Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En menneskelige blod-hjerne Interface Model til at studere barriere overfarter af patogener eller lægemidler og deres interaktioner med hjernen

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol om fastsættelse af en i cellulo BBB (blod-hjerne barrieren)-Minibrain polyester porøse membran kultur indsætte system for at evaluere transport af biomolekyler eller infektiøse agenser på tværs af en menneskelig BBB og deres fysiologisk indvirkning på de nærliggende hjerneceller.

Abstract

Den tidlig screening af nervesystemet medicin på en relevant og pålidelig i cellulo BBB model for deres udbredelse og deres interaktion med barrieren og hjernen parenkym er stadig et udækket behov. For at udfylde dette hul, designet vi en 2D i cellulo model, BBB-Minibrain, ved at kombinere en polyester porøse membran kultur Indsæt menneskelige BBB model med en Minibrain dannet af en tri-kultur af human hjernecellerne (neuroner, astrocytter og microglial celler). BBB-Minibrain tillod os at teste transport af en neuroprotektive lægemiddelkandidat (f.eks. Neurovita), gennem BBB, at bestemme den specifikke målretning af dette molekyle til neuroner og vise, at egenskaben neuroprotektive af stoffet blev bevaret efter stoffet havde krydset BBB. Vi har også vist, at BBB-Minibrain udgør en interessant model til at opdage passage af viruspartikler i endothelial celler barriere og overvåge infektion af Minibrain af neuroinvasive viruspartikler. BBB-Minibrain er et pålideligt system, let at håndtere for forsker uddannet i celle kultur teknologi og intelligent af hjernen celler fænotyper efter behandling eller fornærmelse. Sådan interesse i cellulo test ville være dobbelt: Introduktion derisking trin tidligt i stof udvikling på den ene side og reducere brugen af dyreforsøg på den anden side.

Introduction

Hjernen er adskilt fra den systemisk cirkulationen af en ikke-gennemtrængelige struktur, der begrænser udvekslinger mellem hjernen parenkym og blodet, kaldet blod - hjerne barrieren (BBB). For det meste består af cerebral endotelceller, interagerer BBB dynamisk med astrocytter, perivascular mikroglia og neuroner i den nærliggende hjernen parenkym. De tre hovedfunktioner af BBB er oprettelse og vedligeholdelse af Ioniske homøostase for neuronal funktioner, levering af hjernen med næringsstoffer og beskyttelse fra giftige skader eller optagelse af patogener1,2, som bidrager til vedligeholdelse af hjernen homøostase og dens funktioner3. Denne barriere er så effektiv, at kun få stoffer kan krydse BBB4,5. I øjeblikket består de tilgængelige metoder til at forudsige, om et molekyle vil passere BBB og diffuse ind i hjernen af ex vivo undersøgelser om obduktion materiale, billede sporing i hjernen af menneskers frivillige af Mr (magnetisk resonans imaging) eller PET (position emission tomografi) eller farmakodynamik og farmakokinetiske prækliniske undersøgelser i dyr6,7,8. Disse teknikker og modeller har nogle begrænsninger, såsom begrænset løsning af PET og Mr6,8, er vanskeligheden at kvantificere molekyler (dvs. antistof baseret molekyler for eksempel) så dårligt lav følsomhed trænge ind i hjernen7, og for de prækliniske undersøgelser deres høje omkostninger og resort i dyreforsøg.

Det sidste punkt er vigtigt, fordi ifølge 3R's regler, (, og erstatning af dyreforsøg) de regulerende myndigheder har anmodet om, at forskerne hurtigst muligt udvikle videnskabeligt nøjagtig alternativ til dyr eksperimenter9,10,11,12,13,14,15.

I de sidste årtier, flere in vitro-modeller af BBB er blevet foreslået16,17,18 ved at dyrke på filter membran indsætter endotelceller fra forskellige arter såsom mus, rotte, kvæg og svin. Hvad angår den menneskelige art, bedt den knappe og vanskelige tilgængelighed af primærelementer forskere til at udvikle menneskelige modeller baseret på udødeliggjort hjernen endotelceller eller menneske-afledte stamceller19,20, 21. Disse hindringer er ordentlig in vitro-surrogater af BBB, forudsat at de udtrykker endotel celle markører, tight junction markører, efflux transportvirksomheder, opløste luftfartsselskaber, receptorer, og reagere på i endothelial stimuli 20. Et par BBB modeller bruger filter membran skær belagt med endotelceller og andre celletyper (dvs, astrocytter, neuroner eller pericytes22,23,24) blev analyseret. Målet med disse Co kulturer var at øge BBB fysiske egenskaber ved at drage fordel af udskillelsen af opløselige faktorer af astrocytter/neuroner eller pericytes.

Dog omfatter ingen af disse modeller hjernen parenkym for at studere og forudsige skæbnen af en lægemiddelkandidat, når det har bestået dæmningen. Derfor vores mål var at bygge en i cellulo blod/hjerne interface, BBB-Minibrain, ved at kombinere en BBB model og en kultur af blandet hjerneceller i et enkelt kit. BBB-Minibrain bruger en kultur system bestående af en porøs filter indsat i en brønd i en multiwell celle kultur plade. Filteret er belagt med hCMEC/D3 celler, en menneskehjerne endotel cellelinie, der har vist sig meget pålidelig for BBB drug test25,26,27, til at danne BBB. Minibrain, som er en co differentieret kultur menneskelige neuroner og astrocytter stammer fra NTera/Cl2.D1 celle linje28,29 blandet sammen med menneskelig microglial cellelinje CHME/Cl530 i forhold svarende til den mikroglia vs neuron-astrocytter nøgletal af hjernen31, er dyrket i bunden af pladen godt.

Udover at studere passage af lægemidler på tværs af BBB og deres skæbne i parenkym, kunne blod-hjerne-interface i cellulo model være et effektivt redskab til optagelse af patogener i hjernen (neuroinvasiveness), spredning til hjernen (neurotropisme) og toksicitet (neurovirulence) de kan udøve på hjernen parenkym celler. Neurovirulence og neuroinvasiveness undersøgelser ville drage fordel af udviklingen af en effektiv i cellulo model og være fordelagtigt at erstatte dyremodeller. Ved hjælp af BBB-Minibrain kit32, vi viste neuroinvasive Fænotypen af sjældne viral mutanter, der opsamlet i den franske Neurotropic virusstamme af gul feber Virus (dvs., FNV-YFV33,34) anvendes til at udarbejde en Udgåede levende YFV vaccine og passage af en neuroregenerative og neuroprotektive biomolekyle kaldet Neurovita (omtalt som NV fremover i håndskriftet)35. Fordi NV hverken naturligvis krydser cellemembranen eller BBB, NV var sammenvokset med den variable del (VHH) i en enkelt kæde antistof af Lama, der krydser de biologiske membraner, herunder BBB og fungerer som en celle gennemtrængende molekyle (CPM)36. Egenskaben CPM i VHH synes at afhænge af det isoelektriske punkt og længden af VHH37.

Dette i cellulo test bør gøre det muligt at sortere de molekyler, der potentielt kunne krydse BBB før udførelsen farmakokinetiske og farmakodynamik analyse i dyr, og ideelt set i samme tid at være i stand til at forudsige deres adfærd i de nervøse parenkym. Dette system er biologisk relevante og nemt at oprette og håndtere af professionelle veluddannede i celle kultur26,29,30,38. Sådan interesse i cellulo test ville være dobbelt: at reducere udgifter til prækliniske undersøgelser på den ene side og reducere brugen af dyreforsøg på anden side.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur arbejde af Ntera/CL2. D1 til at forberede en fælles kultur af post mitotiske hNeurons og hAstrocytes (NT2-/ t)

Bemærk: Dette er komponenten i Minibrain (figur 1).

  1. Dyrkning af Ntera/Cl2.D1
    1. Fjerne et hætteglas med frosne celler fra flydende kvælstof tank. Holde på is.
    2. Tø celler hurtigt i et 37 ° C vandbad.
    3. Overføre cellerne i en 15 mL tube indeholder 10 mL af komplet DMEM F12 medium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium: næringsstof blanding F-12 medium) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 IE penicillin og 100 µg streptomycin (dvs., komplet DMEM F12 medium).
    4. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur (RT). Adskille pellet i 2 mL af komplet DMEM F12 medium.
    5. Overførsel i en T75 vævskultur kolbe i polystyren med specifikke behandling af følsomme vedhængende celler (T75Cell+) indeholdende 13 mL af komplet DMEM F12 medium.
    6. Kultur celler i en inkubator opretholdt ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 90% sammenløbet (dvs. omkring 5 dage). Ændre medium hver 2-3 dage.
  2. Subculturing Ntera/Cl2.D1 og forstærkning
    1. Fjern mediet fra kolben.
    2. Skyl celle éncellelag med 10 mL af fosfat buffer saltvand (PBS) suppleret med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Skyl celle éncellelag med 10 mL EDTA-oploesning (holdt på RT).
    4. Tilføj 3 mL trypsin-EDTA-oploesning (0,05% trypsin, 0,02% EDTA) og inkuberes 2 min på RT.
    5. Kolben rystes og sørg for, at cellerne er løsrevet fra den plastik overflade.
    6. Der tilsættes 10 mL af komplet DMEM F12 medium til at inaktivere trypsin, overføre i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min. ved 200 x g på RT.
    7. Adskille pellet med 10 mL af komplet medium og bruge 1 mL til podes hver ny kolbe, som indeholder 14 mL af komplet DMEM F12 medium.
      Bemærk: 30 T75 celle+ kolber er påkrævet for hver differentiering.
    8. Inkuber kolberne ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 90% sammenløb.
  3. Differentiering af NTera/Cl2.D1 i menneskelige neuron-astrocyte Co kultur
    Bemærk: Dette er den vigtigste komponent i Minibrain.
    1. På dag 0, adskille celler med trypsin-EDTA som beskrevet i trin 1.2 og adskille celle pellet af hver kolbe med 2 mL af komplet DMEM F12 medium.
    2. Tilsættes 1 mL cellesuspension (svarende til 5 x 106 celler) i 60 plast petriskåle af 85 mm diameter indeholder 11 mL af komplet DMEM F12 medium.
      Bemærk: Cellerne vil ikke lægge plast og vil samle til form pseudo neurospheres (Se foto i den nederste panel, Fig.1). Inkuber 60 petriskåle ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed for en dag.
    3. På dag 1, tilsættes 1 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 130 µM til all-Trans retinoid syre (ATRA) pr. petriskål (slutkoncentration ATRA 10 µM) og returnere retter ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed i 24 timer.
    4. På dag 2, overføre meget omhyggeligt det medium, der indeholder celle kugler af hver Petri Dish i en 50 mL tube og centrifugeres i 10 min på 50 x g og RT. dissociere omhyggeligt løs pellet med 13 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 10 µM ATRA og tilføje th e 13 mL i en ny 85 mm diameter petriskål.
      Bemærk: Over de forskellige passager er det yderst vigtigt at bevare kugler tæthed så højt som tætheden fremstillet på dag 2 (dvs. omkring en tæthed af 70%). Derfor, hvis kugle tæthed sænkning, reducere det samlede antal petriskåle afhængig af antallet af celler.
    5. Gentag fremgangsmåden ovenfor (trin 1.3.4) på dage 4, 6 og 8.
    6. På dagen 10, Gentag ovenstående fremgangsmåde men tilføje kugler til T75 celle+ kolber i stedet for petriskåle. Føje celler fra en petriskål til en T75 celle+ kolbe.
    7. På dage 11 ændre 13, 15 og 17, den anvendte medium med 14 mL af komplet DMEM F12 suppleret med 10 µM ATRA.
    8. På dag 19, ændre medium med 14 mL af komplet DMEM F12 medium uden ATRA pr. flaske.
    9. I dag 20, adskille forsigtigt celler med trypsin/EDTA som følger.
      1. For hver T75 celle+ kolbe, skyl celler med 10 mL PBS suppleret med Ca2 + og Mg2 +; Inkuber celler med 4 mL af EDTA i 5 min på RT.
      2. Fjern forsigtigt EDTA og der tilsættes 2 mL trypsin-EDTA og inkuberes 7 min på RT. Ryst meget blidt i kolben og tilføje omhyggeligt 8 mL af komplet DMEM F12 medium.
      3. Centrifugeres 10 i min ved 160 x g og RT. dissociere celle pellet i 13 mL af komplet DMEM F12 medium og overførsel i en T75 celle+ kolbe.
        Bemærk: Den meget blid dissociation med trypsin-EDTA vil give mulighed for at inddrive ATRA differentierede celler fra de oprindelige teratocarcinoma celler, som er stærkt knyttet til den plast ware.
    10. Dag 21, fjerne medium og de døde celler. Tilføje 14 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin og 0,5 µM af AraC (cytosin β-D-arabinofuranoside) (komplet 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. På dage 23, 25 og 28, benyttes Erstat medium med 14 mL 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. På dage 29 op til 49 (hver to dage), Erstat anvendte medium med 14 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 5% føtal bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin, 5 µM af FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) og 10 µM Urd (Uridine) (komplet 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. I dag 50, Erstat anvendte medium med 14 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 5% FBS, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin, 100 µg streptomycin og 10 µM Urd (komplet 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. På dage 51 op til 95 (to gange om ugen), Erstat anvendte medium med 14 mL af komplet 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Bemærk: Celler kan blive brugt til forsøg fra dag 51, men ikke senere end dagen 95. Brugen af serie behandlinger med mitosen hæmmere giver mulighed for at inddrive Ren population af co kultur af post mitotiske hNeuron og hAstrocytes (NT2-/ t).
    15. For at frø cellerne, fortsætte med blide trypsinization som beskrevet i dag 20.

2. celle kultur arbejde af humane microglial celler CHME/Cl5

Bemærk: Dette er microglial del af Minibrain (figur 1).

  1. Dyrkning af den menneskelige microglial celler CHME/Cl5
    1. Fjerne et hætteglas med frosne celler fra flydende kvælstof tank. Holde på is.
    2. Tø hurtigt i et 37 ° C vandbad.
    3. Overfør celler i en 15 mL tube indeholder 10 mL af komplet DMEM F12 medium suppleret med 5% føtal bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin og 100 µg streptomycin (dvs., komplet 5% FBS DMEM F12 medium).
    4. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min på RT. dissociere pellet med 2 mL af komplet 5% FBS DMEM F12 medium.
    5. Overførsel i en T75 celle+ kolbe indeholdende 13 mL af komplet 5% FBS DMEM F12 medium.
    6. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 90% sammenløb. Ændre medium hver 2-3 dage.
  2. Subculturing humane microglial celler CHME/Cl5
    1. Fjerne medium fra kolben.
    2. Skyl celle éncellelag med 10 mL PBS suppleret med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Skyl celle éncellelag med 10 mL EDTA-oploesning (holdt på RT).
    4. Tilføj 3 mL trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes 2 min på RT.
    5. Kolben rystes og sørg for, at cellerne er løsrevet fra den plastik overflade.
    6. Der tilsættes 10 mL af komplet 5% FBS DMEM F12 medium til at inaktivere trypsin, overføre i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min. ved 200 x g og RT.
    7. Adskille pellet med 10 mL af komplet medium og bruge 1 mL til podes hver ny kolbe, som indeholder 14 mL af komplet 5% FBS DMEM F12 medium.
    8. Inkuber kolberne ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 90% sammenløb.

3. kultur arbejde med hCMEC/D3 til pels porøse skær og forberede BBB

  1. Dyrkning af den menneskelige endotelceller hCMEC/D3 (figur 2)
    1. Fortynd den type jeg rotte kollagen til 1:30 med ren sterilt vand (celle kultur grade).
    2. Overfør 10 mL i en T75 celle+ kolben og inkuberes 2 h i et 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed inkubator.
    3. Fjerne kollagen løsningen og erstatte det med 15 mL i endothelial celle medium suppleret med 10 mM af HEPES (benævnt komplet endotel celle medium).
    4. Fjerne en cryo hætteglas af celler fra flydende kvælstof tank. Holde på is.
      Bemærk: Cellerne blev dyrket, og et frøparti foregik som beskrevet af fabrikanten. Cellelinie er omfattet af en aftale om biologisk materiale overførsel. Cellerne er fremstillet på passage nummer 25 og bør ikke anvendes længere end passage 35.
    5. Tø hurtigt i et 37 ° C vandbad.
    6. Overføre cellerne i T75 celle+ kolben og vende kolben ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed for 2 til 4 h.
    7. Fjern mediet omhyggeligt uden at miste eller fjernelse af celler. Skyl cellerne en gang med 10 mL af komplet endotel celle medium.
    8. Der tilsættes 15 mL komplet endotel celle medium.
    9. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 100% sammenløbet (ikke mindre end 4 dage) uden at ændre mediet.
  2. Subculturing hCMEC/D3 for at forberede indsætte af BBB
    1. Coat en nye T75 celle+ kolbe eller indsætter med typen jeg rotte kollagen som beskrevet ovenfor (trin 3.1).
    2. Fjern mediet fra kolben. Skyl celle éncellelag med 10 mL PBS suppleret med Ca2 + og Mg2 +.
    3. Der tilsættes 2 mL trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes 5 min ved 37 ° C.
    4. Ryst kolben og sørg for, at cellerne er helt løsrevet fra den plastik overflade.
    5. Der tilsættes 4 mL af komplet endotel celle medium til at inaktivere trypsin.
    6. Med 5 mL plastik pipette, mekanisk adskille cellerne af sugning og rødmen cellesuspension mens vedligeholdelse 5 mL pipette til bunden af kolben mindst 5 gange.
    7. Tælle cellerne og brug 5 x 104 celler/insert for en 12 godt polyester membran kultur indsætter Indsæt og 2 x 106 celler for en T75 celle+ kolbe. Forbered også tre filtre uden celler for PELy (dvs. endotelceller permeabilitet til Lucifer gul se nedenfor punkt 4.2) eksperimenter med Polyester membran kultur skær.
    8. Inkuber kolber eller skær ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed indtil 100% sammenløb.
    9. Ændre ikke mediet for T75 celle+ kolben indtil en ny passage. Tværtimod for BBB på polyester membran kultur indsætter: ændre medium dage 2 og 4, bruge BBB til eksperimenter på dag 6.

4. konstruktion og kvalitetssikring af BBB-Minibrain (figur 2)

  1. Opsætning af en BBB-Minibrain Polyester membran kultur indsætter enhed (figur 2B)
    1. Vokse hCMEC/D3 celler på 12 godt Polyester membran kultur Indsæt filtre for 6 dage på endotel celle medium før du bruger dem for eksperimentet.
    2. Coat en 12 godt plade med poly-D-lysin (1 mL/hul, 10 µg/mL, 4 h i RT) og derefter laminin (1 mL/hul, 1 µg/mL, overnatning på RT).
    3. Fjerne laminin og tilsættes 1 mL i endothelial celle medium suppleret med 5% FBS (5% endotel celle medium).
    4. Inkuber i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    5. Forsigtigt trypsinize NT2-/ t (som beskrevet i trin 1.3.9) og CHME/Cl5 (som beskrevet i trin 2.2) og adskille celle pellets med komplet endotel celle medium.
    6. Tæl cellerne, mix 3.6 x 105 NT2-N/A og 0,4 x 105 CHME/Cl5 celler/brønd og seed 12 godt plade.
    7. På T = 24 h (24t efter seedning): ændre den anvendte medium med friske komplet endotel celle medium (Minibrain celler og endotelceller) og overføre hCMEC/D3 Polyester membran kultur Indsæt filter på toppen af Minibrain celler. Inkuber BBB-Minibrain ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
      Bemærk: BBB-Minibrain vil derefter bestå af et lag af menneskelige endotelceller hCMEC/D3 på filter isolere den luminale rum (eller "blod" rum) og en blandingskultur af humane celler i hNT2-/ t og hCHME/Cl5 (Minibrain) i bunden af den godt definerende abluminal rum (eller "hjernen" rum) (figur 2B).
  2. Validering af endotel permeabilitet af BBB-Minibrain (kvalitetskontrol) (figur 2 c)
    1. Forberede transport-bufferen (TB), som er HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) buffer med Ca2 + og Mg2 + suppleret med 10 mM HEPES og 1 mM natrium pyruvat.
    2. Forberede 12 godt plader med 1,5 mL transport buffer pr. hul.
    3. På T = 0, gøre friske transport buffer suppleret med 50 µM Lucifer gul (LY-TB).
    4. Tilbageføre hver filter op og ned for at fjerne omhyggeligt medium uden at påvirke i endothelial celle barriere.
    5. Placer filteret på fyldt 12 godt pladen og der tilsættes 0,5 mL af LY-TB.
    6. Inkuber plader i en inkubator ved 37° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    7. Ved T = 10 min flytning filtre på nye TB fyldt 12 godt plader og holde abluminal rum af den første plade for OD læsning.
    8. På T = 25 min, Gentag trin 4.2.7.
    9. På T = 45 min, stoppe transport ved at fjerne filtrene fra pladerne. Holde abluminal og luminale rum for OD foranstaltninger.
    10. Overførsel i en mørk 96 godt plader prøverne: 10 µL med 190 µL TB til LY-TB og de luminale rum, 200 µL af prøven for dele af abluminal.
    11. Måle fluorescens af LY-TB forekommer i de forskellige prøver på λ428 nm λ535 nm (excitations- og længde bølger henholdsvis).
    12. Beregne den endotel permeabilitet (Pe) mod LY-TB (PeLY) efter Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 og Da Costa, A et al. (2018)34 ved hjælp af formlen:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) og PeLY= PSe/S.
      Bemærk: PSf er permeabilitet af filteret uden celler, PSt er permeabilitet af filteret med celler, PSe er permeabilitet af endotel éncellelag tid overfladen af éncellelag, S er overfladen af éncellelag (for en 12 godt filter = 1.12 cm2 ), PeLY er udtrykt i cm/min. For hCMEC/D3 PeLY bør være mellem 0,7 og 1,2 x 10 anvendes-3 cm/min afhængigt af hovedsageligt af FBS i eksperimenter. Vigtigt: en PeLY højere end 1,2 betyder at BBB ikke er stramme nok, og nogle lækage kan observeres. Kassér disse barrierer.

5. brug af BBB-Minibrain at fremhæve tilstedeværelsen af neuro-invasive viruspartikler i en gul feber Virus vaccine prøve, den franske Neurotropic virus, YFV-FNV 34 (figur 3)

  1. BBB passage og multiplikation af gul feber virus i Minibrain
    1. Bruge BBB-Minibrain forberedt som beskrevet i trin 4.1.7 24 timer før tilsætning af virus; erstatte medium af 2% FBS endotel celle medium.
      Bemærk: Det er yderst vigtigt at undgå at ændre medium lige før du tilføjer virussen. Skiftende medium kan aktivere i endothelial menneskeceller og forbigående åbne barrieren, som giver mulighed for passage af virus. Her er mediet ændret 24 timer før du starter eksperimentet.
    2. På T = 0, tilføje 3500 plak danner enheder (PFU) af YFV-FNV fortyndet i 50 µL af 2% FBS endotel celle medium meget omhyggeligt på toppen af den luminale rum. Kontrolelementet BBB-Minibrain er podet med 50 µL af 2% FBS endotel celle medium uden virus. Bestemme PeLY på følgesvend godt.
    3. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    4. Efter 24 timer, fjerne polyester membran kultur skær filter enhed og bestemme PeLY, prøve 1 mL fra abluminal rum og titreres virus som beskrevet af A. da Costa et al. (2018)34. Udskift mediet med friske 2% FBS endotel celle medium.
    5. Inkuber BBB-Minibrain ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    6. Efter 72 h, prøve medium fra abluminal rum og titreres virus og/eller uddrag af RNA fra Minibrain cellerne til gen expression analyse som beskrevet af A. da Costa et al. (2018)34.
  2. Forstærkning af neurotropic varianter af YFV-FNV på Minibrain celler ved seriel passager
    1. Brug Minibrain celler belagt 12 godt plader (dvs. trin 4.1.6 og 4.1.7).
    2. Samtidig tilføje peger 0 h, 3.500 plak danner enheder af YFV-FNV fortyndet i 50 µL af 2% FBS endotel celle medium meget omhyggeligt på toppen af celler (luminale rum).
    3. Efter 1 time, fjerne medium med virus inokulum og erstatte med frisk 2% FBS endotel celle medium.
    4. Efter 48 h, prøve 500 µL af substratet og inficere friske Minibrain celler
    5. Efter 120 h, prøve 500 µL af substratet og inficere friske Minibrain celler.
    6. 192 h, gemme næringssubstratet (= virus stock beriget) og uddrag af RNA fra Minibrain cellerne til gen expression analyse som beskrevet af A. da Costa et al. (2018)34.

6. brug af BBB-Minibrain at studere BBB passage og hjerne celle målretning af et biomolekyle

  1. Transport på tværs af BBB af en neuron målretning biomolekyle
    1. Brug Minibrain-BBB forberedt som beskrevet trin 4.1.7.
    2. På tidspunkt 0 h, tilføje biomolekyle (i eksemplet forudsat i afsnittet resultat 58.75 ng/BBB celle permeant NeuroTag-NV molekyler blev tilføjet pr. BBB-Minibrain sæt.
    3. Inkuber BBB-Minibrain ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    4. Efter 24 timer, fjerne polyester membran kultur skær filter enhed og bestemme PeLY, så pletten Minibrain celler til hNeurons neurofilament Nf200 og påvise tilstedeværelsen af biomolekyle i Minibrain (i det viste eksempel i resultatet afsnit, NeuroTag-NV blev fundet ved hjælp af en antistof rettet mod Strep-Tag det indeholder35,40).
  2. Transport på tværs af BBB neuroregenerative biomolekyle og efterfølgende neuroprotektive assay i Minibrain efter biomolekyle har krydset BBB
    1. Brug Minibrain-BBB forberedt som beskrevet i trin 4.1.7.
      Bemærk: For molekyler målretning neuroner kun, Minibrain celler kan erstattes af neuroner celler (NT2-N) kun38.
    2. På tidspunkt 0 h, tilføje 58.75 ng/BBB-Minibrain godt i celle permeant NV molekyler (aktive form CPM-NeuroTag-NV, ikke-aktiv form CPM-NeuroTag-NVΔ) beskrevet af C. Prehaud et al. (2014)35.
    3. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    4. Efter 4 h, gøre enkelte sår med en injektion nål (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgien) på Minibrain cellerne. Gøre mindst 10 ridser på hver enkelt godt. Bestemme PeLY på følgesvend godt.
    5. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    6. Efter 8 h, erstatte medium i abluminal rum af frisk komplet endotel celle medium.
      Bemærk: Det er vigtigt at erstatte medium på dette trin, da såret af Minibrain celler kan føre til celledød og derefter udgivelse af cytotoksiske stoffer.
    7. Inkuber BBB-Minibrain i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed.
    8. Efter 48 h, farvede celler til axon regenerering af hNeurons som beskrevet af C. Prehaud et al. (2013)40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBB-Minibrain er en i cellulo eksperimentel model af blod-hjerne interface.

BBB-Minibrain er sat op på polyester membran kultur Indsæt system til at efterligne en blod rum på det øverste niveau og en hjerne rum på det lavere niveau af blod-hjerne-interface (figur 2AB). Det består af en luminale rum med hCMEC/D3 endotelceller på filteret danner BBB og et abluminal rum, som indeholder de Minibrain menneskelige tri-kultur af cerebral celler (neuroner, astrocytter og microglial celler). Minibrain cellerne udviser en klassisk tri-kultur blandet befolkning fænotype (figur 1, nederste højre panel) og udtrykke specifikke markører for hver type celle som vist af da Costa A. et al., 201834.

Brug af hCMEC/D3 lag i BBB-Minibrain giver mulighed for at opnå en stærk barriere med en gennemsnitlig PeLY af 0.95e-03 cm/min. og en gennemsnitlig Trans endotel elektrisk modstand (TEER) af 51.89 Ω/cm2. Disse værdier er i rækken af de bedste værdier nogensinde beskrevet for en menneskelig endotel celle linje27,41 i sådan en polyester membran kultur Indsæt system (figur 2 c). Disse celler express tight junction protein markører som ZO-1 og cadherin som forventet ved permeabilitet kvantificering (data ikke vist). De udtrykker også alle delmængder af receptorer, efflux transportvirksomheder eller transportvirksomheder [receptorer: LDLR, lav densitet lipoprotein receptor; LRP1, lav densitet lipoprotein receptor relateret protein 1; INSR, insulin receptor; LEPR, leptin receptor; LU, basalcelle vedhæftning molekyle; TFRC, CD71 antigen; AGER, avanceret glykosylering slutproduktet receptor. Efflux transportvirksomheder: ABCB1 (P-gp); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 protein; ABCC5, ABCC5 protein. Transportvirksomheder: STRA6, stimuleret af retinoid syre gen 6 protein; SLC2A1, glucose transporter type 1; SLC7A5, store neutral aminosyre transporter 1; SLC1A1, opløste carrier familie 1 protein; SLC38A5, opløste carrier familie 38 medlem 5 protein; SLC16A1, monocarboxylate transport protein 1], som er centrale relevante proteiner til deres biologiske funktioner (figur 2D)21.

BBB-Minibrain giver mulighed for at vælge, forstærke og kendetegner sjældne neuroinvasive viral varianter fra en levende virus vaccine forberedelse.

BBB-Minibrain kultur enhed blev brugt som en i cellulo test giver isolation og forstærkning af sjældne neuroinvasive/neurovirulent varianter potentielt til stede i gul feber virus (YFV) virale levende vacciner42. YFV er et viscerotropic virus målrette leveren, der ikke effektivt krydser BBB. Den franske neurotropic virus, FNV, blev brugt som et levende YFV vaccine indtil 1980s33,43. FNV blev fundet for at forårsage post vaccinal neuropathogenesis hos børn (0,3 til 0,4% blandt vaccinerede) og dermed ophørte i 198233,43. Vi brugte FNV her som en prototype af YF-virus, som kan indeholde en stor del af neuroinvasive/neurovirulent varianter42,44. En FNV virus forberedelse (dvs. 3500 PFU/ml) blev tilføjet i den luminale rum i en BBB-Minibrain, kontrol var en BBB-Minibrain, der var mock-inficerede. Tilstedeværelsen af viruspartikler i luminale rum ændrer ikke den barriere permeabilitet som målte 24 timer senere, da PeLY i de virale wells ikke var forskellig fra PeLy af kontrolhullerne (0,80 ± 0,09 x 10-3 cm/min og 0,86 ± 0,09 x 10-3 cm/min for PeLY i kontrol- og YFV-FNV brønde henholdsvis). Indholdet af abluminal rum blev evalueret for forekomst af virus af plaque assay, på 24 h efter infektion. Minibrain cellerne blev rugede to dage yderligere at vurdere forstærkning af neuroinvasive varianter i hjerneceller og for at overvåge genekspression som beskrevet på tegnefilmen vist på fig. 3A.

Vi fundet nogle YFV-FNV virus, som kan krydse BBB på 24 timer (mener 43 PFU/mL). Virus blev forstærket i de næste to dage ved multiplikation af virussen inde i hjerneceller (betyde titer på 4,69 x 104 PFU/mL), (figur 3B). Af note, ville en vaccine stamme forberedelse, som ikke forårsager efter vaccinal neuropathogenesis ikke effektivt krydse BBB i dette system som det er blevet påvist ved da Costa A. et al. (2018)34. Vi identificerede to biomarkører af multiplikationen af virus: The Interferon stimuleret gen 15 (ISG15) og Interferon regulerende faktor 7 (IRF7). Udtryk for disse to biomarkører blev stimuleret når denne neuroinvasive viral befolkning var seriefremstillede passaged på Minibrain celler (figur 3 c). Disse upregulations, målt ved Q-RT-PCR var strengt korreleret til virusmængden (Pearson p-værdi 0.0016 for ISG15 og 0.0260 for IRF7).

BBB-Minibrain giver mulighed for begge kørsler evnen af et biomolekyle for at passere barrieren og på samme tid test om funktionen biomolekyle blev bevaret efter BBB passage.

NV er et biomolekyle for afledt af rabiesvirus, som besidder forbløffende egenskaber på neuroprotection og neuroregeneration40. Denne lille polypeptid at hverken naturligvis krydser cellemembranen eller BBB blev sammensmeltet med en stand til at målrette neuronerne CPM. Vores valg var at bruge den variable del (VHH) i en enkelt kæde antistof af Lama, der krydser de biologiske membraner, herunder BBB36,45 og en NeuroTag målretning neuroner specifikt. NV blev knyttet til VHH og en NeuroTag, til at konstruere en CPM-NeuroTag-NV (figur 4A) og til VHH kun til at konstruere en CPM-NeuroTagΔ-NV mangler de særlige NeuroTag giver mulighed for målretning af neuroner (figur 4B). Efter at blive tilføjet til den luminale rum, CPM-NeuroTag-NV (grønne prikker) krydser BBB og var i stand til at målrette menneskelige neuroner (i rødt) (figur 4 c, D). CPM-NeuroTagΔ-NV krydser i endothelial celle barriere (grønne prikker) men mål mindre effektivt de menneskelige neuroner (flertal af grønne prikker er placeret uden for neuroner) (figur 4D).

Som beskrevet ovenfor, var NV knyttet til en VHH og en NeuroTag til at konstruere en CPM-NeuroTag-NV. Vi gjorde det samme for NVΔ en inaktiv form af NV mangler den aktive del af NV (CPM-NeuroTag-NVΔ) (figur 5A). Efter at blive tilføjet til den luminale rum, CPM-NeuroTag-NV krydser BBB og var i stand til at regenerere axoner af menneskelige neuroner efter såret (figur 5B, højre panel), tværtimod at CPM-NeuroTag-NV Δ inaktive form af NV (figur 5B, venstre panel)40. Disse egenskaber blev analyseret i to typer af protokoller; enten i en pre-eksponering (figur 5 c) eller i en post eksponering protokol (fig. 5 d). Hvornår anvendes før axon skrabe (4 h, H4), CPM-NeuroTag-NV udløser neuroprotection af de sårede neuroner og den cytoskeletale regenerering tværtimod af mock behandlede celler (dvs. kontrol) eller cellerne behandles med CPM-NeuroTag-NVΔ (mean regenerering 91% og 12% - 10% henholdsvis figur 5 c). Når biomolekyle blev anvendt efter de cytoskeletale læsioner (1 time, H1, fig. 5 d) for at efterligne en terapeutisk efter eksponering protokol, CPM-NeuroTag-NV er stadig i stand til at regenerere axoner tværtimod af handicappede form af CPM-NeuroTag-NV Δ,) betyder regenerering 85% og 5,1%) (fig. 5 d).

Figure 1
Figur 1: The Minibrain model. Tidsplan for NT2-/ t og CHME/Cl5 kulturerne (øverste panel). Fotografier (nederste del) af den oprindelige cellelinje (Ntera/cl2. D1) i det venstre panel, pseudo-neurospheres opnået efter ATRA behandling i det midterste øverste panel, CHME/Cl5, i den midterste nederste panel og Minibrain triculture (Cristal Violet farvning), i det højre panel, der følger af blandingen af NT2/t og CHME / CL5 kulturer. Skala bar 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: BBB-Minibrain model. A. tidsplan for hCMEC/D3 kulturer og fotografi af BBB-Minibrain enhed: en polyester membran kultur skær-filter med hCMEC/D3 endotel barriere er afholdt med en forcep før der skal indsættes i et hul i en 12 brønde celle kultur plade. B. tegnefilm der beskriver enheden med den luminale (blod) rum indeholdende i endothelial celle barriere og abluminal (hjernen) rum med Minibrain cellerne (menneskelige neuroner, astrocytter og microglial celler). C. repræsentative foranstaltninger af BBB-Minibrain permeabililty af TEER (dvs. TransEndothelial elektrisk modstand) på tre enheder eller permeabilitet til LY (dvs., PeLY) på fem filtre. D. udtryk analyse af q-RT-PCR receptorer, efflux transportvirksomheder og transportvirksomheder på endotelceller hCMEC/D3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: The BBB-Minibrain model giver mulighed for identificering af neuroinvasive varianter blandt levende YFV vaccine forberedelse. A. tidsplan for forsøget. B. kvantificering af de virus, der har krydset BBB af plak danner enhed (PFU) titrering af levende virus (hvert punkt repræsenterer en polyester membran kultur skær eksperiment). C. Plot af ISG15 og IRF7 genekspression målt ved q-RT-PCR som en funktion af antallet af viruspartikler i virusbelastningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: The BBB-Minibrain giver mulighed for prøvning af neuroregenerative biomolekyle egenskaber: specifikke målretning af neuroner når NV er sammenvokset til NeuroTag. A. tegnefilmen af CPM baseret NV (dvs., CPM-NeuroTag-NV) som indeholder en bestemt NeuroTag for at målrette neuron specifikt. B. tegneserie af CPM baseret NV slettet af NeuroTag (dvs., CPM-NeuroTagΔ-NV). C. repræsentative immunofluorescens fotografier af de menneskelige neuroner. Skalere bar 50 µm. NF 200 i rød, CPM-NeuroTag-NV/CPM-NeuroTagΔ-NV i grønne, kerner i blå. D. CPM-NeuroTag-NV molekyler kan krydse BBB og målrette menneskelige neuroner mere effektivt end CPM-NeuroTagΔ-NV. Inficeret neuroner og samlede population af neuroner blev talt på tredobbelt dias efter immunolabeling. Samlede neuroner svarer til NF200 positive celler (i rødt). Røde celler er forbundet med en eller flere grønne prik (CPM-NV) regnes som en positiv neuron. Uparret student's t-test med to tailed ***p = 0.0002. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: The BBB-Minibrain giver mulighed for prøvning af neuroregenerative biomolekyle egenskaber: BBB passage ændrer ikke neuroregenerative egenskaberne af NV. A. tegnefilmen af CPM baseret NV (dvs., CPM-NV) og sin handicappede modpart (dvs., CPM-NVΔ). B. Axon regenerering af CPM-NV i en i cellulo scratch assay (højre panel). CPM-NVΔ kan ikke udløse axon regenerering (venstre panel), skala bar 100 µm. C. CPM-NV kan krydse i endothelial cellen og regenerere axoner på neuroner i BBB-Minibrain når den anvendes 4 timer før læsionen: (øverste panel) ordningen af eksperimentet; (nederste panel) kvantificering af regenerering. D. CPM-NV er også aktiv i en terapeutisk protokol, når den anvendes 1 h efter den sårede: (øverste panel) ordningen af eksperimentet; (nederste panel) kvantificering af regenerering. Uparret student's t-test med to tailed ***p < 0,0001. Regeneration blev beregnet fra tredobbelt eksperimenter (> 800 neuroner tælles) efter farvning af neuronale celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel vi vist, hvordan man opbygger en i cellulo blod/hjerne interface, BBB-Minibrain, ved at kombinere en BBB model og en kultur af blandet hjernen cerebral celler (Minibrain) i en enkelt kit. Dette system er biologisk relevante, nemt at oprette og håndtere for eksperimentatorer veluddannede i cellekultur.

Som for alle andre in vitro-model for BBB, ville pålidelige resultater opnås hvis drastisk kontrol af tæthed af barrieren er anvendt. Skær skal testes omhyggeligt, for permeabilitet og enhver Indsæt med utilstrækkelig permeabilitet værdier (dvs. en PeLY højere end 1,2) skal kasseres.

FBS prøver skal testes omhyggeligt for at identificere et parti, der ikke gør forhindre Karakteristik af BBB. Den samme rådgivning kan gøres vedrørende køretøjet medium i hvilke virus partikler eller biomolekyler fortyndes. Det anbefales også at holde så små som mulige volumen af biomolekyle eller virus suspension, for at ikke ændre medium sammensætningen af den luminale rum. Differentiering af menneskelige Co kultur neuron/astrocytter kultur fra Ntera/CL2. D1 er en gennemprøvet teknologi. I modsætning til menneskelige neuroner, der er post mitotiske, astrocytter stadig dividere celler. Høj spredning af astrocytter celler er nogle gange observeret. Hvis dette sker, har Minibrain kulturen skal kasseres. CHME/Cl5 celler vi brugte i vores laboratorium var phenotyped at bevise, at de var af menneskelig oprindelse (Homo sapiens CCNT1 fænotyper). Der er en risiko for, at nogle CHME masser anvendes i nogle laboratorier kan være af rotte (Rattus norvegicus) oprindelse som hævdet af Garcia-Mesa Y. et al. (2017)46. Det anbefales derfor, at kontrollere, om oprindelsen af CHME/Cl5 cellelinie.

Minibrain menneskelige tri-kultur-systemet herunder post mitotiske neuroner (hovedsagelig dopaminerge), efterligner astrocytter og en microglial cellelinje, en forenklet cerebral miljø. Dette system kan stadig forbedres. Man kan forestille sig, tilføje oligodendrocytes til kultur med det mål at opnå myelinerede axoner eller primær microglial celler. Minibrain kan også blive erstattet med en blandingskultur af menneske-afledte stamceller19,20,21. Ikke desto mindre bliver variation mellem forskellige masser af celler nødt til at være omhyggeligt mestrer. BBB-Minibrain kompleksitet kan også øges ved at tilføje pericytes23. I vores hænder, blev denne forbedring vanskeliggøres af svært at have pålidelig adgang til pericytes af menneskelig oprindelse.

Vi har demonstreret gennemførligheden og nytten af dette kit efterligne blod-hjerne-grænseflade for at i) isolere sjældne neuroinvasive viruspartikler fra en gul feber vaccine prøve, har udviklet sig ejendommen for at trænge ind i hjernen via BBB, og ii). forstærke disse neuroinvasive delpopulationer i Minibrain tri-kultur efterligne en forenklet hjernen parenkym. Fremtidige ansøgninger kan være at udvide kvalitetskontrol af andre levende vacciner som fåresyge vaccine og fremme BBB-Minibrain som et middel til at studere neurovirulence funktioner in vitro.

Den anden pilot undersøgelse var at vise at en lægemiddelkandidat passerer gennem BBB og når Minibrain, uden at miste sin neuro-regenererende egenskaber. Vi er stærkt overbevist om, at BBB-Minibrain kan tillade større fremskridt inden for forsortering af molekyler, før du slipper dem til prækliniske forsøg. Brugen af BBB-Minibrain bør lette gennemførelse af 3R foranstaltninger sigter mod at reducere brugen af dyreforsøg for både reglementary assays og eksperimentel forskning.

Helt med den næste udvikling i siliciummangan tilgange (computermodel), vil vi snart være i stand til at identificere drug kandidater med en høj sandsynlighed for passage BBB, udviklingen af en 3D-model i cellulo efterligne nervøs parenkym blod grænseflade ville være til stor hjælp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Den intellektuelle ejendomsret af systemet var de patenter, der refereres til i 32, 35 og 38.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af indre tilskud fra Institut Pasteur herunder en skal grant (PTR 435) og af tilskud "Contrat de Soutien à la Recherche" leveret af Sanofi Pasteur til Institut Pasteur. A. da Costa støttedes Sanofi Pasteur grant og Florian Bakoa er modtager af et ph.d.-stipendium leveres af ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Vi står i gæld til Pr Pierre-Olivier Couraud og Dr Florence Miller til nyttige diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 146 BBB-Minibrain i cellulo model menneskelige endotelceller hCMEC/D3 Ntera/Cl2D.1 menneskelige neuron menneskelige astrocyte menneskelige microglial celler CHME/Cl5
En menneskelige blod-hjerne Interface Model til at studere barriere overfarter af patogener eller lægemidler og deres interaktioner med hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa,… More

da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter