En laboratoriemetode til måling af smitsom Ymarkise i rotter

Summary

Den metode, der er beskrevet her, har til formål at opnå Gabe afsmittende kurver i par af velkendte eller ukendte hanrotter. Bure med huller adskilt af enten klare eller uigennemsigtige skillevægge med (eller uden) huller bruges til at detektere, om visuelle, olfaktoriske eller begge typer af sensoriske signaler kan stimulere gabet afsmitning.

Abstract

Kommunikation er et væsentligt aspekt af dyrs sociale liv. Dyr kan påvirke hinanden og samles i skoler, flokke og besætninger. Kommunikation er også den måde, kønnene interagerer på under friskab, og hvordan rivaler afgør stridigheder uden kamp. Men der er nogle adfærdsmæssige mønstre, for hvilke det er vanskeligt at teste eksistensen af en kommunikatorisk funktion, fordi flere typer af sensoriske metoder er sandsynligt involveret. For eksempel er smitsom gydning en kommunikatorisk handling i pattedyr, der potentielt opstår gennemsynet, hørelse, lugt, eller en kombination af disse sanser, afhængigt af om dyrene er velkendte for hinanden. Derfor, for at teste hypoteser om den mulige kommunikatoriske rolle af en sådan adfærd, en passende metode er nødvendig for at identificere de deltagende sensoriske metoder.

Den metode, der foreslås her, har til formål at opnå Gabe afsmittende kurver for velkendte og ukendte rotter og evaluere den relative deltagelse af visuelle og olfaktoriske sensoriske metoder. Metoden bruger billige materialer, og med nogle mindre ændringer, kan det også bruges sammen med andre gnaverarter såsom mus. Samlet set indebærer metoden substitution af klare skillevægge (med eller uden huller) med uigennemsigtige skillevægge (med eller uden huller), der enten tillader eller forhindrer kommunikation mellem rotter anbragt i tilstødende bure med huller i tilstødende sider. Derfor kan fire betingelser testes: olfaktoriske kommunikation, visuel kommunikation, både visuel og olfaktoriske kommunikation, og hverken visuel eller olfaktoriske kommunikation. Som social interaktion opstår mellem rotter, disse Testbetingelser simulere, hvad der kan forekomme i et naturligt miljø. I denne henseende er den foreslåede metode mere effektiv end traditionelle metoder, der er baseret på video præsentationer, hvis biologiske gyldighed kan give anledning til bekymring. Ikke desto mindre diskriminerer den ikke mellem den potentielle rolle, som hørelse og lugte-og Visions roller spiller i Gabe stotten.

Introduction

Traditionelt, kommunikatorisk adfærd er blevet undersøgt fra to perspektiver. Fra et perspektiv observerer ethologer og registrerer dyrenes opførsel i naturlige miljøer og forsøger at genkende dens adaptive værdi¹. Den særlige forstand eller de involverede sanser har ikke været den primære interesse for disse undersøgelser. Fra et andet perspektiv, er fysiologer mere interesseret i at løse de mekanismer, som dyr kommunikerer¹; laboratorieundersøgelser har således givet metoder til at løse den rolle, som sensoriske modaliteter spiller i kommunikation^2,3. Disse to perspektiver er faktisk komplementære, fordi viden om både adaptive værdi og umiddelbare mekanismer er nødvendig for at få en omfattende forståelse af kommunikatorisk adfærd i det sociale liv af dyr.

Ymarkise adfærd er en iøjnefaldende bestanddel af det adfærdsmæssige repertoire i flere arter af hvirveldyr⁴, der spænder fra fisk til primater⁵. Det kan beskrives som en langsom åbning af munden og vedligeholdelse af sin åbne position, efterfulgt af en hurtigere lukning af munden⁵. Varigheden af hele sekvensen afhænger af arten; for eksempel, primater Gabe i længere varighed end ikke-primat arter⁶. I mange arter, med mennesker er undtagelsen, mænd har tendens til at gabe oftere end kvinder⁷. Denne funktion kan understøtte den mulige kommunikatoriske funktion af gabende, selv om regelmæssige mønstre af ymarkise og dens daglige hyppighed kan også antyde en fysiologisk funktion. Hos rotter følger spontan ymarkise en cirkadisk rytme, hvor højfrekvente toppe forekommer om morgenen og eftermiddagen^8,9.

Et interessant træk ved ymarkise adfærd er, at det kan være en smitsom handling (når frigivelse stimulus af en adfærd sker for at være et andet dyr opfører sig på samme måde¹⁰) i flere arter af hvirveldyr^{11,12, 13,14,15,16}, herunder fugle¹⁷ og gnavere¹⁸. Desuden har nylige beviser vist, at smitsom ymarkise kan afspejle en kommunikatorisk rolle, fordi yteltet af en rotte kan påvirke den fysiologiske tilstand af en anden, når de udsættes for olfaktoriske signaler¹⁹. Men hvorvidt ytelt har en kommunikatorisk rolle er stadig under debat^20,21, og analysere smitsom ymarkise er et vigtigt første skridt til at løse dette problem.

På den anden side har smitsom ymarkise været knyttet til et dyrs evne til at empatisere med andre dyrs perspektiver; Derfor, nært beslægtede personer er mere tilbøjelige til at vise afsmittende⁴. Denne hypotese er ofte blevet afprøvet under laboratorieforhold, hvor dyr præsenteres med Gabe stimuli på video^12,13; Derfor, afsmitning kan kun ske gennem visuelle stikord. Andre undersøgelser har vurderet, at smitten er blevet afsmittende under mere naturlige forhold ved hjælp af grupper af dyr^14,15. Et stort problem er, at socialt interagerende dyr ofte reagerer på stikord og udveksler signaler, der formidles gennem kombinationer af sensoriske metoder. Disentangling de faktiske sanser involveret i en given adfærd fra deres kombinerede virkninger er ikke altid en let opgave. Typisk, forskere farmakologisk eller kirurgisk hindre et dyrs brug af en given følelse, derefter udlede rolle af denne forstand i den relevante adfærd^2,3,18,22. Heldigvis er der andre metoder, hvor kun fysiske barrierer anvendes til enten at tillade eller hindre kommunikationen mellem dyr^23,24og25og derved opnå større biologisk gyldighed.

Den metode, der foreslås her, er specielt designet til at studere smitsom ymarkise i velkendte og ukendte rotter i en social ramme. Ifølge den empatiske hypotese, bør den tidligere gruppe være mere modtagelige for smitsom ymarkise. Metoden kræver ikke, at dyrene skal være kirurgisk eller farmakologisk berøvet enhver form for sanser. I stedet, det virker ved at placere rotter i tilstødende bure med huller og fysisk hindrer deres kommunikation ved hjælp af enten klare eller uigennemsigtige delelinjer med eller uden huller. Således kan fire Testbetingelser undersøges: (1) olfaktoriske kommunikation (OC, perforeret uigennemsigtig skillelinje), (2) visuel kommunikation (VC, ikke-perforeret klar skillelinje), (3) visuel og olfaktoriske kommunikation (VOC, perforeret klar skillelinje), og (4) hverken visuel eller olfabriks kommunikation (NVOC, ikke-perforeret uigennemsigtig skillelinje). Derfor kan forskerne sammenligne de relative bidrag af olfactory, visuelle, og til en vis grad, auditive stikord i Gabe afsmittende. Denne fremgangsmåde er ikke ny, da lignende metoder er blevet brugt til at isolere de sanser, der er involveret i visse kommunikatoriske adfærd i dyr som firben²³ og mus²⁶. Faktisk har Gallup og kolleger²⁷ brugt en lignende metode til at demonstrere rollen som visuelle signaler i smitsom ymarkise i budgerigars. De vigtigste træk ved disse metoder er simulering af en social kontekst og minimal belastning påført dyrene. Desuden øger anvendelsen af interagerende dyr den biologiske gyldighed af konklusionerne.

Der er flere måder at måle smitsom ytelt^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (personlig kommunikation, 2015) hjalp os numerisk tilpasse en metode tidligere ansat af primatolog^13,14 for en tidligere analyse af de data, der anvendes her¹⁸. Præsenteret i denne protokol er en forbedret version af denne metode med en bredere vifte af applikationer. Den består i at vægte det samlede antal af en rotte gaber, inden for og uden for en given tidsperiode, med den andel af observationstiden svarende til gaber i og uden for tidsvinduet.

For eksempel, hvis det antages, at rotter A og B er observeret i 12 min, deres ymarkise registreres til nærmeste minut, og en 3 min tid vindue er indstillet til at måle smitsom ymarkise. Dernæst overvejes følgende sekvenser af gaber for hver af disse rotter: rotte a (0,0, 0, 1,0, 0,2, 0, 0, 2, 1) og rotte B (0,1, 1, 0, 1, 1,0, 0,0, 0,0, 0, 3). Det skal bemærkes, at hvert nummer (0-3) svarer til antallet af gaber scoret på hver min. For rotte A, i minutter 1, 10 og 11 (tal med fed type), er rotte B ikke gabet inden for de foregående 3 minutter (det valgte tidsvindue) eller inden for dette minut. I disse minutter, rotte a gaber i alt 2 gange. Derfor er den Gabe sats af rotte A uden nogen gabet stimulus (ikke-post-Gabe Gabe sats) er 2/3 (dvs. 0,67 yawns/min). I de resterende 9 min, rotte B gaber mindst én gang i enten samme minut eller de 3 foregående minutter. Rotte a gaber i alt fire gange i disse 9 min. Derfor er den Gabe sats af rotte A som reaktion på en Gabe stimulus (post-Gabe Gabe sats) er 4/9 (dvs., 0,44 yawns/min). Anvendelsen af samme procedure på rotte B giver en ikke-post-Gabe Gabe-sats på 2/3 (dvs. 0,66) og post-Gabe-Gabe-sats på 5/9 (0,55).

På den anden side, hvis ytelt registreres til nærmeste decimal af et minut, vil gabet afsmitning resultere i en justeret post-Gabe tid. For eksempel, hvis følgende Gabe tider er registreret over en 12 min observationsperiode for rotter A og B: rotte A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) og rotte B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). For rotte A er de perioder, hvor rotte B ikke har gabet inden for de sidste 3 min. interval fra 0 til 1,2 min og fra 8,1 til 11,2 min (dvs. 3,1 min), hvilket giver i alt 4,3 min ikke-post-Gabe tid. Antallet af gange, som rotte A gaber i disse tider er tre (tal med fed type), så den ikke-post-Gabe Gabe sats er 3/4.3 (dvs., 0,69), mens den post-Gabe Gabe sats er 3/7.7 (dvs. 0,38; nævneren fra 12-4,3 min). Tilsvarende for rotte B er de perioder, hvor rotte A ikke har gabet inden for de sidste 3 min. interval fra 0 til 2,3 min og fra 8,8 til 10,4 min, hvilket giver i alt 3,9 min. Antallet af gange rotte B gaber inden for disse perioder er en, så den ikke-post-Gabe Gabe sats er 1/3.9 (dvs., 0,25). Derfor er den post-Gabe Gabe sats 6/8.1 (dvs. 0,74).

Mens en nær samtidige match i adfærd er et ideelt kriterium for at demonstrere tilstedeværelsen af en afsmitning, aspekter såsom begrænsningerne på, hvad en person deltager i, tidspunktet for reaktion på en stimulus, fordeling af adfærden over tid (f. eks. ytelt kan forekomme i episoder), og tid til at akklimatisere til den eksperimentelle indstilling alle giver anledning til artsforskelle, hvilket gør det vanskeligt at bruge et unikt tidsvindue. Dette kan være grunden til, at forskerne har brugt tid vinduer, der varierer fra sekunder⁵ til flere minutter¹¹, hvilket skaber problemer, når man sammenligner resultater²⁸. På grund af dette, er det foreslået at gentage den procedure, der er beskrevet ovenfor for en række tidsvinduer for at opnå Gabe afsmittende kurver og sammenligne gabet afsmittende kurver mellem arter.

Ækvivalente Gabe afsmittende kurver kan sammenlignes ved tilfældigt at distribuere antallet af gaber observeret for hver rotte i observationsperioden. Således, den foreslåede metode til at måle Gabe smitte tilbyder to typer af kontrol: den (1) Gabe sats, der forekommer uden for tidsvinduet (ikke-post-Gabe tid) og (2) kunstige Gabe smitte kurve opnået fra den tilfældige fordeling af antallet af yawns. Derfor er denne tilgang til at analysere Gabe smitte er et skridt fremad fra andre procedurer, såsom dem, der sammenligner procentdelen eller hyppigheden af ytelt inden for et enkelt tidsvindue til, der forekommer uden for dette vindue²⁵, uden at tage hensyn til faktiske tidsrammer. Metoden suppleres af et R-baseret program²⁹ til bekvemt og objektivt at beregne sandsynligheden for smitsom ymarkise for en eller flere tidsvinduer.

For at illustrere nytten af denne metode og fordelene ved det R-baserede program anvendes et datasæt fra en tidligere publiceret undersøgelse¹⁸ . Den eksperimentelle betingelse bestod af 144 mandlige rotter tildelt enten en velkendt eller ukendt tilstand. Rotterne i hver forsøgs tilstand blev inddelt i fire undergrupper af ni par og eksponeret for en af de fire testsituationer, der er beskrevet ovenfor. Rotters gabende opførsel i hver forsøgs tilstand og testsituation blev derefter registreret over en periode på 60 min.

Protocol

Forsøgsprotokoller og husdyrhold blev gennemført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer.

1. materialer

1. Find en komplet liste over de materialer, der anvendes til at implementere metoden i tabellen over materialer. Brug figur 1 og søge ekspertrådgivning til at konstruere en omvendt T-formet bord, observation bure, og bur dividers. Følg sikkerhedsanvisningerne for brug af skarpe værktøjer og potentielt farlige materialer.
2. Lav en omvendt T-formet tabel ved at lime to skinne lignende træbjælker (45 cm længde, adskilt 0,6 cm fra hinanden) på toppen og midt i et stykke træ (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). Anbring derefter et andet stykke træ (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) lodret mellem skinne lignende stænger. Sørg for, at dette andet stykke træ forhindrer par af rotter på den ene side fra at se de andre par på den modsatte side (figur 1).
3. Brug glas og akryl til at oprette otte observations bure. Sørg for, at hvert bur (19 cm bredt, 19 cm langt, 10 cm højt, 3 mm tykt) har 24 huller i samme afstand (diameter på 5 mm) anbragt i tre rækker midt på en af siderne. Gør denne side af akryl (3 mm tyk) og forkorte højden af den modsatte side af 0,7 cm for at tillade rotten at trække vejret.
   1. Sørg for, at hvert observations bur har et glide låg lavet af akryl for at forhindre rotten i at opdrætte og distraherende sig i løbet af den 60 minutters observationsperiode.
4. Gør fire skillevægge ud af akryl (19 cm bred, 30 cm høj, 3 mm tyk). Bor 24 huller (diameter 5 mm), der matcher dem i observations bure, hver i en klar skillelinje og en uigennemsigtig skillelinje.
5. Forbered dataarkene på forhånd for at registrere forekomsten af yawns. I overskriften på hvert datablad medtages observatørens navn, forsøgs tilstand (dvs. kendte eller ukendte rotter), relevant testsituation (OC, VC, VOC, NVOC), dato og begyndelses-og tidspunkt for observationen. Opdel resten af databladet i to kolonner, hver med antallet af rotte skrevet i den øverste del, for at registrere ymarkise opførsel af rotter.

2. fremgangsmåde

1. Hus 144 hanrotter i grupper på fire i plastik bure (hjem bure) fra fravænning, indtil de når 2,5 måneder i alderen. Brug ikke hunrotter, fordi de har tendens til at vise større variation i adfærd på grund af hormonelle cyklusser, som kan forveksles med virkningerne af test situationen. Sørg for, at rotterne i hvert bur ikke er søskende.
   Bemærk: det kan være svært at få alle rotter sammen. I så fald, oprette blokke af mindst 8 velkendte rotter og 8 ukendte rotter, således at hver testsituation er repræsenteret én gang i hver eksperimentel betingelse³⁰.
2. For at identificere rotter, markere dem med symbolske tal på haler ved hjælp af en kommerciel markør. For eksempel repræsenterer tallene 1 til 4 ved at kombinere prikker og streger (f. eks. en prik for nummer 1 og en linje for nummer 4). Identificer velkendte og ukendte rotter ved hjælp af forskellige farver.
   Bemærk: Håndter rotterne efter de sikkerhedsanvisninger, der stilles til rådighed af dyrefacilitets personalet, og overhold anbefalingerne vedrørende korrekt anvendelse af forsøgsdyr på den institution, hvor forsøgene vil blive udført.
3. Tilfældigt vælge, hvilke hjem bure vil huse gruppen af velkendte rotter, og som vil huse den ukendte gruppe. For eksempel antage, at der er 16 tilgængelige rotter, der bor i fire hjem bure: antal hjem bure 1 til 4, derefter bruge R (download det på http://cran.r-project.org/) som følger [efter prompten (>)]:
   > prøve (4, 4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Gruppér de velkendte (eller ukendte) rotter i hjem bure 4 og 3, og Gruppér de ukendte (eller velkendte) rotter i hjem bure 2 og 1. Sørg for, at dyrefacilitets personalet bevarer identiteten af hvert bur og håndterer rotterne på samme måde som alle andre rotter i dyreanlægget.
   2. Brug R-programmet igen og tilfældigt vælge rotter til at danne hvert par i hver eksperimentel tilstand. Sørg for, at rotterne i hvert par af velkendte rotter stammer fra samme hjem bur, og sikre, at det modsatte er tilfældet for par i den ukendte gruppe. Tilfældigt vælge par af rotter for hver testsituation i hver eksperimentel tilstand.
4. Udfør to test sessioner om dagen med to af de otte mulige testsituationer (fire for hver velkendt og ukendt rotter) pr. test session (dvs. 60 minutters observationsperiode). Udfør de to test sessioner fortløbende inden for 3 timer.
   Bemærk: Sørg for at gennemføre alle test sessioner (fire par rotter om dagen) enten om morgenen eller eftermiddagen for at undgå forstyrrende faktorer. Kør en komplet replikat (otte testsituationer) af eksperimentet over to på hinanden følgende dage.
   1. Sørg for at bruge test situationerne i tilfældig rækkefølge for hver replikat af eksperimentet. Brug for eksempeltallene 1 til 8 til at identificere hver testsituation, og brug derefter R som følger:
      > prøve (8, 8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Tildel testsituationer 8 og 7 for at teste session 1, testsituationer 4 og 6 for at teste session 2 osv. Derefter tilfældigt vælge den side af den omvendte T-formede bord, hvor hvert par af rotter (testsituation) vil blive placeret.
5. Gentag samme procedure (trin 2,3 til 2.4.2) for en anden replikat (dvs. blok) af eksperimentet.
   Bemærk: Hvis formålet med undersøgelsen er at afprøve virkningerne af en social tilstand (dvs. to interagerende rotter) på ymarkationfrekvensen, skal du bruge en rotte anbragt i et observations bur ved siden af et tomt observations bur som kontrol for hver af de fire testsituationer. Udfør dette eksperiment 2x for hver testsituation for en kontrolgruppe på otte rotter.
6. Indstil test sessionen ved at overføre de første fire rotter fra dyreanlægget til observations lokalet, hvor de vil forblive i 15 minutter, så de kan acclimere til det nye miljø. Transport af rotter i individuelle bure og holde dem adskilt fra hinanden under transport og i observations rummet.
   Bemærk: Følg sikkerhedsanvisningerne for transport af dyr, der leveres af dyrefacilitets personalet, og brug det angivne tøj til at arbejde med dyr i laboratoriet. Rotterne vil ikke have adgang til mad og vand, mens de er i observations rummet.
7. Efter at akklimatiserings perioden er passeret, anbringes den inverterede T-formede tabel på en større rektangulær tabel. Sørg for, at der er en loftslampe, der i tilstrækkelig grad lyser rummet, når der foretages observationer.
8. Læg filtrerpapir på bunden af hvert observations bur, og Anbring burene parvis på hver side af det omvendte T-formede bord. Anbring den tilsvarende skillelinje mellem hvert par bure.
   Bemærk: filtrerpapiret gør det lettere at rengøre burene og giver en ru overflade, hvor rotterne kan bevæge sig uden at glide.
9. Strategisk placere to digitale videokameraer sådan, at hver registrerer ymarkise opførsel af hvert par af rotter. Sørg for, at videokameraerne er sikkert fastgjort til stativer og korrekt orienteret til observation bure. Tilslut videokameraer til en stationær computer til samtidig at overvåge adfærden af rotter.
   Bemærk: Opbevar de digitale oplysninger på flash-drev for permanent at arkivere de eksperimentelle sessioner. Brug flashdrev med en høj lagerkapacitet.
10. Efter akklimatiserings perioden anbringes rotterne i observations bure i henhold til den tidligere fastlagte fordeling. Indstil kameraets automatiske fokus og start videooptagelsen samtidig med et stopur. Stop videooptagelsen i slutningen af den 60 min observationsperiode.
    Bemærk: mens eksperimenterende kan være uden for rummet under test sessionen og observere fjernt, anbefales det, at en person er i observations rummet (så langt væk som muligt fra den eksperimentelle indstilling), mens overvågning af adfærden af rotter til sikre, at test sessionen forløber uden afbrydelse.
11. Når observation er overstået, returnere rotter til deres hjem bure i dyreanlægget. Bed dyrefacilitets personalet om at sikre, at rotterne har adgang til mad og vand igen. Rengør observations burene grundigt med et ikke-giftigt rengøringsmiddel, og Forbered den eksperimentelle opsætning til at udføre dagens anden og sidste test.
    Bemærk: Rengør træet for at fjerne eventuelle dufte efterladt af rotter, når de anbringes i observations bure, hvilket kan påvirke adfærden af det næste par rotter testet.
12. Træn en til to frivillige delvist blinde for de tildelte behandlinger for at identificere og registrere ytelt ved hjælp af en prøveudtagningsmetode med alle forekomster. Sørg for, at observatørerne bruger den definition af gabende, der er beskrevet i introduktions afsnittet.
13. Afspil og Projicer hver video på en computerskærm ved hjælp af et hvilket som helst standard afspilningssystem. Bed observatøren om at se hver video og observere og registrere ytelt adfærd ved hjælp af de tidligere udarbejdede datablade, så lad ham/hende gennemgå videoerne ved lavere hastigheder for at forbedre evnen til at observere og måle yteltet.
    1. Bed observatørerne om at score gabende ved hjælp af et notation system, der ligner følgende: Brug lodrette linjer med det minut, der er skrevet som en hævet skrift for at repræsentere forekomsten af en Gabe (f. eks. | ³ | | ⁶ | ⁹, der indikerer en Gabe på minut 3, to gaber på minut 6, og en Gabe på minut 9). Score gabende som en sekvens (f. eks, 1.2, 2,2, 3,2, 5,0, 5,8) for at optage det med større præcision (minutter afrundet til én decimal).
    2. Alternativt kan du direkte indlæse data fra videoerne til en computer ved hjælp af standard dataindsamlingsprogrammer. Sørg for, at observatøren er bekendt med sådanne programmer.
       Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skal du give observatøren mulighed for at se hver video i mere end én session. Sørg for, at en observatør ser alle de videoer, der svarer til en blok af eksperimenter. Hvis to forskellige observatører har set disse videoer, kan der være en risiko for, at forskelle i deres evne til at observere og registrere ytelt vil forvirre virkningerne af testsituationer. Det er vigtigt at score den interne observatør pålidelighed mellem forskellige observatører på 10%-20% af de videoer for at sikre, at ytelt er kommenteret på samme måde.

3. data behandling

1. Transskribere den tidsmæssige sekvens af gaber i hver rotte fra databladene til et regneark. Sørg for, at der er én kolonne for hver rotte med en kort overskrift (f. eks. FR1. l og FR1. r for at angive det første par velkendte rotter på henholdsvis venstre og højre side). Sørg for, at alle kolonner har samme længde ved at udfylde de tomme celler med enten 0 eller NA (se nedenfor).
   Bemærk: Brug den generelle vejledning som et supplerende dokument til fuldt ud at forstå følgende trin til at behandle data, måle smitsom ymarkise, og opnå smitsomme gabende kurver.
   1. Hvis yteltet blev indspillet til nærmeste minut, skal du indtaste antallet af gaber i hvert relevant minut og bruge 0 (ingen gabe) til at udfylde cellerne, når der ikke forekom nogen Gabe i et givet minut. Gem regnearket som en tekstfil (. txt).
   2. Hvis ytelt blev indspillet til nærmeste decimal af et minut, skal du indtaste sekvensen oppefra og bruge "na" til at udfylde de tomme rum af kolonner (rotter), hvor antallet af gaber (rækker) er lavere end kolonnen med det maksimale antal (rækker) af gaber registreret for en r På. Gem regnearket som en tekstfil (. txt).
      Bemærk: da R har evnen til at arbejde med tomme celler, kan regnearket gemmes med kolonner af forskellig længde. Brug de hjælp-indstillinger, som R har til at håndtere manglende data.
2. Start R. Importer dataene fra den fil, de tidligere var placeret i.
3. Opspare den plan koder hos den forlængelse ". R "(leveres som supplerende materiale), og download derefter den specifikke programkode (Se generel vejledning), afhængigt af om gaber blev registreret som heltal eller fraktioneret tal. Kør programmet for hvert par af rotter og ønskede antal tidsrammer.
   1. Kør programmet igen, nu ved hjælp af en tilfældig fordeling af antallet af gaber fra hver rotte (Se generel vejledning). Følg de samme trin (trin 3,3 til 3.3.1) for alle forsøgsbetingelser (dvs. velkendte og ukendte rotter) og/eller alle testsituationer. Fortsæt som angivet i den generelle vejledning, og eksportér resultaterne til Excel.
      Bemærk: i stedet for at importere et tidligere gemt program, som foreslået ovenfor ved hjælp af en tekst editor, kopiere og direkte indsætte programmet i r's arbejdsområde.
4. Hvis du vil oprette Gabe smitte-kurver, skal du bruge de data, der tidligere er gemt i et regneark. Træk ikke-afsmittende satser fra afsmittende satser for hvert par af rotter, tidsvindue, og testsituation. Adskil analyserne af de observerede data og kunstige (tilfældigt fordelte) data.
   1. Beregn derefter konfidensintervaller (CI) for hver tidsvindue og testsituation ved hjælp af en bootstrap-procedure (se den generelle vejledning). Adskil analyserne for velkendte og ukendte rotter. Kombiner derefter de kunstige data fra de fire testsituationer for hver eksperimentel tilstand, og Beregn CI for hvert tidsvindue ved hjælp af en bootstrap-procedure.
   2. Dernæst skal der oprettes observationsområder for hver testsituation og forsøgs tilstand (Se figur 2 og figur 3). Til sidst skal du udføre en multipel regressionsanalyse for at sammenligne intensiteten af gaben afsmitning mellem testsituationer (se nedenfor).

Representative Results

Rotterne blev udvalgt fra en tidligere produceret under linje af Sprague-dawley rotter, der blev udvalgt til hyppig ymarkise (ca. 22 gaber pr. time³¹). De ni par ukendte og ni par velkendte hanrotter (mellem 2,5 og 3 måneders alderen), der blev anvendt pr. testsituation, blev dog ca. 12 gange i timen, i gennemsnit¹⁸. Derfor er de testsituationer til at måle gabet afsmitning delvist hæmmet ymarkise adfærd.

Gabe afsmitning blev målt over en række tidsvinduer, der varierede fra 1 til 10 min. figur 2 viser den gennemsnitlige forskel i Gabe-raterne mellem ukendte hanrotter i afsmittende og ikke-afsmittende forhold for hver tidsvindue og testsituation. Disse Gabe afsmittende kurver indikerer, at kun oC rotter (i bure med perforeret, uigennemsigtig skillelinje) viste Gabe smitte, hvilket er tydeligt fra tid vindue 4 og fremefter, fordi CI af gennemsnittene ikke overlapper med EF-erhvervsgrenen af det tilfældigt tildelte antal gaber i løbet af 60 min periode. Bandet angav som forventet, at en tilfældig fordeling af antallet af gaber i hver rotte i observationsperioden producerede Gabe hastigheder, der svingede ved ca. nul, uden at vise noget tilsyneladende mønster.

Den multiple lineære regressionsmodel, der var monteret på dataene, viste, at kurverne fra de fire testsituationer var signifikant forskellige (F_{1, 3} = 11,5, p < 0,0001). Specifikt, gabet afsmittende var stærkere i OC rotter end: VC rotter (rotter i bure med en ikke-perforeret, klar skillelinje; t =-3,8, p < 0,001), VOC-rotter (rotter i bure med perforeret, klar skillelinje; t =-5,74, p < 0,0001) og nvoc-rotter (rotter i bure med en ikke-perforeret, uigennemsigtig skillelinje; t =-2,64, p < 0,01). I alle tilfælde var frihedsgraderne 695, da analysen ikke kun tog hensyn til de fire testsituationer, men også til de 10 tidsvinduer. Da disse betingelser genererede autokorrelerede målinger, blev der tilføjet en autokorrelations term (ARMA, det autoregressive glidende gennemsnit) til den statistiske model. De overordnede tendenser i de 10 tidsvinduer varierede også statistisk fra en 0-hældning (F_{1, 1} = 11,99, p < 0,0001). Figur 3 viser den samme analyse som i figur 2, anvendt på velkendte hanrotter. I dette tilfælde blev ingen af de fire testsituationer stimuleret til at smitte, fordi deres CI overlappede med det tilfældigt genererede CI-bånd. Der var ingen forskelle mellem de fire testsituationer (F_{1, 3} = p = 0,14); selv om den samlede stigning i gaben afsmittende over de 10 tid Vinduer adskilte sig fra en 0 hældning (F_{1, 1} = 9, p < 0,01).

Den rolle, som olfaction i det sociale liv i pattedyr kan være grunden til, at kun oC rotter viste Gabe smitte og gabede hyppigere end VC rotter¹⁸. Visuelle signaler kan ikke have lettet ymarkise, fordi albino rotter ikke se så godt som ikke-albino rotter. Men, VC rotter gabede dobbelt så meget som gruppen af rotter individuelt placeret i en observation bur ved siden af en tom bur¹⁸. Denne konstatering endeligt understøtter den sociale karakter af gabende og tyder på, at gabet afsmitning i rotter er afhængig af olfaktoriske stikord. Men sidstnævnte understøtter kun graden af fortrolighed mellem par af rotter som værende involveret i Gabe afsmitning, og auditive stikord er den sandsynlige kanal, som gabet afsmitning forekommer¹⁸.

Samlet set er disse uventede resultater i henhold til den forudsigelse, at velkendte snarere end ukendte rotter vil vise smitsom ymarkise. Selv om de viste resultater ikke bruger en positiv kontrol (vi har ingen data, hvor smitsom ymarkise observeres i nært beslægtede individer), menes det, at denne metode er objektiv for smitsom ymarkise i ukendte rotter. Flere elementer understøtter en sådan påstand. Første, kendte og ukendte rotter ikke afviger i de gennemsnitlige frekvenser af ytelt¹⁸; således, forskellene i gabet afsmittende opdaget her syntes ikke at afhænge af, hvor ofte de yawned. For det andet er det forhold, at det samme antal gaber pr. rotte blev tilfældigt fordelt til observationsperioden, og at dette ikke frembringer en Gabe lige afsmittende virkning i nogen gruppe, at konstateringen af smitsom ytelt i ukendte rotter er mere robust. Endelig blev en cross-korrelationsanalyse (til påvisning af samtidige matchning af adfærd) tidligere anvendt¹⁸ til det samme datasæt, der anvendes her, og resultatet faldt sammen med det, der blev fundet. Derfor er denne metode følsom nok til at detektere og måle ændringer i smitsom ymarkise.

Alternativt kan det sættes spørgsmålstegn ved, om hvad der blev fundet her er smitsom ymarkise. En sådan bekymring er ikke forbeholdt denne undersøgelse. Der er to perspektiver, hvorfra smitsom gabende og årsagssammenhæng har vakt bekymring. For det første synes empati ikke at være den eneste faktor, der ligger til grund for smitsom gabende¹⁸, da arter, der ikke forventes at vise empati og/eller mentale tilstands tilskrivnings færdigheder som får og rotter, stadig kan vise smitsom ymarkise. For det andet er der voksende bekymring for, at det, der kaldes smitsom gabende, måske ikke er som sådan. I mange årtier (Thorpe, 1956; citeret tidligere¹⁰), smitsomme, stereotype adfærd mønstre og smitsom ymarkise i særdeleshed er blevet betragtet som et udtryk for social lettelse. For nylig foreslog Kapitány og Nielsen²⁵ ved hjælp af simulerede data, at hvad der er en perceptuel mønster-anerkendelse fejl kan fejlagtigt kaldes smitsom ymarkise. Derfor kan problemet ikke ligge i den måde, smitsom ymarkise måles, men snarere i, hvordan det er defineret.

Sammenfattende er den metode, der foreslås her, nyttig til at detektere gaben afsmittende virkning. Desuden er det nyttigt at kassere nogle sensoriske stikord, og dermed reducere antallet af sensoriske signaler til kun en eller to. Yderligere eksperimenter til at teste specifikke forudsigelser er nødvendige for at skelne virkningerne af en følelse fra de andre.

Figur 1 : Skematisk observation set-up til måling af smitsom ymarkise. Fire individuelle bure blev arrangeret parvis på hver side af det omvendte T-formede bord. I hvert par, de bure stod over for hinanden med akryl skillevægge i mellem. Den specifikke testsituation afgør, om skillelinjen mellem burene har huller, og om den er klar eller uigennemsigtig. De videokameraer var strategisk placeret til at registrere enhver forekomst af ymarkise adfærd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Yawn smitte kurver for ni par ukendte hanrotter udsat for (a) olfaktoriske cues, (B) visuelle signaler, (C) olfaktoriske og visuelle signaler, og (D) hverken visuelle eller olfaktoriske signaler. Hver cirkel repræsenterer den gennemsnitlige forskel i Gabe-hastighed med 95% konfidensintervaller (CI) fra en rotte, der råbte i samme minut eller i minuttet (tidsvindue) forud for den anden rotte, og da den ikke havde Gabe. Gabe-værdier over den stiplede linje indikerer gaben afsmitning, hvorimod værdier under den stiplede linje indikerer ikke-gabet afsmitning. Den faste linje, der slutter sig til punkterne i hvert tidsvindue, bruges til at angive den gennemsnitlige forskel i Gabe-rater i hvert tidsvindue, hvor antallet af gaber for hver rotte blev tilfældigt allokeret til den 60 minutters observationsperiode. Det mørkegrå bånd indikerer en 95% CI opnået ved at kombinere det tilfældige datasæt fra de fire testsituationer på hvert tidsvindue (en kontinuerlig nuance bruges til at lette fortolkningen af figuren). Et par rotter eksponeret for olfaktoriske cues blev fjernet fra analysen, fordi ingen af de rotter yawned. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Yawn smitte kurver for ni par velkendte hanrotter udsat for (a) olfaktoriske cues, (B) visuelle signaler, (C) olfaktoriske og visuelle signaler, og (D) hverken visuelle eller olfaktoriske signaler. Hver cirkel repræsenterer den gennemsnitlige forskel i Gabe-hastighed med 95% konfidensintervaller (CI) fra en rotte, der råbte i samme minut eller i minuttet (tidsvindue) forud for den anden rotte, og da den ikke havde Gabe. Gabe-værdier over den stiplede linje indikerer gaben afsmitning, hvorimod værdier under den stiplede linje indikerer ikke-gabet afsmitning. Den faste linje angiver den gennemsnitlige forskel i Gabe-satserne i hvert tidsvindue, hvor antallet af gaber for hver rotte blev tilfældigt allokeret til den 60 min observationsperiode. Det mørkegrå bånd indikerer en 95% CI opnået ved at kombinere det tilfældige datasæt fra de fire testsituationer på hvert tidsvindue. Et par rotter udsat for visuelle stikord blev fjernet fra analysen, fordi en af rotterne ikke Gabe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er kritiske trin i den metode, der bør tages hensyn til at opnå vellykkede resultater. Velkendte rotter skal dele hjem bure i mindst 1,5 måneder efter fravænning og før de kører forsøgene. Dog, ukendte rotter skal leve i separate hjem bure. I begge tilfælde skal par af rotter kommer fra forskellige kuld, men være så ens i alder som muligt. Med hensyn til observation bure, bør deres huller matche dem i skillevægge, fordi dette er den eneste måde at garantere olfaktoriske kontakt mellem rotter. Skillevægge, på den anden side, skal være klar nok til at sikre visuel kontakt eller uigennemsigtig nok til at sikre ingen visuel kontakt. Den træ afsnit imellem sig par i rats og den anden skal være tilstrækkelig hen til hindre den rats oven på sig side af seende dem oven på den anden side. Et andet afgørende aspekt er det hensigtsmæssige design af eksperimentet. Når der er mistanke om, at en proces kan være partisk, bør en tilfældig procedure gennemføres³⁰.

Metoden bør ikke udgøre alvorlige problemer for brugerne. At gøre hullerne i glasset var det vigtigste tekniske problem konfronteret, og på grund af det, akryl blev brugt i stedet. Ikke desto mindre kan glas anvendes til at gøre hele observations bure, forudsat professionel rådgivning er opnået. Det skal sikres, at kanterne af hullerne er gemt for at undgå glas Splinter, der kan skade rotterne. Det anbefales dog ikke at ændre hovedmetoden (f. eks. ved at gøre hullerne større). Desuden kan brug af en kombineret gruppe af hanner og hunner gøre det vanskeligt at påvise gabet afsmittende virkning.

De delere, der anvendes her, kan være utilstrækkelige til at forhindre rotter i at bruge auditive signaler, fordi rotter er i stand til at producere og opfatte lyde ved frekvenser, hvor materialerne i observations bure og delelinjer sandsynligvis ikke blokerer. Men denne situation i sig selv gør det muligt at udlede, at auditive signaler forårsagede Gabe afsmittende¹⁸ og at olfaktoriske signaler kun lettet anerkendelsen af partnerens grad af fortrolighed. Den metode, der foreslås her, giver derfor stadig rimelig dokumentation for at identificere de sanser, der er involveret i smitsom ymarkise og deres intensitet.

Tidligere metoder er designet til at studere smitsom ymarkise i laboratorieforhold primært ved at præsentere videoer til de eksperimentelle individer^12,13, men disse var tvivlsomme tilgange i form af biologisk gyldighed. Den metode, der præsenteres her løser denne bekymring ved hjælp af socialt interagerende dyr i forhold mere ligner, hvad der sker i den virkelige verden. Desuden er det muligt samtidig at undersøge deltagelsen af flere sensoriske metoder i en enkelt eksperimentel set-up. Det erkendes, at denne metode ikke helt skelner mellem virkningerne af auditive signaler og andre sensoriske signaler. Men et veldesignet yderligere eksperiment kan give forskerne mulighed for at udlede den mest sandsynlige sensoriske modalitet, der involverer¹⁸. En mulig noninvasiv løsning er brugen af hvid støj til at maskere lyde og eliminere auditive signaler. Tilsvarende, forskere kan udsætte naive rotter til strøelse fra oC rotter til at bestemme den rolle, olfaktoriske stikord, som er en dokumenteret procedure i social lettelse undersøgelser³².

Brugen af denne metode kan udvides til at studere gaben afsmitning i andre arter. For eksempel kan dette set-up bruges efter enkle ændringer med dyr som mus og hamstere til at sammenligne Gabe smitte kurver. Sammenligninger mellem forskellige arter kan afsløre uventede mønstre. Den grundlæggende eksperimentelle plan kan arbejde med større dyr som marsvin, katte og kaniner. Ligeledes kan metoden bruges til at studere andre potentielt smitsomme adfærd såsom grooming og ridser. Det R-baserede program kan reducere den tid, der bruges på at beregne gaben afsmitning i flere tidsvinduer, og kan bruges til at måle gabet smitte i andre hvirveldyr arter, forudsat at brugeren tidligere har indsamlet relevante data.

Sammenfattende, de vigtigste fordele ved denne metode er at føre til erhvervelse af gabet afsmittende kurver og medvirken i forskelsbehandling mellem de relative roller af sensoriske metoder involveret. Erhvervelse af Gabe smitter kurver er, så vidt vi ved, en ny tilgang, der kan være nyttige til at måle styrken af en afsmitning og observere, hvordan denne intensitet varierer mellem arter. I overensstemmelse hermed, den metode kunne ligeledes være anvendte hos noget forandringer i anden animalsk arter såsom får¹⁶, Wolves¹⁵, hunde³³, slanger³⁴, og fisk⁵. I alle disse arter undtagen slanger, er ymarkise tidligere blevet dokumenteret. Faktisk er en metode, der ligner den, der præsenteres her, blevet anvendt med succes i undulater²⁷. Denne metode kan også bruges til at studere andre typer af adfærd, der er smitsom. For eksempel kan adfærd som følelsesmæssig reaktivitet, grooming og ridser i gnavere være smitsom. Faktisk, den metode, der foreslås her viste smitsom følelsesmæssig reaktivitet i velkendte rotter¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.