Summary
Denne protokollen beskriver induksjon av pulmonal hypertensjon (PH) hos mus basert på eksponering for hypoksi og injeksjon av en VEGF reseptor antagonist. Dyrene utvikler PH og høyre ventrikulær (RV) hypertrofi 3 uker etter initiering av protokollen. Den funksjonelle og morfometriekarakteriseringen av modellen presenteres også.
Abstract
Pulmonal hypertensjon (PH) er en patofysiologisk tilstand, definert av et gjennomsnittlig pulmonal arterielt trykk som overstiger 25 mm Hg i ro, som vurdert ved høyre hjertekateterisering. Et bredt spekter av sykdommer kan føre til PH, forskjellig i deres etiologi, histopatologi, klinisk presentasjon, prognose og respons på behandling. Til tross for betydelig fremgang de siste årene, er PH fortsatt en uregistrert sykdom. Å forstå de underliggende mekanismene kan bane vei for utvikling av nye terapier. Dyremodeller er viktige forskningsverktøy for å oppnå dette målet. For tiden er det flere modeller tilgjengelig for rekapituerende PH. Denne protokollen beskriver en to-hit mus PH-modell. Stimuli for PH utvikling er hypoksi og injeksjon av SU5416, en vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) reseptor antagonist. Tre uker etter initiering av hypoksi/SU5416 utvikler dyr lungevaskulær remodeling som etterligner histopatologiske endringer observert i human PH (hovedsakelig gruppe 1). Vaskulær remodeling i lungesirkulasjonen resulterer i ombygging av høyre ventrikkel (RV). Prosedyrene for måling av bobiltrykk (ved hjelp av den åpne brystmetoden), de morfologiske analysene av bobilen (ved å dissekere og veie både hjerte ventrikler) og histologiske vurderinger av remodeling (både lunge ved å vurdere vaskulær remodeling og hjerte ved å vurdere RV kardiomyocytt hypertrofi og fibrose) er beskrevet i detalj. Fordelene med denne protokollen er muligheten for søknaden både i vill type og i genmodifiserte mus, den relativt enkle og rimelige implementeringen, og den raske utviklingen av sykdommen av interesse (3 uker). Begrensninger av denne metoden er at mus ikke utvikler en alvorlig fenotype og PH er reversibel når de går tilbake til normoksi. Forebygging, samt terapistudier, kan enkelt implementeres i denne modellen, uten nødvendigheten av avanserte ferdigheter (i motsetning til kirurgiske gnagermodeller).
Introduction
Pulmonal hypertensjon (PH) er en patofysiologisk tilstand, definert av et gjennomsnittlig lungearterialt (PA) trykk som overstiger 25 mm Hg i ro, som vurdert ved høyre hjertekateterisering1,2. Det finnes en rekke sykdommer som kan føre til PH. I et forsøk på å organisere ph-tilknyttede forhold er det utviklet flere klassifiseringssystemer. Den nåværende kliniske klassifiseringen kategoriserer flere PH-assosierte sykdommer i 5 forskjelligegrupper 1. Dette skillet er av betydning siden ulike pasientgrupper har sykdommer som varierer i klinisk presentasjon, patologi, prognose og respons på behandling2. Tabell 1 oppsummerer den nåværende klassifiseringen, supplert med de grunnleggende histopatologiske egenskapene til hver sykdom.
Tabell 1: Oversikt over klinisk klassifisering av PH, sammen med de viktigste histopatologiske trekkene i gruppene. Egnetheten til Hypoksi/SU5416-protokollen for modellering av PH. Denne tabellen er endret fra19. PH: Pulmonal hypertensjon, PAH: Pulmonal arteriell hypertensjon
Til tross for betydelige fremskritt i behandlingen av PH-assosierte sykdommer, forblir PH fortsatt uten en kur, med en 3-års dødelighet mellom 20% og 80%3. Dette indikerer det avgjørende behovet for å forstå de underliggende mekanismene til PH og deretter utviklingen av nye terapier for å forhindre, bremse utviklingen og kurere sykdommen. Dyremodeller er av avgjørende betydning for dette omfanget. For tiden finnes det ulike modeller for å studere PH. Den interesserte leseren er referert til de gode anmeldelsene om dette emnet2,3,4. Med tanke på mangfoldet av sykdommer som fører til PH, er det åpenbart at de ulike forholdene til menneskelig PH ikke kan perfekt rekakalateres i en dyremodell. Dyr modeller tilgjengelig kan kategoriseres i i) single-hit, ii) to-hit, iii) knockout, og iv) overexpression modeller3. I single-hit-modellene induseres PH av en enkelt patologisk stimulans, mens to-hit-modeller kombinerer to patologiske stimuli med mål om å indusere mer alvorlig PH og dermed nærmere etterligne den komplekse menneskelige sykdommen. Foruten de etiologiske forskjellene resulterer de flere stimuliene i PH-modelleringsforskjeller som også avhenger av arten og dyrenes genetiske bakgrunn4.
En av de mest brukte klassiske PH gnagermodeller er kronisk hypoksi modell2. Hypoksi er kjent for å indusere PH hos mennesker så vel som i flere dyrearter. Hypoksi har fordelen av å være en fysiologisk stimulans for PH (tabell 1). Men mens graden av hypoksi som brukes til å indusere PH hos gnagere er mye mer alvorlig enn hos mennesker, fører enkeltfornærmelse (hypoksi) bare til en mild form for vaskulær ombygging. Dette imiterer ikke alvorlighetsgraden av den menneskelige sykdommen. Tilsetning av en andre-hit, en ekstra stimulans for å indusere PH, viste lovende resultater: injeksjon av forbindelsen SU5416 til gnagere kombinert med hypoksisk stimulansindusereren mer alvorlig PH fenotype 2,5,6. SU5416 er en hemmer av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) reseptor-2. Det blokkerer VEGF reseptorer og fører til endotelcelle apoptose. Under hypoksiske forhold stimulerer dette spredningen av en undergruppe av apoptoseresistente endotelceller. Videre fører SU5416 til jevn muskelcellespredning. Kombinasjonen av disse effektene resulterer i patologisk vaskulær remodeling av lungesirkulasjonen og fører til forhøyet PA-trykk og høyre ventrikulær remodeling2,,5,,7. Modellen ble først beskrevet hos rotter6 og senere brukt på mus4,5,7. Musemodellen viser mindre alvorlig vaskulær ombygging sammenlignet med rotter. Videre, når den returneres til normoksi, fortsetter PH å utvikle seg hos rotter, mens hos mus er det delvis reversibel.
Følgende protokoll beskriver alle trinnene for modellering av PH hos mus ved hjelp av Hypoksi/SU5416-metoden (planlegging, tidslinje, utførelse). I tillegg er karakteriseringen av modellen beskrevet i denne protokollen: funksjonelt (ved å måle riktig ventrikulært (RV) trykk ved hjelp av den åpne brystteknikken), morfometrisk (ved å dissekere og veie både høyre og venstre ventrikler), samt histologisk (ved å evaluere lungevaskulær remodeling, høyre ventrikulær kardiomyocytt hypertrofi og fibrose).
Alle trinnene og metodene som er beskrevet i denne protokollen, kan enkelt implementeres av undersøkere på alle erfaringstrinn. Mens de funksjonelle målingene av RV ved hjelp av den åpne brystteknikken (beskrevet her) ikke er gullstandardmetoden i feltet, har den fordelen at den raskt kan læres og nøyaktig reproduseres selv av en mindre erfaren eksperimenterer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før noen dyreforsøk få den lokale institusjonelle dyrevernkomiteen autorisasjon. De nåværende eksperimentene ble utført etter godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. PH induksjon
- Forberedelse
- Før du begynner studien, nøye planlegge eksperimentell design. Sørg for at mus utsettes for hypoksi samtidig som den første SU5416 injeksjonen. Et eksempel på eksperimentell design for å indusere PH ved hjelp av Hypoksi/SU5416-metoden er vist i figur 1A. Kontrollmus fikk bare kjøretøyet. For denne modellen vil SU5416 bli injisert til musene en gang per uke i 3 sammenhengende uker.
- Bruk åtte til tolv uker gamle C57BL/6-mus til denne studien. Hus dyrene ved 18-20 °C i en 12-h lys-mørk syklus. Sørg for at mat og vann er tilgjengelig ad libitum.
- Vei dyrene. Tilordne dem tilfeldig til hver gruppe: Normoksi og hypoksi/SU5416.
- Forbered det hypoksiske kammeret som vist i figur 1B. Sikre nitrogentanker (N2) i nærheten av kammeret. Sett oksygenregulatoren (O2) på et punkt på 10 % O2. La systemet nå en jevn tilstand.
- Klargjør SU5416 til injeksjon (bruk en dose på 20 mg/kg kroppsvekt). SU5416 oppløses ikke i vandige løsninger; Oppløs derfor det beregnede beløpet i 100 μL DMSO8. For eksempel, for en 25 g mus, mengden SU5416 som skal injiseres er 0,5 mg oppløst i 100 μL løsemiddel (DMSO). Den endelige konsentrasjonen av SU5416 for denne musen er derfor 5 mg/ml.
FORSIKTIG: SU5416 er et farlig materiale. Les sikkerhetsdatabladet nøye sammen med produktet og sørg for å ta de anbefalte forholdsreglene ved håndtering av dette stoffet. Bruk vernehansker og (som for enhver injeksjon) bruk vernebriller. Den kjemiske strukturen til SU5416 er vist i figur 1C.
MERK: Beregn et passende overskudd av oppløsningen for å kompensere for volumet som vil gå tapt under injeksjonen (f.eks. i sprøyten, hetteglasset osv.). Avhengig av sprøyten som brukes, er det døde volumet ca. 200 μL. For en gruppe på 10 mus, beregn et overskudd på 2 musedoser. - Klargjør sprøytene til injeksjon. Bruk 1 ml sprøyter med 25 G x 5/8" kanyler.
- SU5416 subkutan injeksjon
- Beherske dyret. Plasser musen på lokket på buret for å hjelpe tilbakeholdenhet. Grip huden og danner et telt parallelt med ryggraden. Sørg for å gripe på baksiden av hodet tett, for å unngå den potensielle biteskaden ved musen.
MERK: Tilstedeværelsen av to undersøkere gjør prosedyren raskere og mer nøyaktig, da man kan holde dyret mens den andre utfører injeksjonen. - Sett nålen subkutant over flanken ved den løse hudfolden. Pass på at du setter nålen parallelt med huden. Unngå å trenge inn i bukveggen.
- Injiser sprøytens innhold (100 μL oppløst SU5416 eller kjøretøy).
MERK: For å unngå lekkasje etter fullført levering, hold sprøyten i ca. 10 s og roter nålen litt under huden. - Trekk nålen tilbake og returner dyret til buret. Etter su5416 injeksjon, plasser burene i det ventilerte hypoksikammeret.
- Beherske dyret. Plasser musen på lokket på buret for å hjelpe tilbakeholdenhet. Grip huden og danner et telt parallelt med ryggraden. Sørg for å gripe på baksiden av hodet tett, for å unngå den potensielle biteskaden ved musen.
- Eksponering for hypoksi
- Overvåk ventilasjonen over tid. Sørg for å opprettholde 10% av oksygentilførselen. Opprettholde normoksi dyr i en semi-forseglet kammer i ved 21% O2.
- Sørg for at kamrene er utstyrt med en oksygensensor for å måle oksygennivået. Unngå omfattende åpning av kamrene. For rengjøring og tilsetning av mat og vann åpne kamrene i ikke mer enn 20 min hver 3.
- Inspiser dyr daglig. Vurder stresssignaler som piloerection eller betydelig vekttap.
MERK: Dyr under hypoksi/SU5416 forventes å gå ned i vekt5. Dette er en indikasjon på sykdomsutvikling. - Gjenta SU5416 injeksjon ukentlig i 3 påfølgende uker (se figur 1A for oversikt over eksperimentell design).
MERK: Varierende injeksjonssted kan bidra til å redusere hudirritasjoner.
2. Funksjonell karakterisering ved invasive TRYKKMÅLinger for bobiler
- Forberedelse
MERK: Velg et bedøvelsesregime. Injiserbare eller inhalerbare anestetika kan brukes. Siden en liten overdose av injiserbare anestetika (spesielt fra ketamin/xyazin eller pentobarbital) kan påvirke hjertefunksjonen betydelig, anbefales bruk av flyktige anestetika. Det er av stor betydning å bruke samme bedøvelse for alle mus i en studie.- Bruk en fordamper for å sikre en nøyaktig anestetikadose per dyr. Dosen for isofluran er som følger: induksjon 3-4%, vedlikehold 1% blandet med 100% oksygen.
MERK: Bruk personlig verneutstyr og unngå å puste inn dampen. - Forbered en varmepute og/eller oppvarmingslamper for å opprettholde kroppstemperaturen. Forbered en rektal temperatursonde for overvåking av kroppstemperatur.
- Sørg for riktig ventilasjon. Forbered ventilatoren på forhånd. Klargjør Y-rørkontakten og kontroller ventilatorens funksjon ved hjelp av manuell modus. Sørg for at det inspiratoriske trykket er <1 cm H2O for å unngå barotrauma. Still inn respirasjonshastigheten ved 110 åndedrag/min.
- Forbered et endotrakealrør ved å kutte et 20 G intravaskulært kateter.
- Forbered instrumentene som trengs: små tang, saks, elastiske kroktraktorer, kar cauterizer og bomullspinner. På en bomullspinne justere en liten 25 G x 5/8 "nål som vil bli brukt til å lage en liten punktering i høyre ventrikkel.
- Klargjør trykkkateteret, trykkvolumkontrollenheten og start datainnsamlingsprogramvaren. Plasser PV-kateteret i et 15 ml rør fylt med PBS ved 37 °C i 15 min og kalibrer i henhold til produsentens protokoll.
- For perfusjon og fiksering av organene, forberede PBS og en løsning på 50% PBS / 50% OKT. Forbered 2 x 10 ml sprøyter (med en 25 G nål): man vil bli brukt til å perfusere hjertet og lungen med PBS i situ og den andre for å injisere OCT / PBS (50/50) løsning til lungeprøven som skal brukes til histologisk undersøkelse.
- Bruk en fordamper for å sikre en nøyaktig anestetikadose per dyr. Dosen for isofluran er som følger: induksjon 3-4%, vedlikehold 1% blandet med 100% oksygen.
- Intubasjon
- Vei musen og registrere helsestatus før anestesi.
- Induser anestesi med 3-4% isofluran. Kontroller anestesidybden ved å teste tåklemrefleksen: klyp tåen til en av lemmer fast. Hvis dyret trekker lemmen, er det et tegn på utilstrekkelig anestesi.
- Etter anestesiinduksjon, barber nakken og brystområdene.
- Plasser musen på varmeputen. Plasser en rektal temperatursonde for overvåking av kroppstemperatur.
MERK: Vedlikehold av kroppstemperatur er av betydning for de funksjonelle målingene. Kroppstemperaturen skal være ca. 36,5-37 °C. - Ved hjelp av buede tang feste en suturtråd til de øvre fortenner av musen, strekke og feste til varmeputen med kirurgisk tape. Fest musens lemmer ved hjelp av kirurgiske bånd.
- For å intubere dyret gjør et lite snitt på ca 1 cm i den mediale livmorhalshuden ved hjelp av liten saks.
MERK: Oral intubasjon er en alternativ metode som krever mer erfaring. - Med en bomullstippet applikator separat, parotid og submandibulære spyttkjertler på mellomnivå. Dette vil utsette musklene overlying luftrøret.
- Skjær forsiktig disse musklene utsette luftrøret.
- Med liten saks gjør et lite snitt mellom trakealbruskene og sett inn det tilberedte endotrakealrøret. Ta ut metallføringen til det intravaskulære kateteret.
- Koble kateteret til ventilatoren. Kontroller trakealrørposisjonen ved å blåse lungene forsiktig opp. Fest posisjonen med tape.
- Opprettholde en 1% isofluran anestesi gjennom hele prosedyren.
- Overvåk regelmessig dybden av anestesi ved å teste tåklemmerefleksen. Juster anestesi tilsvarende.
MERK: Den anbefalte hjertefrekvensen under forsøkene, under 1 % isoflurananestesi, er ca. 400 slag /min. Vedlikehold av kroppstemperatur og anestesi er avgjørende for å kontrollere hjertefrekvensen. Overskudd av isofluran kan redusere hjertefrekvensen. Imidlertid kan utvinning oppnås ved å redusere isofluranhastigheten.
- Målinger av bobiltrykk (åpen brysttilnærming)
- Med liten saks utføre et hud snitt på ca 1 cm over xiphoid prosessen og den øvre abdominale delen. Skill huden som dekker brystet og bukveggen i de øvre abdominale kvadranter: start på midtlinjen, distal til xiphoid og forsiktig flytte sidealt på begge sider. Bruk termokkery for å kontrollere blødningen.
MERK: Målet er å ha tilgang til thoraxhulen gjennom bukveggen. - Åpne bukhulen og kutt membranen forsiktig, og ta vare på å ikke skade det bankende hjertet eller lungene.
MERK: Målet er å eksponere toppunktet og hjertets høyre ventrikkel. God eksponering og syn på hjertet er av avgjørende betydning for riktig plassering av kateteret. Det er av stor betydning å unngå blødning gjennom hele prosedyren. Selv små endringer i det intravasale volumet kan endre belastningen av høyre hjerte og påvirke de registrerte parametrene. - Fjern forsiktig perikardiet med en bomullstippet applikator.
- Like før du plasserer trykkkateteret i hjertet, ta kateteret ved siden av musen.
- Ved hjelp av den tilberedte bomullstippede applikatoren med nålen gjør et stikksår i den apiske distale delen av høyre ventrikkel. Fjern nålen forsiktig og sett trykkkateteret inn i dette hullet.
MERK: Dette skal fungere uten å bruke makt. Hvis dette ikke er mulig, prøv å lage et nytt hull i nærheten av den første for å unngå utvidet skade i hjertet. Kanylen skal ikke settes dypere inn enn ca. 3 mm. - Sett trykkkateteret parallelt med retningen på høyre ventrikkel, med spissen vendt mot lungearterien.
- Se på trykkbølgesporingen for å sikre riktig plassering av kateteret. Representative sporinger er demonstrert i figur 2.
- La trykksignalet stabilisere seg. Sett åndedrettssettene på pause og få tak i minst 3 målinger. Mellom de enkelte målingene tillater dyret å bli ventilert.
- Når alle målinger er registrert, fjern kateteret og plasser det tilbake i PBS fylt rør i vannbadet.
MERK: Når eksperimentet er fullført, rengjør du kateteret i henhold til produsentens instruksjoner.
- Med liten saks utføre et hud snitt på ca 1 cm over xiphoid prosessen og den øvre abdominale delen. Skill huden som dekker brystet og bukveggen i de øvre abdominale kvadranter: start på midtlinjen, distal til xiphoid og forsiktig flytte sidealt på begge sider. Bruk termokkery for å kontrollere blødningen.
- Eutanasi og lungeperfusjon
- Ved ferdigstillelse av eksperimentet euthanize musen ved exsanguination.
- Åpne brystet mye. Bruk saks, kutt hele brystbenet og vær oppmerksom på ikke å skade hjertet eller lungene.
- Ved hjelp av iris saks gjør et lite snitt i venstre ventrikkel for å tillate blod å forlate kammeret.
- Plasser 25 G kanylen på en sprøyte som inneholder 10 ml PBS i høyre ventrikkel og injiser PBS-oppløsningen til lungene er ryddet av blod.
- Når dette trinnet er fullført, bekrefter eutanasi ved vital vevshøsting (hjerte og lunger): kutt cava og aortatilbehør og fjern hjertet og lungene en blokk.
3. Morfometrisk karakterisering
- Umiddelbart etter å ha fjernet hjerte og lunger (Trinn 2.4.5), isolere hjertet og fjerne begge atria. Med buet tenotomy saks dissekere nøye høyre ventrikkel (RV) fra venstre ventrikkel (LV), forlater septum (S) med venstre ventrikkel. Vei RV og LV+S og beregn Fulton-indeksen= RV/LV+ S (figur 3)5,9.
- Ta en del av høyre ventrikkel og plasser den i en OCT forhåndsutfylt innebyggingsform. Bruk den andre delen av høyre ventrikkel for RNA- og/eller proteinanalyse. Smekk i tørris og oppbevar ved -80 °C.
- Bruk iris saks for å isolere lungene fra hjertet og andre gjenværende vev.
MERK: For fremstilling av lungene er perfusjonen som beskrevet ovenfor (trinn 2.4.3-2.4.5) av stor betydning. - Fest fryse en del av lungene og lagre den for RNA, protein ekstraksjon eller andre analyser.
- Bruk den andre delen av lungene til histologisk analyse. For dette formål, sett inn sprøyten som inneholder 50% PBS og 50% OKT i en bronkier av den brukte lobe10,11. Eksperimentereren kan lett se at lungene blir oppblåst når sprøytens innhold er perfundert i vevet.
- Plasser disse biter av lunge i innebygging former forhåndsfylt med OCT og snap fryse dem i tørris. Oppbevar prøvene ved -80 °C etter at de er frosset.
- Forbered 8 μm deler av RV og lunge ved hjelp av en kryostatmaskin. Luft tørker seksjonene ved romtemperatur i 30 min.
- Fest lysbildene ved romtemperatur ved hjelp av 10% paraformaldehyd (PFA) i 10 min.
MERK: PFA er et kjent kreftfremkallende menneske. Reduser eksponeringsrisikoen ved hjelp av en kjemisk røykhette, riktige prosedyrer og personlig verneutstyr. Se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for mer informasjon. - Vaskulær remodelingsvurdering av Hematoxylin/Eosin-farging
Merk: Utfør Hematoksylin/Eosin-farging for å vurdere de strukturelle endringene i hjertet og vaskulær remodeling i lungene (figur 3).- Flekk med Hematoksylin oppløsning i 8 min.
- Skyll med rennende vann fra springen i 5 minutter etterfulgt av en rask skylling i destillert vann.
- Skyll i 95% EtOH i 1 min og motflekk i Eosin-oppløsningen i 1 min.
- Dehydrere (80% etanol 10-30 s, 100 etanol i 1 min og 100% Toluol i 3 min).
- Monter og dekk med en dekkslipp. Tørk lysbildene over natten ved romtemperatur.
MERK: Løsningene som brukes til farging kan være farlige. Reduser eksponeringsrisikoen ved hjelp av en kjemisk røykhette, riktige prosedyrer og personlig verneutstyr. Se MSDS for mer informasjon.
- Høyre ventrikulær fibrose vurdering av Picrosirius Red Staining
MERK: I Picrosirius Red Staining binder Picrosirius Red, som er syre, til kollagen12. Derfor kan denne fargingen brukes til en histologisk undersøkelse av kollageninnholdet.- Inkuber lysbildene i en forvarmet Bouin's Solution ved 58 °C i 1 time.
- Vask lysbildene i rennende vann fra springen for å fjerne gul farge fra seksjoner i 10-15 min.
- Beis i 0,1% Fast Green i 20 min ved romtemperatur.
- Skyll i 1% eddiksyre i 1 min.
- Skyll i vann fra springen i 5 min.
- Flekk i 0,1% Sirius rød i 30 min ved romtemperatur etterfulgt av dehydrering i Toluol.
FORSIKTIG: Løsningene som brukes til farging kan være farlige. Reduser eksponeringsrisikoen ved hjelp av en kjemisk røykhette, riktige prosedyrer og personlig verneutstyr. Se MSDS for mer informasjon.
- RV kardiomyocytt hypertrofi vurdering av WGA Staining
MERK: Hypertrofi av høyre ventrikkel (RV) på cellenivå kan vurderes ved å utføre en Hvete Germ Agglutinin (WGA) farging (figur 4).- Fest lysbildene i kald Acetonløsning i 15 min etterfulgt av 3 trinn med vasking i PBS (5 min hver).
- Blokker med 10% geiteserum i en Dako-løsning i 30 min ved romtemperatur.
- Inkuber lysbildene med WGA: Tilsett WGA 1:200 og inkuber i 1 1/2 t ved 37 °C i mørket.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS.
- Inkuber lysbildene med et nukleinsyrefargestoff.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS.
- For montering, fjern overflødig væske og påfør monteringsmedier og en dekkslips. Tørk lysbildene i 1 time ved romtemperatur i mørket og oppbevar ved 4 °C.
MERK: Løsningene som brukes til farging kan være farlige. Reduser eksponeringsrisikoen ved hjelp av en kjemisk røykhette, riktige prosedyrer og personlig verneutstyr. Se MSDS for mer informasjon.
- Utfør immunkjemi i lungene for å ytterligere og spesifikt vurdere vaskulær ombygging. For eksempel kan glatt muskelcellefarging brukes til å vurdere muskulærisering av karene, mens von Willebrand Factor farging kan brukes til å visualisere endotelendringer. Disse metodene er beskrevet andre steder5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi i detalj opprettelsen av Hypoksi/SU5416-modellen for å indusere PH hos mus. Videre beskriver vi alle nødvendige tiltak for å utføre lungevaskulær og hjerteevaluering på slutten av observasjonsperioden.
En oversikt over eksperimentell design for denne modellen er vist i figur 1A13,14. Mus utsettes for normobar hypoksi (10 % O2) og injiseres subkutant én gang i uken med SU5416 i tre påfølgende uker. Stimuli som brukes til å indusere PH i denne protokollen er vist i figur 1B og 1C.
VEGF reseptorantagonisten SU5416 virker ved å forårsake endotelcelle apoptose og derfor tillate spredning av apoptose resistente-endotelceller. Dette fører til vaskulær remodeling i lungevaskulaturen og økt vaskulær motstand5. Det forhøyede trykket i lungesirkulasjonen øker bobilen etterbelastning og fører gradvis til RV dysfunksjon og svikt9. I det første trinnet kan suksessen til Hypoxia/SU5416-protokollen evalueres ved å vurdere RV-funksjonen funksjon på slutten av observasjonsperioden. I denne protokollen beskriver vi i detalj den invasive vurderingen av RV systolisk trykk ved hjelp av den åpne brystet RV trykkmålingsmetode. Representative trykkkurver og kvantitativ analyse av riktig ventrikulært trykk vises i figur 2.
Hvordan kan vi kvantifisere vaskulær ombygging, noe som fører til forhøyet vaskulær motstand og dermed PH? Histomorphometry er gullstandarden for å karakterisere lungevaskulaturen. I denne protokollen beskriver vi i detalj Hematoxylin & Eosin Staining (H&E)-protokollen. Etter farging og fangst av bildene, kan lungearteriene skilles i små (<50 μm) og større (> 50 μm). Bronkial arterier ble utelukket fra vår studie. For vurdering av medial tykkelse, måles den eksterne (ED), samt den interne diameteren (ID) av arteriene. Representative bilder av ombygde lungearterier etter hypoksi/SU5416-behandling er vist i figur 3A. Prosentandelen av arteriene medial tykkelse i forhold til tverrsnittsdiameter er vist i figur 3B. Den morfometriske analysen av distale lungearterier viser en signifikant økning i medial tykkelse i hypoksi/SU5416-behandlede mus sammenlignet med normoksidyr (figur 3).
Den økte etterbelastningen fører til RV hypertrofi og som sykdommen utvikler seg til RV fibrose9,15. RV hypertrofi kan vurderes morfometrically ved å måle Fulton Index (RV / LV + Septum) samt ved å måle kardiomyocytt (CM) hypertrofi. Vektforholdet mellom høyre ventrikkel (RV) til venstre ventrikkel (LV) pluss septum [RV/(LV+S)] beregnes som en indeks for høyre ventrikulær hypertrofi. Representative resultater fra Fulton Index i hypoksi/SU5416 og normoksimus er vist i figur 4B. Metoden som er beskrevet her for å vurdere CM hypertrofi er farging av høyre ventrikulære seksjoner med Wheat Germ Agglutinin (WGA). WGA binder seg til glykoproteiner i cellemembranen og kan brukes til å bestemme tverrsnittsområdet av myocytter16,17. Representative bilder av høyre ventrikulære seksjoner farget med WGA er vist i figur 4A. Kvantifiseringer av CM-området hos både syke og kontrollerende mus er vist I figur 4A. Hypoksi/SU5416-eksponering resulterer det i en markert økning i kardiomyocyttstørrelse og høyre ventrikulær hypertrofi (figur 4). Vi og andre har tidligere vist at,sammenlignetmed enkelt hit (bare hypoksi), Hypoksi/SU5416 forverrer RV fenotype 5,18.
Figur 1: Oversikt over hypoksi/SU5416-metoden. (A) Eksperimentell design for hypoksi/SU5416-musemodellen. SU5416 injiseres subkutant én gang i uken i 3 påfølgende uker. (B) Skjematisk representasjon av hypoksisystemet. Kontrolleren registrerer og regulerer oksygen inne i kammeret ved å infusere nitrogen gjennom gassinfusjonsrøret. (C) Kjemisk struktur av SU5416. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Høyre ventrikkeltrykk hos mus eksponert for kronisk hypoksi kombinert med SU5416 injeksjon. (A) Representative sporinger av invasive trykkmålinger av høyre ventrikkel (RV). (B) RV systolisk trykk hos hypoksi/SU5416 mus og kontrollere dyr utsatt for normoksi. n = 6-8 mus per gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hypoksi/SU5416 induserer lungevaskulær remodeling. (A) Representative Hematoxylin/Eosin-beisede deler av lungene fra de angitte gruppene viser økt medieveggtykkelse i lungearterier av hypoksi/SU5416-mus. Vektstangen: 50 μm. (B) Prosentandel av arterier medial tykkelse i forhold til tverrsnittsdiameter. n = 5 mus per gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Høyre ventrikulær hypertrofi hos mus eksponert for kronisk hypoksi kombinert med SU5416 injeksjon. (A) (Venstre) Representant WGA (Wheat Germ Agglutinin) farging av høyre ventrikulært vev etter den angitte behandlingen. Vektstangen: 50 μm. (Høyre) Kvantitativ analyse av dataene. n = 5 mus per gruppe. (B) RV hypertrofi reflektert av RV vekt over LV pluss interventricular septum (S) vektforhold (Fulton indeks = RV / LV + S) i hver gruppe. n = 8 mus per gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man modellerer PH hos mus ved å kombinere to patologiske stimuli: kronisk hypoksi og SU5416 injeksjon (Hypoksi/SU5416)18. I et forsøk på å korrelere denne musemodellen med den menneskelige PH-tilstanden, må man uunngåelig se på den nåværende PH-klassifiseringen, vist i tabell 1. PH i nesten alle former er preget av lungevasokonstriksjon og avvikende spredning av endotel- og glatte muskelceller. Dette fører til forhøyet trykk i lungearteriene og dermed økt etterbelastning av høyre ventrikkel.
Hvert forsøk på å karakterisere en dyremodell av PH bør inneholde bevis på histopatologisk ombygging av lungevaskulaturen og høyre ventrikkel. Den single-hit hypoksi musemodellen fører til en mild form for vaskulatur remodeling2,3. Disse patologiske funnene inkluderer muskulærisering av tidligere ikke-muskulære kar, ledsaget av endotelcelle, glatt muskelcelle og fibroblastspredning. Disse funnene forverres ved tillegg av det andre treffet (SU5416 injeksjon). Effektene er reversible i single-hit (hypoksi) modell og bare delvis reversibel i Hypoksi/SU5416-modellen.
Den viktigste dødsårsaken for PH-pasienter er riktig ventrikulær svikt (RVF)4,20. Lungevaskulær remodeling i dyremodeller er ikke alltid ledsaget av RVF. For å karakterisere en dyremodell når det gjelder RVF morfologiske, funksjonelle og molekylære data bør analyseres. Sistnevnte er utenfor omfanget av denne protokollen. RV morfologiske ombygging inkluderer både makro- og mikroskopiske aspekter. På makrooskopisk nivå er hovedindeksen for RV hypertrofi Fulton-indeksen, definert som vekten av RV delt på venstre ventrikulær (LV) og Septum (S) vekt (RV / LV + S). På mikroskopisk nivå kan fibrose, betennelse og hypertrofi vurderes av henholdsvis Sirius rød, Hematoksylin/Eosin og WGA.
Musen Hypoksi/SU5146 modell (som er beskrevet her) viser en RV dysfunksjon, målt ved forhøyet systolisk trykk og morfologiske kriterier. Når det gjelder lungevaskulær remodeling, observeres medial hypertrofi tre uker etter oppstart av protokollen. Sammenlignet med Hypoksi/SU5416-modellen hos rotter forårsaker ikke musemodellen RV Failure (bare moderat dysfunksjon), fører ikke til alvorlig obliterativ angiopati, som observert hos alvorlig syke mennesker, og lungepatologien lindrer etter retur til normoksi. Samlet sett er musen Hypoksi/SU5416-modellen egnet for imitering av vaskulær skade som oppstår i PH, hovedsakelig gruppe I (delvis gruppe III, se tabell 1)1,19. Fordelen med denne modellen er anvendelsen i vill type (genetisk umodifiserte) mus, den relativt enkle og rimelige implementeringen, den relativt lave dødeligheten til de syke dyrene og den raske utviklingen av sykdommen av interesse (3 uker). PH forebygging og terapi studier kan lett implementeres i denne modellen, uten nødvendigheten av avanserte ferdigheter i motsetning til kirurgiske gnagermodeller.
Når du implementerer protokollen er det noen kritiske trinn, som man bør huske på. Ved planlegging av studien bør man huske på at i Hypoksi/SU5416-gruppen varierer dyrenes dødelighet mellom 0-10 % (upubliserte observasjoner). Derfor, for å nå statistisk kraft og unngå underpowered studier, anbefales minst 10 mus per gruppe. Løseligheten til SU5416 er lav. Derfor må DMSO eller et annet løsningsmiddel (f.eks. karboksymetylcellulose, CMC) brukes. DMSO i høye doser kan være giftig. LD50 for subkutan (s.c.) bruk hos mus er rapportert å være 13,9 - 25,6 g/kg21,,22. LD50 er definert som dosen som kreves for å drepe 50% av medlemmene av en testet populasjon etter en spesifiserttestvarighet 21,,22. For en mus som veier 25 g, brukes 4,4 g/kg DMSO (beregninger basert på DMSO tetthet på 1,1 g/ml og 0,1 ml påført s.c./mus). Derfor er den subkutant gitte dosen mye lavere enn LD50-verdien. I våre hender kan anvendelsen av SU5416 oppløst i DMSO, som beskrevet her, forårsake hudirritasjon i noen tilfeller, men ingen andre toksiske effekter observeres. Flere rapporter anbefaler imidlertid bruk av CMC som et alternativt kjøretøy til SU541614. Når du utfører RV funksjonelle målinger, må nøye oppmerksomhet betales ved kroppstemperatur, blødning og dybde av anestesi, som vurdert ved å teste musereflekser. Den åpne brystteknikken for å vurdere rv-trykket, som beskrevet her, har fordelen av å enkelt bli implementert selv av en uerfaren bruker. Metoden lukket bryst (beskrevet andre steder23,24,25) har fordelen av å være mindre invasiv og kan derfor implementeres også i ikke-terminaleksperimenter. Det krever om et høyt kompetansenivå.
Etter den første beskrivelsen av Hypoksi/SU5416-modellen hos rotter, har musemodellen blitt brukt i flerestudier 5,,9,13. Det er imidlertid bevis for at resultatene avhenger av musenes genetiske bakgrunn og kjønn, produsenten av SU5416 og frekvensen av SU5416 injeksjon26. Mens injeksjon av SU5416 over tre påfølgende uker fører til PH hos mus, vil en enkeltdose ikke indusere PH4. Videre krever andre former for PH, som de som er forbundet med venstre hjertesykdom eller på grunn av kronisk tromboembolisk sykdom, etiologirelaterte modeller. Nye behandlinger bør testes i minst 2 forskjellige dyremodeller, før de kan bane vei for translasjonelle studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 og 18IPA34170258) og fra National Institutes of Health NIH K01 HL135474 til Y.S. O.B ble støttet av Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S.
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
