Summary
Bu makale, alkalen fosfataz aktivitesi S. aureus biyofilm kültür 96-iyi doku kültürü plaka ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemi kurduk
Abstract
Alkalen fosfataz (ALP) prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ifade ortak bir enzimdir. Fosfat monoesters temel pH çok moleküller gelen hidroliz tromboksan ve fosfat metabolizmasında vazgeçilmez bir rol oynar. İnsanlarda, ökaryotik ALP Histiositoz ve raşitizm gibi çeşitli hastalıkların teşhis en sık kullanılan enzimatik sinyalleri biridir. S. içinde aureus, ALP sadece hücre membran üzerinde algılanır; Ayrıca de salgı form olarak ifade edilir. Yine de, az onun işlevi biyofilm oluşumu hakkında bilinir.
Bu yazının amacı protein yalıtım gerektirmez S. aureus biyofilm ALP etkinliğini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir tahlil geliştirmektir. P-nitrophenyl fosfat (pNPP) bir substrat kullanarak, S. aureus biyofilm 96-iyi doku kültürü levha oluşmuş ALP etkinliğinde şiddetindeydi. Etkinlik 405 nm Absorbans tarafından ölçülen çözünür reaksiyon ürünü oluşumu dayanıyordu. 96 iyi doku kültürü plaka yöntemi yüksek üretilen iş doğası ALP etkinlik deneyleri için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Aynı deneysel kurmak da biyofilm oluşumu için ilgili ekstraselüler diğer moleküler işaretleyiciler ölçmek için genişletilebilir.
Introduction
Alkalen fosfataz (ALP) ubiquitously hem prokaryotik ve ökaryotik hücre1' ifade edilir. Monofosfattır nükleotit, proteinler, alkoloidler, fosfat esterleri ve anhidritler fosforik asit gibi farklı molekül gelen hidroliz katalizler. İnsanlarda, ökaryotik ALP karaciğer, kemik, bağırsak ve plasenta2de dahil olmak üzere birçok dokularda bulunur. Protein fosforilasyon, hücre büyümesi, Apoptozis, kök hücre işlemleri yanı sıra normal iskelet Qafqaz önemli rol oynar. Ökaryotik ALP kemik, karaciğer ve diğer dokuların/yüksek zaman organ hastalıklarında varlığı için bir anahtar serum gösterge mevcuttur3,4.
Prokaryotik ALP bakteri hücreleri, E. coli5, S. aureus6,7 ve ortak bazı Rum bakteriler toprak8' de dahil olmak üzere çeşitli algılandı. Bakteriyel ALP etkinliği bir Biyoalgılayıcı bulunması, pestisitler, heavy metal9 ve bakteriyel kontaminasyon10olarak kullanılmıştır. ALP kurucu ifade stafilokok11 tanımlamak ve Serratia Enterobakter12den ayırt etmek için kullanılmıştır. Bu daha da bünye ALP üretim patojenitesi stafilokok13ile ilişkilidir önerilmektedir. ALP farklı ayarlar3' te,4, okudu, ancak henüz az aktivite ve işlev biyofilmler kültürlerde bildirilmektedir.
Onun yaşayan bakteri hücre muadili14ile karşılaştırıldığında farklı şekilde işleyen bir bakteriyel yaşam bir biyofilm belgelenmiş oldu. S. aureusiçinde biyofilm oluşumu çeşitli klinik koşulları ve antibiyotik direnci ve kronik inflamasyon15,16saptanmıştır. Çok moleküller bir biyofilm matris polisakkaritler, proteinler, nükleik asitler ve yağlar gibi bulunabilir için rapor vardı ama biyofilm oluşumu mekanizması tam olarak anlaşılır14değil. ALP rolde biyofilm oluşumu anlamak için biz S. aureus biyofilmler 96 iyi doku kültürü tabak içinde kültürlü ve para-nitrophenylphosphate (pNPP) kullanarak ALP etkinliğini ölçülür.
Molekül pNPP ALP için kullanıma hazır substrat ve yaygın olarak ALP etkinlik6,17,18ölçmek için kullanılır. Bu Renkölçer tahlil para-nitrophenyl fosfat (pNPP) dönüşüm üzerinde para-nitrophenol 405, renkli bir ürün sonuçlanan dayanmaktadır nm. Diğer geleneksel ALP tahlil için özel Jel Elektroforez19, buğday tohumu agglutinin (WGA) yağış, ve WGA-HPLC20, bu tahlil çok özel gibi karşılaştırıldığında, duyarlı, yeniden oluşturma ve en kolay da önemlisi, yüksek için sağlar üretilen iş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. orta hazırlık
- 1 L Tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak: içine 1 L distile su, kazein, 5 gr soya yemek, 3 g sodyum klorür, dekstroz, 2.5 g ve dipotassium fosfat 2.5 g papaic özünü bir pankreas Özeti 15 g eklemek. Kullanmadan önce sterilize.
- Tryptic soya Agar (TSA) için agar 15 g ekleyin 1 litre TSB, basınçlı kap. Sonra aşağı oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Ardından, Petri kabına (100 mm x 15 mm) başına 20 ml oranında dökün.
- Biyofilm kültür orta: 10 g glikoz 1 litre autoclaved TSB ekleyin. 0.2 µm filtre kullanarak filtre tarafından sterilize.
2. S. aureus biyofilm oluşumu 96 iyi doku kültürü plaka
Not: S. aureus biyofilm yukarıda açıklanan6,21kültürlü.
- S. aureus TSA üzerinden bir bireysel koloni TSB 10 ml aşılamak ve 37 ° C'de gecede büyümek
- Tekerlekli sandalye Basketbolu/glikoz (10 g/L) 10 mL 1: 100 (v/v) oranında içine gecede kültür sulandırmak. Girdap karışımı yavaşça için tutarlı bir konsantrasyon.
- 200 mL sulandırılmış kültürünün bir 96 iyi tabaktan Toplam 18 Wells (deneysel grupları, ALP etkinlik6arasında bir ilişki tavsiye ederim böyle bir biyofilm sigara denetim için daha fazla) içine aktarın. Üçüz her zaman noktası için kullanın: 0 dk, 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk. Adım 3.2 bakın.
- 96 iyi plaka biyofilm oluşumu6,2124 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Süpernatant aspirasyon tarafından dikkatle boşaltmak.
- Her yıkama su kuyusu ile tamponlanmış fosfat çözüm (PBS, pH 7,4) x 1, santrifüj kapasitesi 15.000 x g de 5 min için ve süpernatant aspirasyon tarafından dikkatle boşaltmak.
3. S. aureus biyofilm ALP etkinlik ölçümü
Not: ALP etkinlik açıklanan6,18ölçüldü.
- Piyasada bulunan pNPP her şey--dan adım 2.6 oluşan tamponlu ALP substrat 75 mL ekleyin ve kayıt süresi başlar. Her zaman noktası nüsha kaydedin.
- Kuluçka çeşitli bir süre sonra: 0 dk (kontrol), 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk sırasıyla, reaksiyon durdurmak için 5 M NaOH 75 µL ekleyin.
- 15.000 x gde 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.
- 100 µL süpernatant, Renkölçer ölçüm için yeni bir 96 iyi tabak içine aktarın.
- Her Absorbans ölçmek de 405 nm kullanmada 96 de okuyucu plaka. Kullanma belgili tanımlık 0 dk zaman 405 nm arka plan gürültü için denetime işaret wells.
- Üç bireysel 96 iyi plakaları tüm denemeyi tekrarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 S. aureus kültürleri biyofilm aktivitesinden ALP temsilcisi sonucu 96 iyi doku kültürü levha gösterir. Piyasada bulunan pNPP çözüm 75 μL her iyi ve oda sıcaklığında inkübe eklenmiştir. Kuluçka için farklı zamanlarda sonra (0 dk, 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk, sırasıyla) 5 M NaOH 75 μL reaksiyonu durdurmak için eklendi. Ürün sonra 405, 96 iyi plaka okuyucu olarak ölçüldü nm. Her zaman noktası üçüz tek 96 iyi plaka içinde tekrar edilmiş ve tüm deney 3 bireysel 96 iyi levha tekrarlandı.
Şekil 1: S. aureus biyofilm kültürler için farklı saat (0 dk, 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk) pNPP substrat ile inkübe ve ALP faaliyetlerini 405 ölçüldü nm. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim assay olarak, biz ALP substrat pNPP kullanılır. Bu bir çalışma çözüm ELISA için tasarlanmıştır ve hiçbir seyreltme gereklidir. Hidroliz ALP tarafından sonra sarı bir ürün geliştiren ve 405 ölçülebilir nm. Enzimatik reaksiyon sonunda kısa bir süre 96 iyi plaka centrifuged ve süpernatant Absorbans plaka okuyucu kullanarak ölçmek için bir taze 96 iyi tabağa aktarılır. 405 Absorbans tutarlılığını artırır bu yana bu ilave Santrifüjü adım kritik, bulduk nm muhtemelen sırasında enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan olası askıya alınan hücreler ortadan kaldırarak,.
Biyofilm oluşumu için bir 1: 100 (v/v) seyreltme 200 μL gecede kültür için bildirilen6,21kullanıyoruz. Diğer dilutions (veri gösterilmez) karşılaştırıldığında biyofilm oluşturmak S. aureus için optimum seyreltme bu. Bu kağıt amacı olduğu biyofilm ALP etkinliğini ölçmek için optimum biyofilm kültür koşulları tutulan çok önemli. Bu daha fazla glikoz 10 g/L optimum biyofilm büyüme6için kullanma içinde belgili tanımlık seçme tarafından vurguladı. Seyreltme faktörü ve glikoz konsantrasyonu farklı bakteri hücreleri biyofilm oluşumu için kullandıysanız optimize edilmiş olması gerekir.
Sırasında kuluçka biyofilm kültür pNPP substrat ile renkli ürün geliştirmek için zaman alacaktır. Hangi görünür sarı renk gözlenen zaman 15 ve 30 dk zaman Puan sonra ALP aktivitesi ölçüldü. Geçerli konsantrasyon ile şekil 1' de gösterildiği gibi artan ALP etkinlik için 75 dakikaya kadar fark. 75 dk sonra ALP faaliyet hiçbir artış gözlendi.
Son olarak, S. aureus ALP olduğundan bir sadece membran bağlı protein7, kendi faaliyet hücre lizis test edilebilir. Tüm cep telefonu imha gerektirmeyen bir enzim etkinliği tahlil çok yararı vardır. Özellikle, protein yalıtım işlem bazen bir alt etkin enzim miktarı22yol açabilir. ALP membran bağlı haliyle değilse ancak, bu iletişim kuralı kullanılamaz.
Daha önce raporlanmış6, ALP etkinlik biyofilm kültür platonik muadili karşılaştırıldığında yükselmiş. Mevcut çalışmada kullanılan deneysel ayarlar S. aureus biyofilm etkinliğinde ALP etkileyen faktörler/bileşikler araştırmak için genişletilebilir. Bu çalışmalar bulgular bakteriyel biyofilm oluşumu kontrol etmeyi içine ek anlayış sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
William Rainey Harper College ve University of Illinois Chicago bu deney tesis için teşekkür ederiz. Biz de onların cömert desteği McGraw Hill Vakfı teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
