Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Svømning induceret lammelse at vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

Published: April 3, 2019 doi: 10.3791/59243
Automatic Translation
1, 2, 1,3,4
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Summary

Svømning induceret lammelse (SWIP) er en veletableret adfærdsmæssige analysen bruges til at studere de underliggende mekanismer af dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dog mangler der en detaljeret metode til at udføre analysen. Her, beskriver vi en trinvis protokol for SWIP.

Abstract

Svømning analysen er beskrevet i denne protokol er et gyldigt redskab til at identificere proteiner regulering af dopaminerge synapser. I lighed med pattedyr, dopamin (DA) styrer flere funktioner i C. elegans herunder læring og motoriske aktivitet. Betingelser at stimulere DA release (fx amfetamin (Ladeeffekt) behandlinger) eller at forebygge DA clearance (f.eks. dyr mangler DA transporter (dat-1) som er i stand til reaccumulating DA i neuroner) generere et overskud af ekstracellulære DA i sidste ende resulterer i hæmmet locomotion. Denne adfærd er især tydeligt, når dyr svømme i vandet. I virkeligheden, mens wild-type dyr fortsætter med at svømme i en længere periode, dat-1 null mutanter og wild-type behandlet med Ladeeffekt eller hæmmere DA transportørens synker til bunden af brønden og Flyt ikke. Dette problem kaldes "Svømning induceret lammelse" (SWIP). Selvom SWIP analyse er veletableret, mangler en detaljeret beskrivelse af metoden. Her beskriver vi et trin for trin guide til at udføre SWIP. For at udføre analysen, er sent larve fase-4 dyr placeret i en spot glasplade, der indeholder kontrolelementet rørsukkeropløsning med eller uden Ladeeffekt. Dyr er scorede for deres svømning adfærd enten manuelt af visualisering under en Stereoskopet eller automatisk ved optagelse med et kamera monteret på Stereoskopet. Videoer er derefter analyseret ved hjælp af en tracking software, som giver en visuel repræsentation af prygl frekvens og lammelse i form af varme kort. Både manuel og automatiseret systemer sikrer en let kvantificerbare udlæsning af dyrenes svømning evne og dermed lette screening for dyr bærer mutationer i det dopaminerge system eller hjælpeansatte gener. Derudover kan SWIP bruges til at belyse virkningsmekanismen af medicin misbrug såsom Ladeeffekt.

Introduction

Dyr udføre en række medfødte og komplekse adfærd, der er medieret af forskellige neurotransmittere koordineres af indviklede signaling processer. Neurotransmitteren dopamin (DA) formidler meget bevaret adfærd på tværs af arter, herunder læring, motorik og belønning behandling.

Jord nematode C. elegans, med en forholdsvis enkel og godt kortlagt nervous system bestående af kun 302 neuroner, viser markant komplekse adfærd, herunder mange, der er reguleret af DA parring, læring, fouragering, bevægelse, og æglægning 1. blandt andre funktioner, korte livscyklus, nem håndtering og bevarelse af signalering molekyler, fremhæve fordelene ved at bruge C. elegans som en model til at studere det neurale grundlag af bevarede adfærd.

Hermafrodit C. elegans indeholder otte dopaminerge neuroner; Udover disse indeholder mandlige seks ekstra par til parring formål. Pattedyr, disse neuroner syntetisere DA og express DA transporter (DAT-1), en membran protein findes udelukkende i dopaminerge neuroner, som transporterer DA udgivet i den synaptiske kløft tilbage i de dopaminerge neuroner. Desuden, de fleste af proteiner involveret i hvert trin i syntesen, emballage og frigivelse af DA er meget bevaret mellem orme og mennesker, og som i pattedyr, DA modulerer fodring adfærd og bevægelse i C. elegans2.

C. elegans kravler på faste overflader og svømmer med en karakteristisk gennemdrøfte opførsel i vand. Interessant, mutanter mangler udtryk for DAT-1 (dat-1) kravle normalt på fast overflade men undlader at opretholde svømning når nedsænket i vand. Dette problem blev kaldt svømning induceret lammelse eller SWIP. Tidligere forsøg påvist, at SWIP, delvis er forårsaget af et overskud af DA i den synaptiske kløft, der i sidste ende overstimulates D2-lignende postsynaptiske receptorer (DOP-3). Selv om oprindeligt identificeret i dat-1 knockout dyr3, SWIP til er også observeret i wild-type dyr behandlet med narkotika at blokere aktiviteten af DAT (fx imipramin4) og/eller fremkalde DA release (fx amfetamin5). På den anden side, forhindre farmakologiske eller genetiske manipulationer afværge syntese og frigivelse af DA og blokerer DOP-3 receptor funktion SWIP6. Taget sammen, har disse allerede offentliggjorte data etableret SWIP som et pålideligt redskab til at studere de adfærdsmæssige effekter forårsaget af muterede proteiner i dopaminerge synapser3,4,7 og skal anvendes til videresende genetiske skærme til identifikation af nye regulerende veje involveret i DA signalering7,8,9,10,11,12. Derudover ved at give en let kvantificerbare udlæsning af narkotika-induceret adfærd i levende dyr, SWIP giver mulighed for belysning af mekanismer for stoffer som amfetamin (Ladeeffekt) og azaperon på dopaminerge synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.

Protokoller til at udføre SWIP assays har været beskrevet før16. Her, beskriver vi i detaljer den metodologi og setup til at udføre analysen med målet om at give en visuel guide til C. elegans Fællesskabet effektivt udføre SWIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af løsninger og medier

  1. Forberede M9 buffer ved at opløse KH2PO4 3,0 g (22.05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM), og NaCl 5,0 g (85,5 mM) i 1 L autoklaveres deioniseret vand. Der tilsættes 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g i en endelige rumfang af 100 mL autoklaveres deioniseret vand) efter autoklavering. Blandes 100 mL af den resulterende 10 x M9 med 900 mL autoklaveres deioniseret vand for at gøre en 1 x løsning.
  2. For at gøre æg buffer, 6.896 g NaCl (118 mM), 3.578 g af KCl (48 mM), 0.294 g af CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g af MgCl2-6 H2O (2 mM) og 5.958 g (25 mM) opløses af HEPES i 1 L autoklaveres deioniseret vand. Justere pH til 7,3 ved hjælp af NaOH.
  3. Forberede frisk natriumhypochlorit/NaOH opløsning ved at tilføje 1 mL af 5-6% natriumhypochlorit (blegemiddel) og 180 µL af 10 N NaOH til 3,8 mL deioniseret vand.
  4. Vejer 60 g saccharose og opløses i autoklaveres deioniseret vand til en endelige rumfang på 100 mL, gøre 60% rørsukkeropløsning.
  5. Opløses 0.684 g saccharose i 10 mL autoklaveres deioniseret vand at gøre 200 mM saccharose. Kontroller og Juster til det samme en osmolaritet ved hjælp af osmometer. Gøre 1 mL alikvoter i 1,5 mL microcentrifuge rør og fryse ved-20 ° C.
  6. 0.184 g af Ladeeffekt (Molekylær vægt 184.75 g/mol) afvejes og opløses i 10 mL deioniseret vand at gøre en 100 mM stamopløsning. Bland 2 µL af stamopløsningen i 400 µL vand at gøre 0,5 mM brugsopløsning.
  7. Forbered næringsstoffer vækst medier (NGM) plader
    1. Mix 3 g NaCl (52.65 mM), 20 g af pepton, 25 g bacto-agar og 975 mL deioniseret vand i en 2 L erlenmeyerkolben. Omfatte en magnetisk røre bar og autoklave (121 ° C, 15 PSI) i 1 time ved hjælp af flydende cyklus.
    2. Afkøles til og holde temperaturen på omkring 50 ° C ved at placere kolben på en radiator under omrøring. Der tilsættes 0,5 mL af kolesterol (5 mg/mL ethanol), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 og 25 mL 1 M kalium fosfat buffer, pH 7,4 (108.3 g af KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 deioniseret vand til 1 L).
    3. Der afpipetteres 25 mL hver i 100 mm x 15 mm Petri plader og tillade medierne til at størkne. Store plader op og ned på 4 ° C i en boks til op til 4 uger.
  8. Forberedelse af Lysogeny bouillon (LB) bouillon
    1. 5 g af LB pulver blanding i 200 mL deioniseret vand i en Erlenmeyerkolbe opløses. Autoklave i 30 minutter udnytter den flydende sterilisation cyklus. Tillad bouillon at køle ned. Opbevares ved stuetemperatur i 1-2 uger.
  9. Forberedelse af NA22 bakteriel plader
    1. Brug spidsen af en steril pipette eller en steril bakteriel løkke streak en LB-plade med en lille mængde af NA22 E. coli bakterier fra glycerol lager og inkuberes pladen op og ned i et 37 ° C inkubator natten over for at vokse isolerede kolonier. Vælge og indføre en enkelt koloni i 200 mL af LB bouillon forberedt i trin 1,8 og lade vokse natten over ved 37 ° C på en rystende platform.
    2. For at frø pladerne, dispensere 200 µL af bakteriekulturen på NGM pladerne udarbejdet tidligere i trin 1.7 og spredes med et sterilt glas hockey stick. Lad pladerne tørre natten over eller længere under en hætte og gemme hovedet i en lufttæt boks ved 4 ° C.
  10. For at gøre øjenvipper/platin værktøj at vælge orme, lim en tyk øjenvipper eller en platin glødetråden i et glas Pasteur afpipetteres bruger superlim. Skær spidsen af øjenvipper i en vinkel ved hjælp af et barberblad. Alternativt, en bunsenbrænder kan bruges til at smelte spidsen af glas pipette omkring platin glødetråden.

2. C. elegans dyrehold

Bemærk: Kultur vildtype N2C. elegans stamme på Escherichia coli NA22 plader. Detaljeret kultur metoder er beskrevet nedenfor.

  1. Forberedelse af ormen kultur
    1. For at gøre en igangsætter kultur af orme, skåret et lille stykke af agar fra en plade der indeholder velnærede dyr og overføre det til en NA22 E. coli bakterier plade forberedt i trin 1.9 ved hjælp af en steril spatel. Inkuber plader ved 20 ° C i 3-4 dage. Under et stereo mikroskop, visuelt bekræfte tilstedeværelsen af fælderne voksne.
  2. Forberedelse af synkroniserede befolkning af orme
    1. Indsamle fælderne voksne fra mindst 2 plader ved dispensering autoklaveres deioniseret vand hele vejen rundt på pladen ved hjælp af en sprøjte flaske. Forsigtigt swirl plade for at løsne ormene og indsamle ormene ind i en 15 mL polystyren koniske rør ved hjælp af en engangs plast pipette.
    2. Spin ned i røret i en centrifuge på 140 x g i 2 min. til sammenpresse orm, så Opsug fra supernatanten ved hjælp af en vakuumpumpe eller med indbygget laboratorium vakuum.
    3. Resuspend og vask orme ved at fylde røret med autoklaveres deioniseret vand og blandes og centrifugeres ved 140 x g i 2 min. Aspirér supernatanten og gentage det sidste trin to gange eller indtil orme er klar fra bakterier (vand vises tydeligt når blandet med orme).
    4. Der tilsættes 5 mL af frisklavet natriumhypochlorit/NaOH opløsning (trin 1.3) til orm pellet og hurtigt blandes ved hjælp af en vortex. Inkuber rør på en rocker for omkring 4-8 min. Af fordøjelsesprocessen med natriumhypochlorit/natriumhydroxidoploesning svinger mellem 4-8 minutter baseret på kvaliteten af stock natriumhypochlorit løsning (blegemiddel).
    5. Sæt en dråbe (2-50 µL) opløsning indeholdende orme på et glas objektglas og kontroller hver 2 min. under mikroskop for orm lysering. Når ca. 70% af orme er mængden og æg er frigivet, fyld glasset med æg buffer forberedt i trin 1.2 og straks centrifugeres i 1 min på 140 x g pellet embryoner og ormen slagtekroppe.
    6. Opsug supernatanten og vaske pellet 3 flere gange ved at fylde røret hver gang med æg buffer. Spin ned på 140 x g i 1 min og Fjern supernatanten hver gang. Pellet bliver hvidt i slutningen af vasker.
    7. Efter den sidste vask, skal du adskille embryoner fra døde kroppe i 30% rørsukkeropløsning. Tilsættes 5 mL af autoklaveres deioniseret vand til pellet, resuspend og tilsættes 5 mL af 60% saccharose forberedt i trin 1.4. Bland grundigt og centrifugeres ved 160 x g for 6 min.
    8. Bruge et glas Pasteur pipette til at overføre embryoner flydende på den øverste menisk i en frisk 15 mL konisk slange. Tag ikke mere end 3-4 mL. For at fjerne enhver resterende saccharose, vaske embryonerne 3 gange med autoklaveres vand ved centrifugering ved 140 x g i 3 min, fjernelse af supernatanten og resuspending pellet (og påfyldning røret) hver gang.
    9. Gentag skylninger med 1 x M9 buffer. Hold resuspenderes i 10 mL af M9 efter den sidste vask. Forlade rør på en shaker natten over (ikke mere end 14 h) for æg at klække til L1 larver. Orme vil forblive i L1 larver fase skyldes mangel på mad.
    10. Vask af L1 larver 3 gange med autoklaveres vand for at fjerne enhver feromoner, udgivet af larverne ved centrifugering ved 140 x g i 2 min. Resuspend larverne i 1 mL vand. Gøre en 1:10 fortynding af orme i vand, tilsæt 10 µL slip på et glas dias, sætte en coverslip på og tælle antallet af orme under en Stereoskopet. Gentag dette to gange og gennemsnittet af resultaterne.
    11. Pipette volumen af orme, der svarer til omkring 1.000 orme på en NA22 plade, (der tidligere blev bragt til stuetemperatur) ved at placere små dråber på pladen. Forlade pladen halv-lukke op indtil drop tørrer. Derefter dække pladen og inkuberes hovedet i 20 ° C inkubator for omkring 44-48 h, eller indtil ormene når L4 sent, som bekræftede visuelt under et stereomikroskop. Ormene er nu klar til at blive testet for SWIP.

3. SWIP

Bemærk: Vi beskriver den manuelle metode til vurdering af SWIP i vildtype orm behandling med Ladeeffekt. Vi diskuterer også kort sporing af orme og yderligere analyse af ormen kinetik ved hjælp af en automatiseret orm tracker og en tracking software, som tidligere var beskrevet af Hardaway et al.10.

  1. Manuel metode til at teste for SWIP
    1. Alikvot 40 µL af 200 mOsm/L rørsukkeropløsning, enten med eller uden 0,5 mM Ladeeffekt i en spot glasplade. Under Stereoskopet, pick 8-10 sene-L4 fase orme med en øjenvipper eller platinum pick og nedsænkes pick i pladen som indeholder løsningen indtil orme flytte ud pick og svømme ind i løsningen. Bemærk antallet af orme plukket i brønden, begynder timeren, observere og registrere antallet af orme udstiller SWIP på hvert minut mark.
    2. Kopiere de rå data til et regneark og beregne procentdelen af orme lammet ved at dividere antallet af orme lammet i hvert øjeblik af samlede antal orme testet i hele analysen og ganger med 100. Kopiere de procent værdier i enhver graftegning og statistisk software og plot data med procent værdier på Y-aksen og tid på X-akse ved hjælp af XY grafen format.
    3. Udføre to-vejs ANOVA efterfulgt af post-hoc analyse (f.eks. Bonferroni post-test) for at teste for Statistisk signifikans blandt kontrol, Ladeeffekt grupper og tidspunktet for behandling.
  2. Automatiseret analyse af SWIP
    1. Udføre automatiseret analyse på en enkelt orm ad gangen. Protokol til at indstille kameraet, orm tracker software og scriptet til at køre tracking software analyse er beskrevet i detaljer i Hardaway et al.16.
    2. Kort, placere en enkelt sene L4 fase hermafrodit i en spot glasplade udnytter en øjenvipper pick, som beskrevet i den manuelle metode i afsnit 3.1.2. Optage svømning videoer af en orm på tid og bruge ormen tracker software til at beregne hyppigheden af kroppen bøjninger.
    3. Følg det script, der leveres med tracking software at få orm gennemdrøfte frekvens og til at generere varme kort fra ormen gennemdrøfte data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi præsenterer et eksempel på SWIP assay induceret af Ladeeffekt behandling. Figur 1 viser et skematisk gengivelse af assay-opsætningen som beskrevet ovenfor. For manuel assay, omkring 8-10 alder synkroniserede sent L4 fase orme er indsamlet med en øjenvipper eller platinum pick og placeret i en spot glasplade, fyldt med 40 µL af 200 mOsm/L saccharose (styringsløsning) eller saccharose med 0,5 mM Ladeeffekt og testet for SWIP.

Når dyr stopper svømning (dvs., udstille SWIP), de hurtigt synker til bunden af brønden og ikke flytte. Derfor er forskelsbehandling mellem dyr, der stadig svømmer på overfladen af vandet versus dem, der er stabil i bunden af brønden meget ligetil. De fleste af ormene testet i kontrol løsning svømme uafbrudt i mindst 10 minutter, mens under Ladeeffekt behandling, antallet af dyr udviser SWIP gradvis øges. Den maksimale procentdel af dyr udviser SWIP er proportional med koncentrationen af Ladeeffekt anvendes1,5,13. Når DAT-1 knockout (dat-1) orme er testet i styringsløsning, udstille 40-70% orme SWIP inden for 10 minutter4,13. Dette resultat kan sammenlignes med procentdelen af lammet dyr målt i wild-type dyr behandlet med 0,5 mM Ladeeffekt (figur 2).

Orme udsættes for enten saccharose eller saccharose indeholdende Ladeeffekt viser ikke SWIP i det første minut af observation (figur 2). Men mens orme behandles med saccharose fortsætter med at svømme i 10 minutter, orme behandles med Ladeeffekt begynde at udstille SWIP efter 2 minutter af behandling og efter 10 minutter, 66 ± 3% dyr viser SWIP (figur 2).

Til automatiseret analyse, videoer af orme under kontrol eller Ladeeffekt behandlinger registreres en orm ad gangen ved hjælp af en video-optagelse software. En computer tracking software bruges til at spore orm prygl og de resulterende data er importeret til og analyseret med software jakkesæt. Prøver af varme kort af dyr eksponeret for kontrol eller Ladeeffekt, vise aktivt flytter dyr i rød og lammet orm i grøn, er vist i figur 3.

Figure 1
Figur 1 : Assay sat op for SWIP. Fælderne voksen wild-type (N2) orme var mængden med natriumhypochlorit/NaOH behandling at frigive embryoner. Embryoner blev tilladt klækkes og udvikle sig til synkroniserede L1 larver i M9 buffer til 14 h på en shaker og derefter belagt på en NGM plade med NA22 bakterier. Efter 42-48 h var sent L4 Stadium larver visuelt identificeret under Stereoskopet og tog med en øjenvipper pick i en spot plade med eller uden amfetamin i kontrol rørsukkeropløsning og scorede for SWIP, enten manuelt eller via automatiseret analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Amfetamin-induceret SWIP ved hjælp af manuel assay. Orme i saccharose eller saccharose med 0,5 mM amfetamin (Ladeeffekt) var visuelt scorede for SWIP adfærd hvert minut ved hjælp af en Stereoskopet. Procent af dyr udstillende SWIP blev beregnet ved at dividere antallet af lammet orme af det samlede antal orme analyseres for hvert tidspunkt, og derefter at multiplicere resultatet med 100. Procent af orme udsættes for Ladeeffekt (blå firkanter) viser SWIP stigninger overarbejde, mens de ubehandlede orme (røde cirkler) fortsætter med at svømme under vinduet 10 minutter. N repræsenterer antallet, der er undersøgt i hver gruppe. Fejllinjer angive standard fejl af midler (SEM). Statistisk signifikans blev vurderet ved at udføre to-vejs ANOVA med Bonferroni flere sammenligning test (p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Amfetamin-induceret SWIP via automatiseret analyse. Videoer af orme i saccharose eller saccharose med 0,5 mM Ladeeffekt blev registreret ved hjælp af et kamera monteret på en Stereoskopet. Svømning videoer af individuelle orme blev sporet med en tracking software og analyseret ved hjælp af sporing software kulør. Varme kort blev genereret fra data hvor røde områder viser de orme, der er aktivt bevæger sig, og grønne områder viser lammet orme. Hver eksperimentelle gruppe er repræsentant for 6 dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi en trinvis protokol for at udføre en adfærdsmæssige analyse, SWIP, i C. elegans. Denne protokol er enkel og ligetil med ingen store tekniske forhindringer gør dette assay meget bruger venligt. Alligevel er der nogle vigtige aspekter, der skal overvejes for at effektivt udføre analysen.

Pleje bør tages til at sikre, at ormene bruges til analysen er godt fodret, da kosten restriktioner påvirker SWIP17. Skånsom håndtering af orme mens picking som godt timet natriumhypochlorit/NaOH behandling under lysis er kritiske faser, som traumer under pluk (mere almindelig, når du bruger en platin pick) eller udvidet eksponering af embryoner til natriumhypochlorit/NaOH opløsning kan forårsage permanent skade på orme18 og dermed svække deres evne til at svømme.

Steril teknik bør følges for at undgå kontaminering. Forurening af agar plader kompromiser for dyrenes sundhed og dermed ændrer deres evne til at svømme. Lille forskel i andelen af dyr udviser SWIP kan observeres ved hjælp af agar plader seedede med forskellige stammer af E. coli bakterier (NA22, OP50, osv.). I vores protokol bruger vi NA22 til at give et stort antal orme.

Glas-spot plader, anvendes under SWIP analysen, er foretrukket at plast plader, fordi de kan blive grundigt vasket, autoklaveres og genbruges når forskellige typer af narkotika er testet.

En anden vigtig faktor der skal tages i en SWIP analyse er den flydende medier, hvor dyrene er testet19osmolaritet. I vores protokol bruger vi saccharose for at bringe vand op til 200 mOsm/L, som var tidligere vist sig at være en optimal tilstand for dyr (Blakely RD. personlig kommunikation) osmolaritet. Vand med en kontrolleret osmolaritet foretrækkes, fordi det fjerner eventuelle forskelle i kvaliteten af vand over flere assays udført på forskellige dage, uger eller måneder. Navnlig, udviser dat-1 og wild-type dyr behandlet med Ladeeffekt ikke SWIP hvis salt løsninger (f.eks. M9 løsning) bruges som kontrol medier.

Tidsforbruget for de fleste af dyrene til at udstille SWIP kan let ændre blandt forskellige orm faser (L1-L4). For eksempel rapporterede Masoudi et al. (2014), at efter 5 min. 80% af dat-1 L1 dyr stadig svømme, således kun 20% af dyr udviser SWIP. På den anden side svømme kun 50% af L4 dat-1 dyr stadig efter 5 min20. Derfor er det vigtigt, at dyr testet for SWIP er analyseret på samme alder. Vi har optimeret vores analyse bruger altid sent L4 iscenesat dyr. Sen L4 larver har fordelen at være let genkendelig blandt de andre larve etaper, fordi, på dette stadium, dyr har nået deres voksne størrelse og udstille en karakteristisk tynd skillelinjen den hvide plet i midten af deres krop, der senere vil differentiere i en moden vulva. Tidsrummet assay er også kritisk. For eksempel, efter 15 minutter 90% af L4 dat-1 mutanter udstille SWIP men på senere tidspunkt (30 min), kun 60% af dem udviser SWIP20.

Automatiseret SWIP analysen eliminerer menneskelige fejl og forbedrer high throughput screening med hensyn til manuel assays. Dog tracking software programmer er tidskrævende, da de kan kun spore en enkelt orm ad gangen.

Med hensyn til andre C. elegans DA-afhængige adfærd er SWIP en mindre tidskrævende assay. For eksempel, er den basale aftagende svar2 ikke en umiddelbar-type af assay. I virkeligheden, orme skal fodres kronisk med narkotika, og dette kunne resultere i penetrant og off-target effekter. Således kan det ikke være så effektiv til at screene for narkotika.

En af de vigtigste anvendelser af SWIP er at screene for forskellige stoffer der er rettet mod den dopaminerge pathway. I tilfælde, hvor narkotika ikke er vandopløselig (f.eks. mazindol), skal passende fortyndinger udføres for at opnå koncentrationer hvor transportøren løsning er ikke giftigt til ormene. Desuden, hvis det samme stof i forskellige koncentrationer er brugt5,13,14, dosis-respons-kurver kan også analyseres. For eksempel, kan satsen for progression (hældningen af kurven af dyr pr. minut, figur 2) rapporteret som funktion af koncentrationen og bruges til at sammenligne effekter af forskellige stoffer (fx Ladeeffekt vs kokain).

Når SWIP er brugt til at undersøge virkningsmekanismen af narkotika på dopaminerge synapser, lægges hvis resultaterne er udvidet til andre dyr. Eksempelvis har imipramin, en specifik hæmmer af pattedyr noradrenalin-transportøren (NET) været brugt til at fremkalde DA-mægle SWIP i N2 dyr4. C. elegans gør ikke synthetize noradrenalin og derfor udtrykker ikke nettet. C. elegans DA transporter deler imidlertid homologi med pattedyr netto21. Af denne grund vise lægemidler, der er specifikke hæmmere af pattedyr NET og har begrænsede virkninger på pattedyr DAT (fx imipramin) høj selektivitet til C. elegans DAT. Således kan arter selektivitet begrænse vores evne til at ekstrapolere resultaterne fra C. elegans til mennesker.

Den vigtigste faktor til at overveje, når designe SWIP assays er medtagelsen af eksperimenter viser, at SWIP er medieret af dopaminerge system. I virkeligheden, kunne nedsat svømning genereres af andre faktorer end gener relateret til DA system (f.eks. generelle defekter i muskler sammentrækning). For at sikre, at SWIP er faktisk medieret af DA, bør protokoller omfatte eksperimenter udført med dyr, hvor DA er blevet forarmet. Dette kan opnås ved enten ved hjælp af knockout dyr mangler udtryk af kat-2, C. elegans homolog af tyrosin hydroxylase, der er trafikhastighedsbegrænsning enzymet for DA syntese eller ved forudgående behandling af wild-type dyr med reserpine, en stof, der forårsager DA udtømning fra vesikler3. For eksempel viste McDonald et al.3 , at basal SWIP observeret i dat-1 mutanter blev gendannet, når disse dyr blev forbehandlet med reserpine. Dette resultat tyder på, at SWIP er DA-medieret. På den anden side viste bruger kat-2, dat-1 og mutanter mangler udtryk for hver af de dopaminerge receptorer, Safratowich et al. (2014), at spore Amin β-phenylethylamin (βPEA) inducerer SWIP inden for 1 minut af behandling uafhængigt fra DA men ved direkte aktivering af ligand-gated ion kanal LGC-5514. Forfatterne viste, at βPEA - og DA-induceret SWIP er mekanisk forskellige, og de kan være let diskriminerede eksperimentelt. I virkeligheden, mens βPEA-induceret SWIP er DA- og dop-3-uafhængig, når maksimal værdier inden for 1 min og hurtigt falder efter 2 min14, DA-medieret SWIP er kat-2 og dop-3 afhængige og er det væsentlige nul efter 1 minut (figur 2). Således er der en stor forskel i tidsforbruget til at opnå maksimal effekt, og dette giver mulighed for at hurtigt diskriminere mellem de to fænomener: 1) den hurtigt βPEA-induceret SWIP inden for 1 minuts fremstillet ved direkte aktivering af LGC-55 kanaler og 2) den langsomme Overstimuleret DA-medieret SWIP, der opstår, når et overskud af ekstracellulære DA hober sig op over tid (10-15 min) og DA receptorer DOP-3 er3.

Afslutningsvis, med den rigtige sæt af forsøg, som omfatter brugen af knockout dyr til nøglespiller gener af det dopaminerge system (kat-2, dat-1, dop-3) og brugen af stoffer, der nedbryder DA lagre (reserpine), har SWIP været med held anvendt til at belyse virkningsmekanismen af stoffer som Ladeeffekt5,13, βPEA14,15 og azaperon6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Osama Refai fra Dr. Randy Blakely lab for vejledning med automatiseret analyse af SWIP. Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH R01 DA042156 til LC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil Reynolds wrap 1091835
Amphetamine Sigma 51-63-8  
Autoclave
Bacterial Incubator New Brunswick scientific M1352-0000
Bacteriological grade, Agar Lab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) Peptone BD REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Thorlabs U-CMAD3
Centrifuge  Eppendorf 5810R 15amp E215059
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5
Deionized water Millipore Z00QSV0WW Milli-Q
Depression glass spot plate Corning Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask ThermoFisher 4103-0250PK
Eye lash
Glass slide Fisherbrand 12-550-15
Graphing and statistical software Prism Graphpad 5
HEPES Sigma-Aldrich RB=H3375 & H7006
Hypochlorite Hawkins Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller Fisher BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate) Sigma-Aldrich RB=M0250 500 g
Magnesium sulfate (heptahydrate) Sigma-Aldrich M1880
Magnetic stir bar Fisherbrand 16-800-510 
Microcentrifuge tubes ThermoFisher 69715
NA 22 bacteria CGC
Nystatin Sigma 1400-61-9
Osmometer Advanced Instruments, Inc Model 3320
Pasteur Pipettes Fisherbrand 13-678-20A
Petriplates Falcon 351007
pH Meter Orion VersaStar Pro IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes Falcon 352095
Potassium Chloride Sigma-Aldrich  P9541
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 7778-77-0
Potassium Phosphate - DIBASIC Sigma-Aldrich P-8281
Potassium Phosphate - MONOBASIC Sigma-Aldrich P0662
Serological pipettes VWR 10ml=89130-898
Shaker Reliable Scientific 55S 12x16
Sodium Chloride Fisher RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate Fisher RB=S381
Spreadsheet MS office Microsoft Excel
Stereo Microscope Zeiss Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips Various 02-707-400
Sucrose Sigma-Aldrich RB=S5016
Superglue Loctite 1647358 .14 oz.
SwimR sofware 10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2 Worm Tracker 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software Virtualdub http://www.virtualdub.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
  2. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  3. McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
  4. Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
  5. Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
  6. Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
  7. Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
  8. Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
  9. Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
  10. Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
  11. Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
  12. Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
  13. Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
  14. Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
  15. Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
  16. Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
  17. Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
  18. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  19. Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
  20. Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
  21. Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).

Tags

Adfærd spørgsmålet 146 C. elegans adfærd dopamin signalering dopamin transporter amfetamin prygl
Svømning induceret lammelse at vurdere dopamin signalering i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli,… More

Kudumala, S., Sossi, S., Carvelli, L. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (146), e59243, doi:10.3791/59243 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter