Summary
I detta manuskript etablerade vi en hög genomströmning metod för att kvantifiera alkaliskt fosfatasaktiviteten i S. aureus biofilm kultur från 96 brunnar vävnadsodling plattan
Abstract
Alkaliskt fosfatas (ALP) är en gemensam enzym uttrycks i både prokaryota och eukaryota celler. Det katalyserar hydrolys av fosfat monoesters från många molekyler vid grundläggande pH och en oumbärlig roll i metabolismen av fosfat. I människor är eukaryota ALP en av de vanligaste enzymatiska signalerna diagnostisera olika sjukdomar, såsom gallstas och rakitis. I S. aureus, ALP upptäcks uteslutande på cellmembranet; det uttrycks också som en sekretoriska form också. Men är lite känt om dess funktion i biofilm bildning.
Syftet med detta manuskript är att utveckla en snabb och tillförlitlig test för att mäta ALP aktivitet i S. aureus biofilm som inte kräver protein isolering. Använder p-nitrofenylfosfat fosfat (pNPP) som substrat, mätte vi ALP aktivitet i S. aureus biofilm bildas i 96 brunnar vävnadsodling plattor. Aktiviteten bygger på bildandet av lösliga reaktionsprodukten mäts av 405 nm absorbans. Hög genomströmning beskaffenhet metoden 96 väl vävnadsodling plattan ger en känslig och reproducerbar metod för ALP aktivitet analyser. Samma experimentell uppsättning kan även utökas för att mäta andra extracellulära molekylära markörer relaterade till biofilm bildning.
Introduction
Alkaliskt fosfatas (ALP) uttrycks ubiquitously i både prokaryota och eukaryota celler1. Det kan katalyserar hydrolys av monofosfat från olika molekyler såsom nukleotider, proteiner, alkaloider, fosfatestrar och anhydrider av fosforsyra. Människor förekommer eukaryota ALP i många vävnader inklusive levern, skelettet, tarmen och moderkakan2. Det spelar viktiga roller i protein fosforylering, celltillväxt, apoptos, stamceller processer samt normal mineralisering av skelettet. Eukaryota ALP är också en nyckel serum indikator för förekomst av sjukdomar i skelettet, levern och andra vävnader/organ när förhöjda3,4.
Prokaryota ALP har upptäckts i en mängd olika bakterieceller, inklusive E. coli5, S. aureus6,7 och vissa gemensamma våmmen bakterier i jordar8. Bakteriella ALP aktivitet har använts som en biosensor för detektion av bekämpningsmedel, tungmetaller9 och bakteriell kontamination10. Det konstitutiva uttrycket för ALP har använts att identifiera stafylokocker11 och att skilja Serratia från Enterobacter12. Det föreslås vidare att konstituerande ALP produktion är korrelerad med patogenicitet stafylokocker13. Även om ALP har studerats i olika inställningar3,4, ännu rapporteras lite för dess aktivitet och funktion i biofilmer kulturer.
En biofilm har dokumenterats för att har ett olikt fungerande bakteriell liv jämfört med dess fri-uppehället bakteriecell motsvarighet14. I S. aureus, har bildandet av biofilm identifierats i en mängd olika kliniska tillstånd och konton för antibiotikaresistens och kronisk inflammation15,16. Många molekyler hade rapporterats i en biofilm matris såsom polysackarider, proteiner, nukleinsyror och lipider, men mekanismen av biofilm bildning är inte fullt ut förstått14. För att förstå rollen av ALP i biofilm bildning, vi odlade S. aureus biofilmer i 96 väl vävnadsodling plattor och mätt aktiviteten ALP med para-nitrophenylphosphate (pNPP).
Den molekyl pNPP är redo att använda substrat för ALP och har använts i stor utsträckning att mäta ALP aktivitet6,17,18. Denna kolorimetriska analys baseras på omvandlingen av para-nitrofenyl fosfat (pNPP) till para-nitrofenol resulterar i en färgad produkt vid 405 nm. Jämfört med andra konventionella ALP-analysen, som agaros gel elektrofores19, vetegroddar agglutinin (WGA) nederbörd, och WGA-HPLC20, denna analys är mycket specifika, möjliggör känslig, lätt att reproducera, och de flesta viktigare, hög genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. medium förberedelse
- Förbereda 1 L av Tryptic Soy buljong (TSB): I 1 L destillerat vatten, tillsätt 15 g bukspottskörteln digest kasein, 5 g papaic sammandrag av sojamjöl, 3 g natriumklorid, 2,5 g dextros och 2,5 g dikaliumvätefosfat fosfat. Sterilisera före användning.
- För Tryptic Soy Agar (TSA), tillsätt 15 g agar till 1 L av TSB, autoklav. Sedan låt den svalna ner till rumstemperatur. Nästa, häll i förhållandet 20 mL per petriskål (100 x 15 mm).
- Biofilm odlingssubstratet: tillsätt 10 g glukos till 1 L av Ånghärdad TSB. Sterilisera genom filtrering med ett 0,2 µm filter.
2. S. aureus Biofilm bildning i 96 väl vävnadsodling plattan
Obs: Den S. aureus biofilmen är odlade som tidigare beskrivits6,21.
- Inokulera enskilda en koloni av S. aureus från TSA i 10 mL av TSB och växa över natten vid 37 ° C.
- Späd den nattliga kulturen i 10 mL av TSB/glukos (10 g/L) i förhållandet 1: 100 (v/v). Vortexblanda försiktigt för att blanda för en konsekvent koncentration.
- Överföra 200 mL utspädd kultur i sammanlagt 18 brunnar (mer för experimentella grupper, sådan icke-biofilm kontroll att föreslå en relation till ALP verksamhet6) från en 96 väl plattan. Använda trillingar för varje tidpunkt: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min och 75 min. Se steg 3,2.
- Inkubera vid 37 ° C under 24 h för biofilm bildning6,2196 väl plattan.
- Dekantera supernatanten genom aspiration.
- Tvätta vart bra med 1 x fosfatbuffrad lösning (PBS, pH 7,4), Centrifugera under 5 minuter vid 15 000 x g och Dekantera supernatanten genom aspiration.
3. mätning av ALP aktivitet i S. aureus Biofilm
Obs: ALP aktivitet mättes som beskrivs6,18.
- Tillsätt 75 mL buffrad ALP substrat bestående av kommersiellt tillgängliga pNPP till varje brunn från steg 2,6 och börja spela in tiden. Spela in varje tidpunkt i tre exemplar.
- Efter inkubation i en varierad tid: 0 min (kontroll), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min och 75 min respektive, tillsätt 75 µL 5 M NaOH att stoppa reaktionen.
- Centrifugera plattan för 5 min vid 15 000 x g.
- Över 100 µL av supernatanten till en ny 96 väl platta för kolorimetrisk mätning.
- Mät absorbansen hos varje väl vid 405 nm med en 96 väl tallrik läsare. Använda 0 min tiden pekar brunnar kontrollen för 405 nm bakgrundsljud.
- Upprepa hela experimentet i tre enskilda 96 plattor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar representativa resultat av ALP aktivitet från biofilm kulturer av S. aureus i 96 väl vävnadsodling plattor. 75 μL av kommersiellt tillgängliga pNPP lösning lades till varje brunn och inkuberas vid rumstemperatur. Efter inkubation i olika tider (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min och 75 min, respektive) 75 μl 5 M NaOH lades till för att stoppa reaktionen. Produkten mättes sedan i en 96 väl Plattläsare vid 405 nm. Varje tidpunkt upprepades i trillingar från en enda 96 väl plåt och hela experimentet upprepades i 3 individuella 96 plattor.
Figur 1: S. aureus biofilm kulturer inkuberades med pNPP-substrat för annan tid (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min och 75 min) och deras ALP aktivitet mättes vid 405 nm. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår analys använde vi pNPP som ALP substratet. Detta är en fungerande lösning utformad för ELISA och ingen utspädning behövs. Efter hydrolys av ALP, en gul produkt utvecklar och kan mätas vid 405 nm. I slutet av den enzymatiska reaktionen, vi kortfattat centrifugeras 96 väl plattan och överförs supernatanten till en färsk 96 väl platta att mäta absorbansen med plattan läsaren. Vi fann att detta extra centrifugering steg är kritisk, eftersom den ökar konsekvensen av absorbansen vid 405 nm, förmodligen genom att eliminera möjliga suspenderade celler som uppstått under enzymatisk reaktion.
För biofilm bildning använder vi 200 μL av en spädning 1: 100 (v/v) för övernattning kultur som rapporterade6,21. Detta är den optimala utspädningen för S. aureus bildar biofilm jämfört med andra spädningar (inga data anges). Eftersom syftet med denna uppsats är att mäta ALP aktivitet i biofilm, var det avgörande att vi underhålls optimalt biofilm odlingsbetingelser. Detta underströks ytterligare genom val med glukos på 10 g/L för optimal biofilm tillväxt6. Utspädning faktor och glukos koncentrationen behöver optimeras om olika bakterieceller används för biofilm bildning.
Under inkubation av biofilm kultur med pNPP-substrat tar det tid för de färgade produkten att utveckla. Vi mätte ALP aktivitet efter 15 och 30 min tidpunkter som är när den synliga gul färgen observeras. Med den nuvarande koncentrationen märkte vi en ökad ALP aktivitet för upp till 75 min som anges i figur 1. Efter 75 min observerades ingen ökning av aktiviteten ALP.
Slutligen, eftersom ALP i S. aureus är en uteslutande membran bundna protein7, dess aktivitet kan provas utan cellys. Det finns fördelar med ett test av enzym-aktivitet som inte kräver hela cell förstörelse. Särskilt kan protein isolering processen ibland ge en lägre aktiva enzym kvantitet22. Detta protokoll kan dock användas om ALP inte i dess membran bunden form.
Som tidigare rapporterats6, är ALP aktivitet förhöjda i biofilm kultur jämfört med dess platonska motsvarighet. Experimentella inställningarna som används i den aktuella studien kan förlängas för att undersöka faktorer/föreningar som påverkar ALP aktivitet i S. aureus biofilm. Resultaten från dessa studier kommer att ge ytterligare inblick i hur man styr bakteriell biofilm bildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar William Rainey Harper College och University of Illinois i Chicago för möjligheten att genomföra dessa experiment. Vi tackar också McGraw Hill Foundation för deras generösa stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
