Summary
Este protocolo descreve os métodos in vivo e ex vivo para visualizar e caracterizar plenamente os vasos hialóides, um modelo de regressão vascular em olhos de rato, usando tomografia de coerência óptica e angiografia por fluoresceina de fundo para a imagem ao vivo e ex vivo isolamento e posterior montagem plana de hialóide para análise quantitativa.
Abstract
No olho, os vasos hialóides embrionários nutrem a lente e a retina em desenvolvimento e regredir quando os vasos retinianos se desenvolvem. A regressão persistente ou falhada de embarcações hialóide pode ser considerada nas doenças tais como o vítreo preliminar hyperplastic persistente (phpv), conduzindo a um trajeto claro obstruído e a uma função visual danificada. Compreender os mecanismos subjacentes à regressão do vaso hialóide pode levar a novas percepções moleculares sobre o processo de regressão vascular e novas formas potenciais de administrar doenças com vasos hialóides persistentes. Aqui nós descrevemos os procedimentos para a imagem latente hialóide em ratos vivos com tomography ótico da coerência (OCT) e a angiografia da fluoresceína do fundo (FFA) e um protocolo técnico detalhado de isolar e de montar liso hialoid ex vivo para a análise quantitativa. Os camundongos Knockout de proteína 5 (LRP5) da lipoproteína de baixa densidade foram utilizados como modelo experimental de vasos hialóides persistentes, para ilustrar as técnicas. Juntas, essas técnicas podem facilitar uma avaliação minuciosa dos vasos hialóides como modelo experimental de regressão vascular e estudos sobre o mecanismo de vasos hialóides persistentes.
Introduction
O suprimento sanguíneo no olho é essencial para garantir o desenvolvimento normal da retina e dos tecidos oculares circundantes e para equipar uma função visual adequada. Há três camas vasculares no olho: o vasculature retinal, o choroid, e uma rede circulatória embrionário transiente de embarcações hialóide. O desenvolvimento da vasculatura ocular requer coordenação espacial e temporal em toda a embriogênese e maturação tecidual. Entre as três camas vasculares, a vasculatura hialóide é o primeiro sistema de suprimento de sangue funcional para fornecer nutrição e oxigênio para a lente embrionária recém-formada e a retina em desenvolvimento. As embarcações de hyaloid regredir ao mesmo tempo que os vasculatures do retina desenvolvem e amadurecem1. A regressão da vasculatura hialóide é fundamental para permitir uma via Visual clara para o desenvolvimento da função Visual; Portanto, este processo de regressão vascular é tão importante quanto o crescimento da vasculatura retiniana. A regressão hialóide prejudicada pode levar a doenças oculares. Além disso, a regressão dos vasos hialóides fornece um sistema modelo para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regulação da regressão vascular, o que pode ter implicações para a regulação angiogênica em outros órgãos também.
A vasculatura hialóide, derivada da artéria hialóide (ha), é composta por Vasa hyaloidea própria (VHP), Tunica lentis do cristalino (TVL) e membrana pupilar (PM). Fornece a nutrição à retina tornando-se, ao vitreous preliminar, e à lente durante o desenvolvimento embrionário2. Decorrente do HA, VHP ramifica-se anteriormente através do vítreo para a lente. Os copos TVL a superfície posterior da cápsula da lente, e anastomoses para o PM, que se conecta às artérias ciliares anteriores, cobrindo a superfície anterior da lente2,3, resultando na formação de uma rede de vasos no PM 3. º , 4. º , 5. Curiosamente, não há veias na vasculatura hialóide, e o sistema faz uso de veias choroidais para realizar a drenagem venosa.
No embrião humano, a vasculatura hialóide está quase completa em aproximadamente a nona semana de gestação e começa a regredar quando os primeiros vasos retinianos aparecem, durante o quarto mês de gestação2. Começando com a atrofia do VHP, a regressão das redes capilares do TVL, o PM, e finalmente, o ha ocorre subseqüentemente2,3. Entretanto, as retrações vítreo preliminares e o vítreo secundário começam a dar forma, compor dos componentes extracelular da matriz, incluindo fibras do colagénio. Pelo sexto mês da gestação, o vítreo preliminar é reduzido a um canal transparente pequeno que estende do disco do nervo ótico à lente, chamado o canal de Cloquet ou o canal hialóide, e o vítreo secundário transforma-se o componente principal do segmento do posterior 2. º , a circulação 3. The hialóide desaparece na maior parte em 35 a 36 semanas da gestação, apenas antes do nascimento3.
Ao contrário dos seres humanos, em quem o vasculatura hialóide é regressed completamente no nascimento, o sistema vascular hialóide do rato começa regres após o nascimento. À medida que a retina do camundongo nasce vasos avascular e retinianos desenvolvem-se postnatalmente, os vasos hialóides regredir concomitantemente do dia pós-natal (P) 4 e são, na sua maioria, completamente regredido por P216 (Figura 1). O PM desaparece primeiramente entre P10 e P12, e o VHP desaparece entre P12 e P16, quando um número pequeno de pilhas de TVL e de ha remanescer mesmo em P16, e por P21 a regressão vascular hialóide do sistema é quase completa6. Entretanto, a vasculatura retiniana começa a se desenvolver após o nascimento. A camada superficial do plexo vascular estende-se totalmente à retina periférica em P7 – P8, a camada profunda (localizada na camada plexiforme externa) se desenvolve a partir de P7 – P12 e, finalmente, o plexo intermediário na camada plexiforme interna se desenvolve entre P12 e P157 . Como a vasculatura da retina se desenvolve, ele gradualmente substitui a função de concomitantemente regressando vasos hialóides, proporcionando nutrição e oxigênio para o olho em desenvolvimento. A ocorrência pós-natal de regressão de vasos hialóides em camundongos fornece um modelo experimental de fácil acesso para observar e estudar a vasculatura hialóide, bem como a base molecular que rege os processos de regressão vascular ambos os fisiológicos e condições patológicas8.
A falha da regressão hialóide pode ser considerada nas doenças tais como o phpv, que é uma anomalia desenvolvente congenital rara do olho resultando de uma regressão falhada ou incompleta do vasculatura embriológico, preliminar vítreo e hialóide9. Os mecanismos que regulam o processo de regressão da vasculatura hialóide são complicados e amplamente estudados. Uma das principais vias moleculares essenciais para a regressão normal dos vasos hialóides é a via de sinalização WNT10, pois mutações genéticas nesta via que afetam tanto o ligante WNT quanto os receptores têm sido ligadas ao phpv em humanos9. Estudos experimentais identificaram um ligante de WNT, Wnt7b, que é produzido por macrófagos em torno de vasos hialóides no olho em desenvolvimento para mediar esse processo de regressão. Wnt7b ativa a sinalização de WNT ligando-se aos receptores frizzled4 (FZD4)/LRP5 nas células endoteliais adjacentes para iniciar a apoptose celular, levando à regressão dos vasos hialóides10. Em conseqüência, os ratos Wnt7b-deficientes mostram uma persistência de embarcações hialóide10. Similarmente, um ligante não convencional de WNT, Norrin (codificado pelo gene de NDP ), igualmente liga-se a FZD4/LRP5 para induzir a regressão hialóide da embarcação durante o desenvolvimento. NDPy/-, Lrp5-/-, e Fzd4-/- ratos todos exibem regressão de vasos hialóides adiados, apoiando um papel regulatório crítico da sinalização WNT11,12, 13,14,15,16. Além disso, um outro co-receptor de WNT LRP6 sobrepõe com o LRP5 em sua função em modular a via de sinalização de WNT em pilhas endothelial vasculares hialoid17. Outros fatores que podem também contribuir para a regressão hialóide incluem o fator inducible hipóxia18,19, fator de crescimento endotelial vascular20,21, colágeno-1822, 23, ARF24, angiopoietina-225e Proteína morfogenética óssea-426. Neste trabalho, utilizamos camundongos Lrp5-/- como modelo de vasos hialóides persistentes para demonstrar as técnicas de avaliação e caracterização da vasculatura hialóide através de métodos in vivo e ex vivo.
A visualização da vasculatura hialóide in vivo e ex vivo é essencial para o estudo dos mecanismos de regressão de vasos hialóides. Os métodos atuais para observar a vasculatura hialóide concentram-se principalmente na visualização e análise do VHP e HA, através de imagens de OCT e FFA, seções transversais oculares e a montagem plana hialóide. OCT e FFA são poderosas ferramentas de imagem in vivo, permitindo a observação longitudinal em animais vivos depois de terem aberto os olhos. Além disso, a montagem lisa hialóide isolada fornece o visualização do vasculatura hialóide inteiro e de um meio para conseguir uma quantificação exata dos números da embarcação. No entanto, a natureza delicada e frágil dos vasos hialóides e as dificuldades técnicas resultantes do seu isolamento podem ter limitado o seu uso na pesquisa ocular um pouco10,17,27. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado da visualização de vasos hialóides, combinando tanto in vivo imagens retinianas vivos e ex vivo isolado hialoide plano de montagem para melhorar a viabilidade dessas técnicas. Este protocolo foi adaptado com modificação e expansão de publicações anteriores sobre o método in vivo de fundo vivo e OCT28 e o método ex vivo de montagem plana hialóide isolada11.
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Protocol
Todos os animais foram tratados de acordo com a declaração de associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e de visão para experimentos com animais, seguindo as diretrizes dos institutos nacionais de saúde ( NIH) em relação ao cuidado e uso de animais para procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) no hospital infantil de Boston. Lrp5-/- camundongos (estoque n º 005823; Laboratório de Jackson) e seu selvagem-tipo (WT) ratos do controle C57BL/6J (estoque no. 000664; Jackson Laboratory) foram utilizados para este estudo.
1. parte I: imagem latente in vivo de embarcações hialóides usando um sistema de imagem latente retinal do roedor
- Preparação da anestesia dos camundongos e dilatação da pupila
- Selecione os ratos.
- Use os ratos que são mais velhos do que P12 (depois que abriram seus olhos) para a imagem latente retinal; ambos os sexos são adequados.
- Como desejado, camundongos mutantes de imagem com regressão hialóide tardia (e seus controles WT) durante a idade adulta. Os camundongos WT com mais de 3 semanas não podem apresentar vasos hialóides muito detectáveis, portanto, P12 – P21 é ideal para imagens que permanecem hialoides visíveis do WT.
- Prepare uma mistura de cetamina/xilazina para anestesia.
- Tome 2,3 mL de solução de cetamina (100 mg/mL) e 0,7 mL de solução de xilazina (20 mg/mL) e adicione 20 mL de soro fisiológico estéril (0,9% cloreto de sódio) para fazer uma solução de trabalho de uma mistura de cetamina/xilazina (10 mg/mL de cetamina e 0,6 mg/mL de xilazina).
- Anestesiar os camundongos por injeção intraperitonealmente de mistura de cetamina/xilazina em um volume de 8x o peso corporal do mouse (por exemplo, um mouse de 20 g precisa de 160 μL de mistura de solução de trabalho de cetamina/xilazina para conseguir uma dose de trabalho de cetamina [80 mg/kg de peso corporal] e xilazina [4,8 mg/kg de peso corporal] mistura).
- Aplique uma gota de solução de droga dilatadora de pupila (ver tabela de materiais) a cada olho para dilatar as pupilas do rato imediatamente após a anestesia.
- Avalie o nível de anestesia por reflexo de pedal (pinça do dedo do pé firme). Aguarde até que o rato esteja suficientemente anestesiado (sem reflexo do pedal) e as suas pupilas estejam largamente dilatadas.
- Selecione os ratos.
- Imagem latente ótica do tomography da coerência de embarcações hialóide
- Hidratar as córneas do mouse com lágrimas artificiais e, em seguida, coloque o mouse sobre o estágio de posicionamento.
- Entre em contato suavemente com a córnea do mouse com a lente da sonda OCT. Ajuste o mouse e a sonda de modo que a cabeça do nervo óptico esteja no centro do campo visual na imagem do fundo, para orientar a imagem de OCT.
Nota: para obter mais detalhes sobre a configuração geral de um sistema de imagiologia retiniana de roedores (ver tabela de materiais) e ajustar a posição do rato, consulte Gong et al.28. - Ajuste o foco para alcançar as imagens ideais de OCT.
- Ajuste o ângulo da linha indicada no software de imagem de OCT (ver tabela de materiais) para revelar vasos hialóides persistentes e, em seguida, tirar imagens.
- F undus f luorescein um ngiografia imagens de vasos hialóides
- Prepare uma solução de fluoresceina: adicione 9 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato estéril (PBS) a 1 mL de solução de fluoresceina (concentração de stock: 100 mg/mL). A concentração da solução de trabalho final é de 10 mg/mL.
- Injectar intraperitonealmente a solução de trabalho de fluoresceina (5 μL/g de peso corporal).
- Hidratar a córnea do rato com lágrimas artificiais e, em seguida, coloque o rato na fase de posicionamento.
- Posicione a lente do microscópio retinal da imagem latente do mícron IV para fazer o contato delicado direto com o cornea do rato. Ajuste ligeiramente o alinhamento para posicionar a cabeça do nervo óptico no centro do campo de visão.
- Mude o filtro do microscópio para um canal fluorescente verde.
- Concentre-se em vasos hialóides persistentes para tirar imagens.
- Tomar várias imagens após 1 min, 3 min, 5 min, e 10 min (não mais de 10 min) pós-injecção para determinar o melhor ponto de tempo (sinal-a-relação de fundo) para observar os vasos hialóides. Complete o procedimento de FFA dentro de 10 min, após o qual a fluoresceina pode tornar-se demasiado difusa e tornar as embarcações invisíveis.
- Recuperação dos camundongos da anestesia
- Após os procedimentos, manter os ratos em uma almofada de aquecimento quente.
- Aguarde até que os ratos são móveis novamente para devolvê-los para a gaiola do mouse.
2. parte II: visualização ex vivo de vasos hialóides
- Preparação de olhos de rato fixos
- Selecione camundongos da idade certa.
Nota: camundongos neonatais são tipicamente sacrificados no P8 para dissecção hialóide. Ambos os sexos são adequados. Camundongos mutantes com regressão hialóide tardia (e seus respectivos controles de WT) podem ser dissecados e analisados ao longo da idade adulta. - Eutanizar os camundongos por exposição ao CO2.
- Enucleate os olhos do rato pela dissecção sem corte.
- Abra as pálpebras largas com fórceps da microcirurgia para permitir o acesso ao globo ocular. Coloc o fórceps curvado da microcirurgia o globo na órbita para agarrar o nervo ótico sem espremer o globo ocular. Puxe suavemente e retire o globo ocular com a pinça.
- Alternativamente, dissecar o globo ocular usando tesouras da microcirurgia para cortar com cuidado paralelo ao Globo dos quatro lados para a parte traseira da órbita e de separar o globo dos tecidos conexivos circunvizinhos.
- Mergulhe os olhos em 4% paraformaldeído em tampão PBS por 30 min à temperatura ambiente para fixação.
- Transfira os globos oculares fixos para a reserva PBS gelada.
Nota: os globos oculares podem ser armazenados em PBS a 4 ° c por até 1 semana.
- Selecione camundongos da idade certa.
- Incorporação de vasos hialóides com injeção de gelatina
- Prepare uma solução de gelatina de 5% (p/v).
- Pesar 50 mg de gelatina.
- Dissolver a gelatina em 1 mL de água destilada.
- Incubar a solução de gelatina num banho de água de 37 ° c até dissolver totalmente. Mantenha a solução em 37 ° c de água até o uso.
Nota: um lote maior de solução pode ser preparado e armazenado a 4 ° c como alíquotas. Cada vez antes do uso, a solução precisa de ser aquecida no banho de água do ° c 37 para conseguir uma consistência desobstruída.
- um microscópio da dissecção, injete 50 μL da solução de gelatina no corpo vítreo no limbus; Repita a injeção 3x em locais diferentes para fazer um total de quatro injeções, uniformemente espaçadas em torno do limbus (Figura 2a).
- Incubar os globos oculares em um refrigerador de 4 ° c ou no gelo por 30 minutos para solidificar a gelatina injetada no espaço vítreo.
- Prepare uma solução de gelatina de 5% (p/v).
- Dissecção e isolamento de vasos hialóides
Nota: consulte a Figura 2B-E.- Coloque os globos oculares em um prato de Petri contendo PBS para manter o tecido de secagem. Faça uma incisão com tesouras de microcirurgia no limbo e retire a córnea.
- Snip e remover o nervo óptico.
- um microscópio de dissecção, use dois pares de fórceps para descascar e descartar as camadas de esclera, choróide e epitélio pigmentar da retina (RPE) e remover a íris.
- Com o lado do nervo óptico da retina virada para cima e o lado da lente para baixo, injete 50 μL de PBS logo abaixo do copo de retina para permitir a acumulação do tampão PBS entre o corpo vítreo gelatinizado e a retina.
- Descasque delicadamente fora e remova o copo do retina e o corpo ciliar do corpo vítreo com fórceps da microcirurgia.
- Usando uma pipeta de transferência, transfira o copo da gelatina que contem o tecido hialóide imerso em PBS a uma corrediça do microscópio
- Vire o resto do tecido (lente/hialóide) sobre, de modo que o lado da lente está virado para cima.
- Levante a lente e Afrouxe delicadamente a conexão entre o Lens/TVL e o VHP, e então, corte o HA com as tesouras da microcirurgia para remover o Lens-TVL. Mantenha o VHP-parte do copo hialóide para a montagem plana.
- Montagem plana e coloração de vasos hialóides
- Lave suavemente o copo hialóide com PBS na corrediça para remover todos os detritos de dissecção.
- Certifique-se que o copo hialóide está flutuando na corrediça na solução adequada de PBS.
- Delicadamente arranje e ajuste a posição do copo hialóide gelatinizado com o fórceps da microcirurgia, com a borda do copo que enfrenta para baixo na corrediça, para conseguir a aparência óptima após o derretimento.
- Coloque o slide com o copo hialóide imerso em PBS em um aquecedor de slides a 37 ° c, aguarde até que a gelatina derrete e o hialoide achatados, e retire o slide quando ele está mal seco (não secar mais).
- Opcional Immunostain os vasos hialóides
- Faça a obstrução e o amortecedor penetrante (por exemplo, albumina de soro bovina de 5% [BSA] e 0,1% Triton X-100 no amortecedor de PBS). Adicionar 50 μL de tampão de bloqueio em um isolamento hialóide de montagem plana e incubar-lo à temperatura ambiente por 30 min.
- Aplique 50 μL do anticorpo preliminar (por exemplo, CD31) (1:100 diluição no tampão de obstrução) em uma montagem lisa do isolamento hialóide, e então, incubar-o em uma caixa molhada em 4 ° c durante a noite.
- Enxaguar suavemente 3x, durante 5 min de cada vez, com PBS.
- Aplique 50 μL de anticorpo secundário (por exemplo, anticorpo secundário de cabra anti-coelho-Alexa 488, 1:100 diluição) na montagem plana hialóide e incubar-o à temperatura ambiente durante 1 h.
- Enxaguar suavemente 3x, durante 5 min de cada vez, com PBS.
- Adicione uma gota do meio de montagem do anti-desvanecimento com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) para manchar os núcleos nos vasos hialóide.
- Coloc delicadamente um lamela no hialóide para terminar a montagem Lisa.
- Imagem latente e quantificação de embarcações hialóide liso-montadas
- Imagem a coloração DAPI de vasos hialóides com um microscópio fluorescente e certifique-se o HA central é visível (excluir as amostras sem o HA).
- Identificar as ramificações dos vasos diretamente derivadas do HA e contar manualmente o número de ramos da embarcação para quantificação.
- Visualização de vasos hialóides na seção transversal dos olhos
- Incorpore os globos oculares fixos no composto ideal da temperatura do corte em um molde apropriado do tecido, e então, congele os olhos incorporados no gelo seco ou armazene-os em um congelador de-20 ° c.
- Use um micrótomo do criostato para fazer uma seção transversal dos olhos incorporados em seções da espessura de 12 μm em-20 ° c.
- Colete as seções transversais do olho em uma temperatura de quarto da corrediça do microscópio tocando delicadamente as seções do tecido, que aderirão à corrediça.
- Seque para desidratar as seções do tecido para ~ 30 minutos, que podem então ser armazenadas em um congelador de-20 ° c até pronto para manchar.
- Enxague o slide 1x com PBS para remover o composto de temperatura de corte ideal restante no slide.
- Opcional Mergulhe a corrediça em um tampão fixador apropriado (por exemplo, paraformaldeído de 4% em PBS) por 15 minutos na temperatura ambiente para a fixação adicional, se necessário.
- Permeabilize o tecido com 0,1% Triton X-100 em PBS por 30 min à temperatura ambiente.
- Prepare o tampão de coloração de isolectin-IB4 para a mancha do vaso sanguíneo.
- Dissolver e reconstituir o pó de isolectin-IB4 (500 μg) com 50 mL de PBS num tubo de centrifugação de 50 mL.
- Adicione lentamente 50 μL de solução de 1 M de CaCl2 , gota a gota, no 50 ml da mistura de PBS/isolectin-IB4. Esta etapa precisa de ser executada lentamente para evitar a precipitação. A concentração final de CaCl2 é de 1 μm. A presença de CA2 + é necessária para a coloração de isolectin-IB4.
- Aplique 30 μL de tampão de coloração isolectin-IB4 nas secções transversais do olho no slide e incubar-o numa caixa húmida a 4 ° c durante a noite.
- Enxague 3x, por 5 min cada vez, com PBS.
- Adicione uma gota do meio de montagem do anti-desvanecimento com DAPI para manchar os núcleos nas seções.
- Coloc delicadamente uma lamínula nas seções do tecido para terminar a montagem Lisa.
- Verifique o tecido um microscópio para visualizar a presença de vasos hialóides dentro da ocular.
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Representative Results
Imagens in vivo de vasos hialóides em camundongos vivos
Figura 3 A revela visões transversais de imagens de OCT para a retina e tecidos hialóides em 3 meses de idade WT e Lrp5-/-camundongos, um modelo animal com hialoide persistente. O olho do WT mostra a ausência de tecido hialóide, enquanto que o Lrp5-/-Eye mostra dois vasos hialóides persistentes derivados da cabeça do nervo óptico. Figura 3 B exibe imagens de FFA de vasos hialóides persistentes (verde) no campo fluorescente em 6 semanas de idade Lrp5-/- ratos. O mouse WT não mostra nenhum remanescente de vasos hialóides, e o Lrp5-/-mouse mostra oito ramos de vasos hialóides no corpo vítreo.
Visualização ex vivo de vasos hialóides
Figura 4 A, B demonstra vasos hialóides isolados como visualizados em montagens planas, onde as células vasculares e os macrófagos associados foram manchados por seus núcleos com coloração DAPI (azul). O HA está no centro de cada imagem, e os vasos hialóides são revelados pelas linhas descontínuas derivadas de DAPI. Cada linha representa um vaso de VHP. Em Lrp5-/-camundongos, maiores números de vasos hialóides remanescentes foram observados no P8 em montagens planas (Figura 4A). Os camundongos WT apresentaram média de 12 ramos de vasos hialóides no P8, enquanto que os Lrp5-/- filhotes de idade apresentaram cerca de 25 ramos de vasos hialóides, demonstrando uma regressão significativamente prejudicada da vasculatura hialóide (Figura 4 B). Além disso, o desenvolvimento vascular do retina tardio e incompleto, outra característica frequentemente associada a vasos hialóides persistentes, também foi observado no Lrp5-/- filhotes (Figura 4C, D). A Figura 5 mostra os vasos hialóides remanescentes em secções transversais de Lrp5-/-Eyes at P8, enquanto os olhos WT não exibem vasos hialóides.
Figura 1 : Diagrama esquemático representando a regressão do desenvolvimento da vasculatura hialóide em olhos de rato. Vasos e ramos hialóides, incluindo VHP, TVL e PM, são derivados do HA, e ocupam muito do espaço entre a lente e a retina imaturo ao nascer (p0). A involução hialóide em camundongos começa com a regressão dos capilares da PM tão cedo quanto o P4. Nas camadas P8, PM, VHP e TVL são continuamente regressando, coincidindo com a formação completa da camada superficial dos vasos retinianas. Por P12, a involução da camada PM está completa, enquanto a atrofia de VHP e TVL ainda está em andamento. Entretanto, uma camada profunda de vasos retinianas começa a se formar durante a P7 – P12. Por P16, a regressão do sistema hialóide é parcialmente concluída (com os restantes vasos TVL e o HA esquerda), e a camada intermediária de plexo vascular da retina continua a se desenvolver. A vasculatura retiniana é totalmente maduro por P21 e assume o papel de nutrir os tecidos retinianas dos vasos hialóides, que agora são principalmente regredido. No P21, o vítreo, na ausência de vasos hialóides, mostra uma via Visual clara. Linhas vermelhas tracejadas representam as embarcações regressando. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica lentis lentis; PM = membrana pupilar; HA = artéria hialóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama esquemático que descreve o procedimento sequencial do isolamento de vasos hialóides para ex vivo de montagem plana visualização. (A) injeção de gelatina no olho enucleado através de quatro pontos injetados (pontos vermelhos) no limbo, para solidificar o corpo vítreo. (B) remoção da córnea e do nervo óptico, dissecção cuidadosa da íris e descamação do complexo sclera-choroid-RPE. (C) lanç o copo retinal restante com a lente para fazer o lado da retina virado para cima; Então, injetando PBS entre a retina e o corpo vítreo para separá-los, seguido descascando fora da camada retinal. (D) invertendo de cabeça para baixo novamente o resto do tecido, contendo a lente com o hialóide circundante. Levantando a lente ligeiramente para afrouxar a conexão de TVL e de VHP. (E) corte no ha entre o TVL e o VHP, e a remoção da lente e do TVL. Camada de montagem plana VHP. VHP = Vasa hyaloidea propria; TVL = Tunica lentis lentis; PM = membrana pupilar; HA = artéria hialóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagens in vivo de vasos hialóides com tomografia de coerência óptica (OCT) e angiografia por fluorescência de fundo (FFA). A: imagens representativas de OCT de WT e Lrp5-/-camundongos em 3 meses de idade mostrando vasos hialóides persistentes no espaço vítreo em Lrp5-/-Eyes. B: imagens de FFA representativas de WT e Lrp5-/-camundongos em 6 semanas de idade. Os camundongos foram injetados com 1mg de fluoresceina sódica em 0,1 ml de soro fisiológico por camundongo após anestesia, e as imagens foram tiradas 5 min após a injeção, focadas em vasos hialóides em Lrp5-/-camundongos ou corpo vítreo em WT (na ausência de vasos hialóides). Os vasos hialóides persistentes foram visualizados em Lrp5-/-mas não nos olhos de WT. As setas vermelhas indicam embarcações hialóides. Ambas as barras de escala: 100 μm (A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Visualização da regressão hialóide atrasada da embarcação e do desenvolvimento retinal atrasado do vasculatura em Lrp5-/-ratos. (A) imagens representativas de vasos hialóides de montagem plana corados com DAPI (azul) em WT e Lrp5-/-olhos em P8. As setas (brancas) indicam a artéria hialóide. (B) quantificação do número de vasos hialóides ramificando da artéria hialóide em WT e Lrp5-/-olhos. (C) retinas de montagem plana representativas coradas com isolectin-IB4 (vermelho) para a vasculatura em WT e Lrp5-/-olhos em P8. Linhas tracejadas brancas indicam a aresta da retina. As linhas amarelas indicam a aresta da área vascularizada. (D) quantificação da cobertura vascular do plexo vascular retiniano superficial em WT e Lrp5-/-Eyes. n = 8 – 12/grupo. As barras de escala nos painéis a e C = 1 mm. os dados são mostrados como média ± sem. teste tde Student de duas caudas foi utilizado para análise estatística. * *P < 0, 1. Este valor é modificado com a permissão de Wang et al.27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Visualização de vasos hialóides em secções transversais de Lrp5-/-Eyes. Imagens representativas de secções transversais de olhos isolados de WT e Lrp5-/-camundongos em P8. Os olhos eram enucleated e encaixados na temperatura de corte óptima, e as seções foram cortadas usando o cryostat. As secções transversais foram coradas com DAPI (azul) para mostrar os núcleos e isolectin-IB4 (vermelho) para mostrar os vasos sanguíneos. As setas brancas indicam embarcações hialóides. A barra de escala = 500 μm. Este número é adaptado com permissão de Chen et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Técnicas para avaliar e caracterizar vasos hialóides são procedimentos intuitivos e necessários para observar a regressão dos vasos hialóides em modelos animais, para permitir estudos sobre os mecanismos subjacentes à regressão vascular durante o desenvolvimento. Enquanto a imagem latente in vivo da retina permite a observação longitudinal da regressão hialóide no mesmo animal, o acesso a um sistema de imagem de fundo de roedores para OCT e FFA pode ser um fator limitante. Além, in vivo a imagem latente em ratos vivos não é praticável antes que abram seus olhos. Portanto, essa metodologia não é aplicável durante o desenvolvimento ocular na fase neonatal. Por outro lado, enquanto as seções transversais de imagem de olhos isolados podem ser usadas para qualquer idade do mouse e tem uma barreira técnica baixa, não é quantitativa quando há apenas alguns vasos hialóides visíveis, e a chance de obter uma imagem ideal depende em grande parte do ângulo de corte (Figura 5). Em comparação, o isolamento de vasos hialóides para visualização de montagem plana permite a imagem completa de todo o vaso hialóide e quantificação exata, mas os desafios técnicos podem existir devido à natureza delicada e frágil dos vasos hialóides. Esperamos que o protocolo detalhado neste artigo ajude a superar esses desafios.
Várias etapas críticas no protocolo de isolamento hialóide incluem a injeção da solução de gelatina, a remoção da retina e a montagem plana final. A dificuldade técnica de manusear a vasculatura hialóide reside na sua natureza delicada, o estado quase líquido-like do vítreo onde os vasos hialóides residem, e sua estreita ligação com a lente adjacente e a retina. Injetar solução de gelatina intravitreally é a chave para solidificar o corpo vítreo contendo vasos hialóides e, assim, tornando sua textura mais firme para facilitar a dissecção e manuseio. A gelatina é um agente gelatinante formando termorreversíveis géis elásticos transparentes. Injetando a forma líquida de gelatina (à temperatura ambiente ou a 37 ° c) no espaço vítreo e esfriando-a a uma temperatura mais baixa (4 ° c), o corpo vítreo se transforma em um copo de gel mais firme. Realizando múltiplas injeções de gelatina no olho permite a dispersão completa de uma quantidade suficiente de gelatina no espaço vítreo, para formar um uniforme e redondo gelatinizado copo de tecido hialóide. Outra dificuldade técnica reside na remoção da retina sem danificar o tecido hialóide. Ao contrário do choroid, que é relativamente fácil dissecar distante, o corpo vítreo gelatinizado que contem embarcações hialóide é desafiante separar da retina próxima sem danificar o hialóide. Nós encontramos que injetar PBS no espaço entre o corpo vítreo e o retina gerou uma camada líquida do amortecedor, fazendo o muito mais fácil separar estes dois tecidos. Isso é um pouco semelhante à técnica de hidrodissecção usada na cirurgia de catarata para separar a cápsula e o córtex da catarata. A montagem plana final é a última etapa tecnicamente difícil do protocolo. Aquecer o tecido hialóide gelatinizado em uma gota de PBS em um aquecedor de slides converte-lo de volta para uma forma mais líquida-like para permitir a montagem plana mais fácil. O arranjo e a orientação apropriados do copo hialóide do gel são ainda essenciais assegurar seu mesmo aplauso após a fusão e a secagem.
O protocolo de isolar embarcações hialóide pode mais ser modificado em diversas maneiras. A concentração de solução de gelatina que utilizamos é de 5%, mas concentrações mais elevadas ou mais baixas também podem funcionar, dependendo da preferência do pesquisador para alcançar uma textura mais firme ou mais macia para o manuseio. A mancha de DAPI de núcleos celulares pode igualmente ser modificada com isolectin-IB4 ou outros marcadores endothelial da pilha ou do macrófago, para distinguir melhor pilhas endothelial vasculares dos macrófagos. Uma palavra de cautela: as embarcações hialóides de montagem plana são muito delicadas e apenas frouxamente aderiram à corrediça; daqui, as corrediças hialóide precisam de ser tratadas muito delicadamente e com cuidado se enxaguar é necessário durante a mancha. Este protocolo de isolamento também tem suas limitações, incluindo a complexidade de realizar a dissecção fina e a dificuldade da preservação a longo prazo das amostras devido à natureza do tecido frágil. No entanto, os vasos hialóides isoladores e de montagem plana ainda são a maneira mais abrangente e intuitiva de estudar a vasculatura hialóide, para promover estudos oculares e angiogénese10,17,27, 29,30,31.
A vasculatura hialóide fornece um excelente modelo experimental de estudo do crescimento e regressão do vaso de desenvolvimento, relevante para campos de pesquisa em oftalmologia, angiogênese e morte celular programada, com a qual este trabalho visa auxiliar. Futuras modificações do protocolo de isolamento podem ser direcionadas para melhorar a viabilidade de um procedimento de dissecção técnica. Globalmente, a imagem combinada in vivo e o isolamento ex vivo de vasos hialóides é um método vantajoso para permitir a plena avaliação e caracterização de vasos hialóides em camundongos como um modelo útil de regressão vascular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) subvenções (R01 EY024963 e EY028100) para J.C. Z.W. foi apoiado por um Knights Templar Eye Foundation carreira Starter Grant. O procedimento de isolamento hialóide descrito neste estudo foi adaptado com modificação de protocolos generosamente compartilhados pelos Drs. Richard Lang, Toshihide Kurihara, e Lois Smith, a quem os autores são gratos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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