 사용 되었다. FNV 어린이 vaccinees 중 0.4% (0.3) 후 vaccinal neuropathogenesis을 발견 하 고 따라서 198233,43에 단종 되었습니다. 우리는 neuroinvasive/neurovirulent 변종42,44의 높은 비율을 포함할 수 있는 YF 바이러스의 프로토타입으로 FNV 여기를 사용. FNV 바이러스 준비 (즉, 3500 PFU/ml)는 컨트롤은 BBB-Minibrain 모의 감염 되었던 luminal BBB-Minibrain, 구획에 추가 되었습니다. Luminal 구획에서 바이러스 입자의 존재 Pe 바이러스 우물에서정 제어 우물 (0.80 ± 0.09 x 10-3 c m/min의 Pe서둘러 다른 없었기 때문에 장벽 침투성 측정 24 h 후를 변경 하지 않습니다. 그리고 0.86 ± 0.09 x 10-3 cm/min Pe정 에 대 한 제어 및 YFV-FNV 우물 각각). Abluminal 구획의 콘텐츠 패 분석 결과, 24 시간 게시물 감염에 의해 바이러스의 존재에 대 한 평가 했다. Minibrain 세포 뇌 세포에 있는 neuroinvasive 이체의 증폭을 평가 하 고 만화 그림 3A에 표시에 설명 된 모니터링으로 유전자 발현을 하 incubated 이틀 했다.
우리는 24 h (의미 43 PFU/mL)에서 BBB를 교차할 수 있는 몇 가지 YFV FNV 바이러스 감지. 바이러스는 뇌 세포 안에 바이러스의 곱셈에 의해 다음 2 일 동안 증폭 했다 (4.69 x 10의 titer 의미4 PFU/mL), (그림 3B). 노트, 백신 긴장 준비는 후 vaccinal neuropathogenesis를 발생 하지 않습니다 것이 효율적으로 교차 하지 BBB이이 시스템에로 다 코스타 A. 외. (2018)34에 의해 증명 되었습니다. 우리는 바이러스의 증식의 두 생체 식별:는 인터페론 자극 15 (ISG15) 유전자와 인터페론 규정 요소 7 (IRF7). 이 neuroinvasive 바이러스 인구는 직렬 Minibrain 셀 (그림 3C)에 passaged 때 이러한 두 생체의 식은 자극 했다. 이 upregulations Q-RT-PCR에 의해 측정 되었다 바이러스 부하 (피어슨 p 값 0.0016 ISG15 및 0.0260 IRF7)을 엄격 하 게 상관 된다.
BBB-Minibrain 수 있습니다 두 시 금 장벽 통과 biomolecule 능력과 biomolecule 함수 BBB 횡단 후 보존 되었다 여부 같은 시간 테스트에.
NV biomolecule neuroprotection 및 neuroregeneration40의 놀라운 속성을 소유 하는 광견병 바이러스에서 파생 된입니다. 나도 자연스럽 게 세포 막도 BBB를 교차 하는이 작은 polypeptide CPM 뉴런을 대상 수 융합 했다. 우리의 선택은 라마 교차45 BBB36,및 NeuroTag 뉴런을 구체적으로 타겟팅을 포함 한 생물 막의 단일 체인 항 체의 변수 부분 (VHH)를 사용 하 여 했다. NV는 VHH 및 NeuroTag, CPM-NeuroTag-NV (그림 4A)를 구성 하 고는 CPM-NeuroTagΔ-NV 뉴런 (그림 4B)의 대상으로 허용 하는 특정 NeuroTag 부족 구성에 vhh 연결 되었다. Luminal 구획에 추가 되 고, 후 CPM-NeuroTag-NV (녹색 점) BBB를 교차 하 고 대상 (빨간색)으로 인간의 신경 수 있었습니다 (그림 4C, D). CPM-NeuroTagΔ-NV 내 피 세포 장벽 (녹색 점)를 교차 하지만 덜 효율적으로 인간의 뉴런 (신경 세포 밖에 있는 녹색 점 들의 대다수) 대상 (그림 4D).
위에서 설명한 대로 NV CPM-NeuroTag-NV를 구성 하는 VHH는 NeuroTag에 연결 했다. 우리 같은 위해 했다 NVΔ NV의 비활성 형태 NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (그림 5A)의 활성 부분을 부족. Luminal 구획에 추가 되 고, 후 CPM-NeuroTag-NV BBB를 교차 하 고 CPM-NeuroTag-NV Δ NV (그림 5B, 왼쪽의 비활성 형태를 (그림 5B, 오른쪽 패널), 반대로 부상 후 인간의 뉴런의 축 삭을 다시 생성할 수 있었다 패널)40. 이러한 속성은 프로토콜;의 두 가지 유형으로 분석 했다 어느 사전-노출 (그림 5C) 또는 게시물 노출 프로토콜 (그림 5D). 때 (4 h, H4) 긁 적 축 삭 전에 적용, CPM-NeuroTag-NV 트리거 부상된 뉴런의 neuroprotection와 axonal 재생 반대로 mock의 셀 (예: 컨트롤) 또는 처리 셀 CPM-NeuroTag-NVΔ (평균 처리 재생 91%와 12%-10% 각각 그림 5C). CPM-NeuroTag-NV Δ, (장애인 형태의 반대 축 삭 재생 수는 때는 biomolecule 사후 노출 치료 프로토콜, CPM-NeuroTag-NV를 모방 하기 위해 axonal 장애 (1 시간, H1, 그림 5D) 후 적용 된 각각 85%와 5.1% 재생을 의미) (그림 5D).
그림 1: The Minibrain 모델. NT2 없음 및 켐/Cl5 문화 (위 패널)의 시간을 테이블. 원래 셀 라인 (Ntera/cl2의 사진 (낮은 패널). D1) 왼쪽된 패널에서 의사 neurospheres 오른쪽 패널에서 켐/Cl5, 중간 낮은 패널 및 Minibrain triculture (크리스탈 바이올렛 얼룩), 중간 상단 패널에 ATRA 치료 후 얻은 NT2 없음 및 켐의 혼합물의 결과 / CL5 문화입니다. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: BBB-Minibrain 모델. A. hCMEC/D3 문화와 BBB-Minibrain 장치의 사진 시간 일정: 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입-필터 hCMEC/D3 내 피 방 벽을 12의 한 영역에 삽입할 수 웰 스 셀 문화 판 전에 forcep으로 개최 됩니다. B. 내 피 세포 장벽을 포함 luminal (혈액) 구획 및 Minibrain 세포 (인간의 신경, 이다 microglial 세포) 포함 하는 abluminal (뇌) 구획 장치를 설명 하는 만화. C.에 3 개의 장치 또는 5 필터에 LY (즉, Pe정)을 침투성 TEER (즉, TransEndothelial는 전기 저항)에 의해 BBB-Minibrain permeabililty의 대표적인 측정. D. q-RT-PCR 수용 체, 경과 전송기 및 전송기의 내 피 세포 hCMEC/d 3에 의해 식 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: The BBB-Minibrain 모델에서는 라이브 YFV 백신 준비 중 neuroinvasive 이체의 id. A. 는 실험의 일정. B. 플 라크 형성 단위 (PFU) 적정 (각 지점 대표 한 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 실험) 라이브 바이러스의 의해 BBB 넘어 바이러스의 정량화. C. ISG15 와 IRF7 유전자 발현의 바이러스 부하에서 바이러스 성 입자의 수의 기능으로 q-RT-PCR에 의해 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4:는 BBB-Minibrain neuroregenerative biomolecule 속성 테스트를 수: NV NeuroTag 융합은 뉴런의 특정 대상. A. 만화는 CPM의 기반 NV (즉,: CPM-NeuroTag-NV) 특별히 신경을 대상으로 특정 NeuroTag를 포함 하. B. 만화는 CPM의 NV NeuroTag (즉,: CPM-NeuroTagΔ-NV)의 삭제를 기반으로. C. 인간의 뉴런의 대표적인 면역 형광 사진. 바 50 µ m. NF 200에서 레드, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV 파란색에서 녹색, 핵에서 확장. D. CPM-NeuroTag-NV 분자 BBB를 교차 하 고 노출 당-NeuroTagΔ-NV 보다 더 효율적으로 인간의 신경 세포를 대상 수 있습니다. 감염 된 신경 세포와 신경 세포의 전체 인구는 immunolabeling 후 triplicate 슬라이드에 계산 했다. 총 신경 NF200 긍정적인 셀 (빨간색)에 해당합니다. 하나 이상의 녹색 점 (CPM-NV)와 관련 된 레드 셀 긍정적인 신경 계산 됩니다. 짝이 없는 학생의 t-검정 꼬리 2 * * *p = 0.0002. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5:는 BBB-Minibrain neuroregenerative biomolecule 속성 테스트를 수: BBB 횡단 NV의 neuroregenerative 속성을 변경 하지 않습니다. A. 만화는 CPM의 NV (즉, CPM-NV) 및 장애 대응 (즉, CPM-NVΔ)를 기반으로. B. 축 삭 재생 CPM 네바다 cellulo에 스크래치 분석 결과 (오른쪽 패널). CPM NVΔ 축 삭 재생 (왼쪽된 패널), 스케일 바 100 µ m. C를 실행할 수 없습니다. CPM 네바다 교차 하는 내 피 세포 수 및 재생성 BBB-Minibrain 적용 될 때의 신경에서 축 삭 병 변 전에 4 h: (상단 패널) 당연히 실험; (하단 패널)는 중생의 정량화. D. CPM NV에도 활성화 됩니다는 치료 프로토콜 부상 후 1 시간 적용 되는 경우: (상단 패널) 당연히 실험; (하단 패널)는 중생의 정량화. 짝이 없는 학생의 t-검정 꼬리 2 * * *p < 0.0001. 재생 triplicate 실험에서 계산 되었다 (> 800 신경 계산) 후 신경 세포의 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에서 우리는 cellulo을 구축 하는 방법을 시연 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, BBB 모델과의 문화를 결합 하 여 하나의 키트로 뇌 세포 (Minibrain) 뇌를 혼합. 이 시스템은 생물학으로 관련, 쉽게 설정 하 고 세포 배양에서 잘 훈련 된 경험에 대 한 처리.
BBB의 다른 어떤 생체 외에서 모델에 관해서는 장벽의 견고의 과감 한 제어 적용 되는 경우 신뢰할 수 있는 결과 얻을 것 이다. 침투성 및 부적당 한 침투성 값 (즉, Pe정 1.2 보다 더 높은)와 모든 삽입을 폐기 해야 합니다에 대 한 삽입은 신중 하 게 테스트 되어야 합니다.
FBS 샘플 BBB의 특성을 해제 하지 않는 한 일괄 처리를 식별 하기 위해 신중 하 게 시험 되어야 한다. 동일한 통보는 바이러스에서 입자 또는 생체 희석은 자동차 매체에 관한 만들 수 있습니다. 그것은 또한 luminal 구획의 중간 구성 변경 하지 위해서는 biomolecule 또는 바이러스 정지, 볼륨을 가능한 작게 유지 하는 것이 좋습니다. Ntera/CL2에서 인간의 공동 문화 신경/이다 문화 분화 D1은 검증 된 기술입니다. 포스트 mitotic는 인간의 신경, 달리 이다는 여전히 셀을 분할. 이다 세포의 높은 확산은 때때로 관찰 된다. 이 경우, Minibrain 문화 삭제 됩니다 있다. 우리가 우리의 실험실에 사용 되는 켐/Cl5 셀 phenotyped는 그들이 인간의 기원 (호모 사피엔스 CCNT1 형질)의 증명 했다. 일부 실험실에서 사용 하는 일부 켐 많은 쥐 (Rattus norvegicus) 기원 (2017)46가르시아-메사 Y. 연구진이 주장 될 수 있는 위험이 있다. 따라서, 켐/Cl5 셀 라인의 기원에 대 한 확인 하는 것이 좋습니다.
Minibrain 트라이-문화 시스템 포스트 mitotic 신경 (주로 dopaminergic)를 포함 하 여, 이다, microglial 셀 선 단순화 된 대뇌 환경을 모방 합니다. 이 시스템은 여전히 개선할 수 있습니다. 하나 추가 하는 oligodendrocytes myelinated 축 삭 또는 기본 microglial 세포를 얻기 위해 목표 문화에 상상할 수 있다. minibrain 줄기 세포 인간 파생19,,2021의 혼합된 문화 또한 대체 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 셀의 다른 많은 사이 변화는 신중 하 게 마스터 할 것 이다. BBB-Minibrain 복잡성 또한 pericytes23을 추가 하 여 늘릴 수 있습니다. 우리의 손에이 개선 pericytes의 인간의 기원에 대 한 신뢰할 수 있는 액세스를 어려움에 의해 장애가 되었다.
우리 타당성과 i) 속성을 통해 BBB, 두뇌를 입력 진화 황열병 백신 샘플에서 드문 neuroinvasive 바이러스 입자를 분리 하는 혈액-뇌 인터페이스를 흉내 낸이 키트의 유용성을 증명 하고있다 그리고 ii) Minibrain 트라이-문화 단순화 된 뇌 실질을 흉내 낸에이 neuroinvasive 부분 모집단을 증폭. 미래의 응용 프로그램 유행 성 이하선염 백신 등 다른 라이브 백신의 품질 관리를 확장 하 고 생체 외에서 neurovirulence 기능을 공부 하는 의미로 BBB-Minibrain를 홍보 수 있습니다.
두 번째 파일럿 연구 약물 후보 BBB를 통과 하 고 신경 재생 속성을 잃지 않고, Minibrain에 도달 했다. 우리는 강하게 BBB-Minibrain 전 임상 테스트를 발표 하기 전에 분자의 사전 정렬에 주요 발전을 허용할 수 있다 확신 합니다. BBB-Minibrain를 사용 하 여 테스트 reglementary 분석 실험 및 실험 연구를 위한 동물의 사용을 줄이는 겨냥 3Rs 조치의 이행을 용이 해야.
전부 철에 접근 (컴퓨터 모델)의 다음 개발, 우리는 곧 있을 BBB, cellulo 긴장 실질 혈액을 흉내 낸에 3D 모델의 개발을 건너의 높은 확율을 가진 약물 후보를 식별할 수 인터페이스 큰 도움이 될 것 이다.
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Disclosures
시스템의 지적 재산권은 특허 32, 35 , 38참조.
Acknowledgments
이 연구는 사노 피 파스퇴르 파스퇴르에 의해 Incitative 그랜트 (PTR 435)를 포함 하 여 파스퇴르에서 내부 교부 금에 의해 및 "성립 드 지원 à 라 검색" 제공 된 교부 금에 의해 지원 되었다. A. 다 코스타는 사노 피-파스퇴르 그랜트와 플로리안 Bakoa에 의해 지원 되었다는 ANRT에서 제공 하는 박사 학위 부여의 (협회 국립 드 라 검색 외 드 라 Technologie). 우리는 유용한 토론에 대 한 홍보 피에르 올리비에 Couraud와 박사 피렌체 밀러에 빚을입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
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