En laboratorie metod för att mäta smittsam gäspningar i råttor

Summary

Den metod som beskrivs här syftar till att få gäspning smittspridning kurvor i par välbekanta eller okända hanråttor. Burar med hål åtskilda av antingen klara eller ogenomskinliga partitioner med (eller utan) hål används för att upptäcka om visuella, lukt sinnet, eller båda typerna av sensoriska signaler kan stimulera gäspning smitta.

Abstract

Kommunikation är en viktig aspekt av djurens sociala liv. Djuren kan påverka varandra och samlas i skolor, flockar och hjordar. Kommunikation är också det sätt könen interagerar under uppvaktning och hur rivaler lösa tvister utan att slåss. Det finns dock vissa beteende mönster som det är svårt att testa förekomsten av en communicatory funktion, eftersom flera typer av sensoriska modaliteter är sannolikt inblandade. Till exempel smittar gäspningar är en communicatory handling i däggdjur som kan uppstå genom syn, hörsel, lukt, eller en kombination av dessa sinnen beroende på om djuren är bekant för varandra. Därför, för att testa hypoteser om den möjliga communicatory roll sådana beteenden, en lämplig metod är nödvändig för att identifiera de deltagande sensoriska modaliteter.

Den metod som föreslås här syftar till att få gäspning smittspridning kurvor för bekanta och okända råttor och utvärdera den relativa deltagandet av visuella och lukt sinnet sensoriska metoder. Metoden använder billiga material, och med några smärre förändringar, kan det också användas med andra gnagare arter såsom möss. Sammantaget innebär metoden att man ersätter tydliga avdelare (med eller utan hål) med ogenomskinliga avdelare (med eller utan hål) som antingen tillåter eller förhindrar kommunikation mellan råttor placerade i intilliggande burar med hål i angränsande sidor. Följaktligen kan fyra villkor testas: lukt kommunikation, visuell kommunikation, både visuell och lukt kommunikation, och varken visuell eller lukt kommunikation. Som social interaktion uppstår mellan råttor, dessa test förhållanden simulera vad som kan uppstå i en naturlig miljö. I detta hänseende är den metod som föreslås här mer effektiv än traditionella metoder som förlitar sig på video presentationer vars biologiska giltighet kan ge upphov till oro. Icke desto mindre diskriminerar den inte mellan den potentiella roll som hörsel och roller av lukt och vision i gäspa smitta.

Introduction

Traditionellt har kommunikcatory beteende studerats från två perspektiv. Ur ett perspektiv, Etologer observera och registrera beteendet hos djur i naturliga miljöer och försök att känna igen dess adaptiva värde¹. Den särskilda känsla eller sinnen som berörs har inte varit det primära intresset för dessa studier. Från ett annat perspektiv är fysiologer mer intresserade av att reda ut de mekanismer genom vilka djur kommunicerar¹; Därför har laboratorie studier tillhandahållit metoder för att ta itu med den roll som sensoriska modaliteter spelar i kommunikation^2,3. Dessa två perspektiv är verkligen kompletterande, eftersom kunskap om både adaptiva värde och omedelbara mekanismer är nödvändigt för att få en omfattande förståelse för kommunikkatoriska beteenden i det sociala livet av djur.

Gäspningar beteende är en iögonfallande del av beteendemässiga repertoaren i flera arter av ryggradsdjur⁴, allt från fisk till primater⁵. Det kan beskrivas som en långsam öppning av munnen och underhåll av dess öppna läge, följt av en snabbare stängning av munnen⁵. Varaktigheten av hela sekvensen beror på arten; till exempel primater gäspa för längre löp tider än icke-primater art⁶. I många arter, med människor är undantaget, män tenderar att gäspa oftare än Honor⁷. Denna funktion kan ligga till grund för den möjliga communicatory funktionen av gäspningar, även om regelbundna mönster av gäspningar och dess dagliga frekvens kan också föreslå en fysiologisk funktion. Hos råttor följer spontan gäspningar en dygns rytm, med toppar av hög frekvens som förekommer på morgonen och eftermiddagen^8,9.

Ett intressant inslag i gäspningar beteende är att det kan vara en smittsam handling (när släppa stimulans av ett beteende råkar vara ett annat djur beter sig på samma sätt¹⁰) i flera arter av ryggradsdjur^{11,12, 13,14,15,16}, inklusive fåglar¹⁷ och gnagare¹⁸. Dessutom har de senaste rönen antytt att smittsam gäspning kan återspegla en gemenskap roll, eftersom gäspning av en råtta kan påverka det fysiologiska tillståndet i en annan när de utsätts för lukt LED trådar¹⁹. Men om gäspningar har en communicatory roll är fortfarande under debatt^20,21, och analysera smittsam gäspningar är ett viktigt första steg för att lösa denna fråga.

Å andra sidan har smittsam gäspningar kopplats till ett djurs förmåga att känna empati med andra djurs perspektiv. Därför, nära besläktade individer är mer benägna att Visa smitta⁴. Denna hypotes har testats ofta i laboratorie situationer där djur presenteras med gäspning stimuli på video^12,13; Därför kan smitta endast ske genom visuella signaler. Andra undersökningar har bedömt gäspning smitta i mer naturliga förhållanden med hjälp av grupper av djur^14,15. Ett stort problem med detta är att socialt samverkande djur ofta reagerar på LED trådar och utbyta signaler som förmedlas genom kombinationer av sensoriska modaliteter. Disentangling de faktiska sinnen inblandade i ett visst beteende från deras kombinerade effekter är inte alltid en lätt uppgift. Typiskt, forskare farmakologiskt eller kirurgiskt hindrar ett djurs användning av en given mening, sedan härleda den roll som denna känsla i det relevanta beteendet^2,3,18,22. Lyckligt vis finns det andra metoder där endast fysiska barriärer används för att antingen tillåta eller hindra kommunikation mellan djur^23,24och25, och därigenom uppnå större biologisk giltighet.

Den metod som föreslås här har utformats speciellt för att studera smittsam gäspningar i bekanta och okända råttor i en social miljö. Enligt empatisk hypotes, den tidigare gruppen bör vara mer mottagliga för smittsam gäspningar. Metoden kräver inte att djuren kirurgiskt eller farmakologiskt berövas några sinnen. Istället, det fungerar genom att placera råttor i intilliggande burar med hål och fysiskt hindrar deras kommunikation med antingen klara eller ogenomskinliga avdelare med eller utan hål. Således kan fyra test förhållanden undersökas: (1) lukt kommunikation (OC, perforerad ogenomskinlig avdelare), (2) visuell kommunikation (VC, icke-perforerad klar avdelare), (3) visuell och lukt kommunikation (VOC, perforerad klar avdelare), och (4) varken visuell eller lukt kommunikation (NVOC, icke-perforerad ogenomskinlig avdelare). Därför kan forskarna jämföra de relativa bidragen från lukt, visuell, och till viss del auditiva LED trådar i gäspa smitta. Detta tillvägagångs sätt är inte nytt, eftersom liknande metoder har använts för att isolera sinnen inblandade i vissa communicatory beteenden hos djur som ödlor²³ och möss²⁶. I själva verket har Gallup och kollegor²⁷ använt en liknande metod för att demonstrera rollen av visuella signaler i smittsam gäspningar i undulater. De viktigaste inslagen i dessa metoder är simulering av ett socialt sammanhang och den minimala påfrestning som drabbar djuren. Dessutom ökar användningen av interagerande djur den biologiska giltigheten av satserna.

Det finns flera sätt att mäta smittsam gäspning^25,28. Dr Stephen E. G. Lea (personlig kommunikation, 2015) hjälpte oss att numeriskt anpassa en metod som tidigare använts av primatologer^13,14 för en tidigare analys av de uppgifter som används här¹⁸. Presenteras i detta protokoll är en förbättrad version av denna metod med ett bredare spektrum av applikationer. Den består av viktning av det totala antalet en råttans gäspar, inom och utanför en given tidsfönster, av den andel av observations tiden som motsvarar gäspar inom och utanför tidsfönstret.

Till exempel, om det antas att råttor A och B observeras för 12 min, är deras gäspningar registreras till närmaste minut, och en 3 min tidsfönster är inställd på att mäta smittsam gäspningar. Nästa, följande sekvenser av gäspar för var och en av dessa råttor anses: råtta a (0, 0, 1,0, 0,0,0,0,0,0,0, 2, 1) och råtta B (0, 1, 1, 0, 1, 1,0, 0,0,0,0, 0,3). Det bör noteras att varje nummer (0-3) motsvarar antalet gäspar görs vid varje min. För råtta A, under minuterna 1, 10, och 11 (antalen i djärv typ), råtta B er icke gäspa inom det föregående 3 min (den valde tid fönster) eller inom så pass minut. I dessa minuter, råtta a gäspar totalt 2 gånger. Därför gäspning hastighet av råtta A utan någon gäspning stimulans (icke-post-gäspning gäspning ränta) är 2/3 (dvs., 0,67 yawns/min). I de återstående 9 min, råtta B gäspar minst en gång i antingen samma minut eller 3 tidigare minuter. Råtta a gäspar totalt fyra gånger i dessa 9 min. Därför gäspning hastighet av råtta A som svar på en gäspa stimulans (efter gäspning gäspning ränta) är 4/9 (dvs., 0,44 yawns/min). Tillämpningen av samma förfarande till råtta B ger en icke-post-gäspning gäspning skattes ATS på 2/3 (dvs. 0,66) och efter gäspning gäspning skattes ATS på 5/9 (0,55).

Å andra sidan, om gäspningar registreras till närmaste decimal i en minut, kommer gäspning smitta resultera i en justerad efter gäspning tid. Till exempel, om följande gäspning gånger registreras under en 12 min observations period för råttor a och B: råtta a (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) och råtta B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). För råtta A, de tids perioder över vilka råtta B inte gäspa inom de senaste 3 min sträcker sig från 0 till 1,2 min och från 8,1 till 11,2 min (dvs. 3,1 min), vilket ger totalt 4,3 min av icke-post-gäspning tid. Antalet gånger som råtta en gäspar under dessa tider är tre (siffror i fetstil), så den icke-post-gäspning gäspning skattes ATS är 3/4.3 (dvs., 0,69), medan efter gäspning gäspning skattes ATS är 3/7.7 (dvs., 0,38; nämnaren från 12-4.3 min). Likaså för råtta B, de tids perioder över vilka råtta A inte gäspa inom de senaste 3 min sträcker sig från 0 till 2,3 min och från 8,8 till 10,4 min, vilket ger totalt 3,9 min. Antalet gånger råtta B gäspar inom dessa perioder är en, så den icke-post-gäspning gäspning skattes ATS är 1/3.9 (dvs., 0,25). Följaktligen är den post-gäspning gäspning skattes ATS 6/8.1 (dvs., 0,74).

Medan en nästan samtida match i beteende är ett idealiskt kriterium för att påvisa närvaron av en smitta, aspekter såsom begränsningar på vad en individ deltar i, tid för reaktion på en stimulans, distribution av beteendet över tiden (t. ex. gäspningar kan förekomma i episoder), och tid att vänja sig vid den experimentella inställningen alla ger upphov till art skillnader, vilket gör det svårt att använda en unik tidsfönster. Detta kan vara anledningen till att forskare har använt tidsfönster som varierar från sekunder⁵ till flera minuter¹¹, vilket skapar problem när man jämför resultat²⁸. På grund av detta, det föreslås att upprepa det förfarande som beskrivs ovan för en rad tids fönster för att få gäspning smittspridning kurvor och jämföra gäspning smittspridning kurvor mellan arter.

Likvärdiga gäspning smitta kurvor kan jämföras genom att slumpmässigt fördela antalet gäspar observerats för varje råtta under observations perioden. Sålunda, den föreslagna metoden för att mäta gäspning smitta erbjuder två typer av kontroller: den (1) gäspning takt som inträffar utanför tidsfönstret (icke-post-gäspning tid) och (2) konstgjord gäspning smitta kurva erhålls från slumpmässig fördelning av antalet yawns. Därför är detta tillvägagångs sätt för att analysera gäspning smitta ett steg framåt från andra förfaranden, såsom de som jämför den procentuella eller frekvensen av gäspningar inom en enda tidsfönster till det som sker utanför detta fönster²⁵, utan att ta hänsyn till faktiska tids ramar. Metoden kompletteras av ett R-baserat program²⁹ för att bekvämt och objektivt beräkna sannolikheten för smittsam gäspning för en eller flera tidsfönster.

För att illustrera nyttan av denna metod och fördelarna med det R-baserade programmet används en data uppsättning från en tidigare publicerad studie¹⁸ . Det experimentella tillståndet bestod av 144 hanråttor som tilldelats antingen ett välbekant eller okänt tillstånd. Råttorna i varje experimentellt tillstånd var indelade i fyra under grupper av nio par och utsätts för någon av de fyra test situationer som beskrivs ovan. Den gäspningar beteenden av råttor i varje experimentellt tillstånd och test situation registrerades sedan under en period av 60 min.

Protocol

Försöks protokollen och djur hållningen genomfördes i enlighet med de institutionella rikt linjerna.

1. material som

1. Hitta en komplett lista över de material som används för att implementera metoden i material tabellen. Använd figur 1 och Sök expert råd för att konstruera en inverterad T-formad tabell, observations burar och bur avdelare. Följ säkerhets anvisningarna för användning av vassa verktyg och potentiellt farliga material.
2. Gör en inverterad T-formad tabell genom att limning två rälsliknande trä barer (45 cm längd, separerade 0,6 cm från varandra) på toppen och i mitten av en träbit (100 cm x 45 cm x 1,5 cm). Sedan, placera en andra bit av trä (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) vertikalt mellan rälsliknande barer. Se till att denna andra träbit hindrar paret av råttor på ena sidan från att se det andra paret på motsatt sida (figur 1).
3. Använd glas och akryl för att skapa åtta observations burar. Se till att varje bur (19 cm bred, 19 cm lång, 10 cm hög, 3 mm tjock) har 24 lika avlägsna hål (5 mm diameter) ordnade i tre rader i mitten av en av dess sidor. Gör denna sida av akryl (3 mm tjock) och förkorta höjden av den motsatta sidan med 0,7 cm för att låta råtta att andas.
   1. Se till att varje observations bur har ett skjutlock av akryl för att förhindra att råtta från uppfödning och distraherande sig under 60 min observations period.
4. Gör fyra avdelare av akryl (19 cm bred, 30 cm hög, 3 mm tjock). Borra 24 hål (5 mm i diameter) som matchar dem i observations burar, var och en i en klar avdelare och en ogenomskinlig avdelare.
5. Förbered data Bladen i förväg för att registrera förekomsten av yawns. Inkludera, i rubriken till varje datablad, observatörens namn, försöks tillstånd (dvs. bekanta eller obekanta råttor), relevant test situation (OC, VC, VOC, NVOC), datum samt inledande och avslutande tidpunkter för observationen. Dela upp resten av data bladet i två kolumner, var och en med antalet råtta skrivet i den övre delen, för att registrera gäspningar beteende råttor.

2. förfarande

1. Hus 144 hanråttor i grupper om fyra i plast burar (hem burar) från avvänjning tills de når 2,5 månader i ålder. Använd inte honråttor, eftersom de tenderar att visa större variation i beteende på grund av hormonella cykler, som kan förväxlas med effekterna av test situationen. Se till att råttorna i varje bur inte är syskon.
   Obs: det kan vara svårt att få alla råttor tillsammans. I så fall, skapa block av minst 8 bekanta råttor och 8 obekanta råttor så att varje test situation representeras en gång i varje experimentellt tillstånd³⁰.
2. För att identifiera råttorna, markera dem med symboliska nummer på svansar med en kommersiell markör. Representera till exempel siffrorna 1 till 4 genom att kombinera punkter och linjer (t. ex. en prick för nummer 1 och en rad för nummer 4). Identifiera bekanta och okända råttor med hjälp av olika färger.
   Anmärkning: hantera råttorna efter säkerhets anvisningar som tillhandahålls av djur anläggningens personal och Följ rekommendationerna om korrekt användning av försöks djur vid den institution där experiment kommer att utföras.
3. Slumpmässigt välja vilka hem burar kommer att hysa den grupp av bekanta råttor och som kommer att hysa den okända gruppen. Anta till exempel att det finns 16 tillgängliga råttor som bor i fyra hem burar: numrera hem burar 1 till 4, Använd sedan R (ladda ner det på http://cran.r-project.org/) enligt följande [efter prompten (>)]:
   > prov (4, 4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Gruppera de bekanta (eller okända) råttor i hem burar 4 och 3, och gruppera de obekanta (eller bekanta) råttor i hem burar 2 och 1. Se till att djur anläggningens personal upprätthåller identiteten för varje bur och hanterar råttorna på samma sätt som alla andra råttor i djur anläggningen.
   2. Använd R-programmet igen och slumpmässigt välja råttor för att bilda varje par i varje experimentellt tillstånd. Se till att råttorna i varje par bekanta råttor kommer från samma hem bur, och se till att det motsatta är sant för paren i den okända gruppen. Slumpmässigt välja par av råttor för varje test situation i varje experimentellt tillstånd.
4. Utför två testsessioner per dag med två av de åtta möjliga test situationerna (fyra för varje bekant och obekanta råtta) per testsession (dvs. 60 min observations period). Genomför de två testsessionerna efter varandra inom 3 h.
   Obs: se till att genomföra alla testsessioner (fyra par råttor per dag) antingen på morgonen eller eftermiddagen för att undvika alla störande faktorer. Kör en fullständig replikation (åtta test situationer) av experimentet under två dagar i följd.
   1. Kontrol lera att du använder test situationerna i en slumpmässig sekvens för varje replikation av experimentet. Använd till exempel siffrorna 1 till 8 för att identifiera varje test situation och använd sedan R enligt följande:
      > prov (8, 8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Allokera test situationer 8 och 7 för att testa session 1, testa situationer 4 och 6 för att testa session 2 och så vidare. Sedan, slumpmässigt välja sidan av den inverterade T-formad tabell där varje par råttor (test situation) kommer att placeras.
5. Upprepa samma procedur (steg 2,3 till 2.4.2) för en andra replikation (d.v.s. block) av experimentet.
   Anmärkning: om syftet med studien är att testa effekterna av ett socialt tillstånd (dvs. två samverkande råttor) på gäspningar frekvens, Använd en råtta placerad i en observations bur bredvid en tom observations bur som en kontroll för var och en av de fyra test situationer. Utför detta experiment 2x för varje test situation för en kontroll grupp av åtta råttor.
6. Ställ in Testsessionen genom att överföra de första fyra råttorna från djur anläggningen till observations rummet, där de kommer att finnas kvar i 15 minuter för att vänja sig vid den nya miljön. Transportera råttorna i individuella burar och håll dem åtskilda från varandra under transporten och i observations rummet.
   Anmärkning: Följ säkerhets anvisningarna för transport av djur som tillhandahålls av djur anläggningens personal och Använd de angivna kläderna för att arbeta med djur i laboratoriet. Råttorna kommer inte att ha till gång till mat och vatten medan de är i observations rummet.
7. Efter acklimatiseringsperioden har passerat, placera den inverterade T-formade tabellen på ett större rektangulärt bord. Se till att det finns en taklampa som tillräckligt lyser upp rummet när du gör observationer.
8. Lägg filter papper på botten av varje observations bur och placera burar i par på vardera sidan av det inverterade T-formade bordet. Placera motsvarande avdelare mellan varje burpar.
   Anmärkning: filter papperet gör det lättare att rengöra burar och ger en grov yta som råttorna kan röra sig utan att glida.
9. Strategiskt placera två digitala video kameror så att varje registrerar gäspningar beteende varje par råttor. Se till att video kamerorna är säkert fixerade på stativ och korrekt orienterade till observations burar. Anslut video kameror till en stationär dator för att samtidigt övervaka beteendet hos råttor.
   Obs: lagra den digitala informationen på flash-enheter för att permanent arkivera experimentella sessioner. Använd flashenheter med hög lagrings kapacitet.
10. Efter acklimatiseringsperioden placerar du råttorna i observations burar enligt den tidigare fastställda allokeringen. Ställ in kamerans automatiska fokus och starta videoinspelning samtidigt med ett stoppur. Stoppa videoinspelning i slutet av 60 min observations period.
    Obs: medan experimenterande kan vara utanför rummet under Testsessionen och observera på distans, rekommenderas att en person är i observations rummet (så långt bort som möjligt från den experimentella inställningen) samtidigt övervaka beteendet hos råttor att säkerställa att Testsessionen fortskrider utan avbrott.
11. När observationen är över, returnera råttorna till deras hem burar i djur anläggningen. Be personalen på djur anläggningen att se till att råttorna har till gång till mat och vatten igen. Rengör observations burarna noggrant med ett giftfritt rengörings medel och Förbered den experimentella uppsättningen för att utföra de andra och sista provsessionerna under dagen.
    Obs: Rengör trä för att ta bort eventuella dofter kvar av råttor när de placeras i observation burar, vilket kan påverka beteendet hos nästa par råttor testade.
12. Utbilda en till två volontärer delvis blinda för de tilldelade behandlingarna för att identifiera och registrera gäspningar med hjälp av en all-förekomst provtagnings metod. Se till att observatörerna använder den definition av gäspningar som beskrivs i introduktions avsnittet.
13. Spela upp och projicera varje video på en dator skärm med valfritt standard uppspelnings system. Be observatören att se varje video och observera och registrera gäspningar beteende med hjälp av tidigare för beredda datablad, sedan låta honom/henne att granska videor i långsammare hastigheter för att förbättra förmågan att observera och mäta gäspningar.
    1. Be observatörerna att göra mål gäspningar med hjälp av ett notationssystem som liknar följande: Använd vertikala linjer med den minut som skrivits som en upphöjd för att representera förekomsten av en gäspning (t. ex. | ³ | | och ⁶ | ⁹, vilket tyder på en gäspning på minut 3, två gäspar på minut 6, och en gäspa på minut 9). Poäng gäspningar som en sekvens (t. ex. 1,2, 2,2, 3,2, 5,0, 5,8) för att spela in den med större precision (minuter avrundat till en decimal).
    2. Alternativt kan du direkt mata in data från videorna till en dator med standard data insamlings program. Se till att observatören är bekant med sådana program.
       Om det behövs kan du låta observatören Visa varje video i mer än en session. Se till att en observatör visar alla videor som motsvarar ett experiment block. Om två olika observatörer såg dessa filmer, kan det finnas en risk att skillnader i deras förmåga att observera och registrera gäspningar kommer att blanda ihop effekterna av test situationer. Det är viktigt att poängta den intraobserver tillförlitlighet mellan olika observatörer på 10%-20% av filmerna för att säkerställa att gäspningar är kommenterade på samma sätt.

3. data behandling

1. Transkribera den temporala sekvensen av gäspar i varje råtta från data bladen till ett kalkyl blad. Se till att det finns en kolumn för varje råtta med en kort rubrik (t. ex. FR1. l och FR1. r för att indikera det första paret bekanta råttor på vänster respektive höger sida). Se till att alla kolumner är av samma längd genom att fylla de tomma cellerna med antingen 0 eller NA (se nedan).
   Obs: Använd den allmänna guiden som tillhandahålls som ett kompletterande dokument för att till fullo förstå följande steg för att bearbeta data, mäta smittsam gäspningar, och få smittsamma gäspningar kurvor.
   1. Om gäspningar spelades in till närmaste minut, skriv in antalet gäspar vid varje relevant minut och Använd 0 (ingen gäspning) att fylla i cellerna när ingen gäspning inträffade i en given minut. Spara kalkyl bladet som en textfil (. txt).
   2. Om gäspningar spelades in till närmaste decimal i en minut, skriv i sekvensen uppifrån och Använd "na" för att fylla i de tomma utrymmena i kolumnerna (råttor) där antalet gäspar (rader) är lägre än den i kolumnen med det maximala antalet (rader) av gäspar registreras för en r På. Spara kalkyl bladet som en textfil (. txt).
      Anmärkning: eftersom R har förmågan att arbeta med tomma celler, kan kalkyl bladet sparas med kolumner av olika längder. Använd de hjälp alternativ som tillhandahålls av R för att hantera saknade data.
2. Initiera R. importera data från den fil som de tidigare var placerade.
3. Spara program koderna med tillägget ". R "(tillhandahålls som kompletterande material), sedan ladda ner den specifika program koden (se allmän guide) beroende på om gäspar registrerades som heltal eller bråk tal. Kör programmet för varje par av råttor och önskat antal tids ramar.
   1. Kör programmet igen, nu med en slumpmässig fördelning av antalet gäspar från varje råtta (se allmän guide). Följ samma steg (steg 3,3 till 3.3.1) för alla experimentella tillstånd (t. ex. bekanta och obekanta råttor) och/eller alla test situationer. Fortsätt enligt anvisningarna i den allmänna guiden och exportera resultaten till Excel.
      Obs: i stället för att importera ett tidigare sparat program, som föreslagits ovan med hjälp av en text redigerare, kopiera och direkt klistra in programmet i R: s arbets yta.
4. För att skapa gäspning spridnings kurvor, använda de data som tidigare sparats i ett kalkyl blad. Subtrahera icke-smitta priser från smitta priser för varje par av råttor, tidsfönster, och testa situationen. Separera analyserna av observerade data och artificiella (slumpmässigt distribuerade) data.
   1. Därefter beräknar du KONFIDENS intervall (CI) för varje tidsfönster och test situation med hjälp av en bootstrap-procedur (se den allmänna guiden). Separera analyserna för bekanta och obekanta råttor. Kombinera sedan de artificiella data från de fyra test situationerna för varje experimentellt tillstånd och beräkna CI för varje tidsfönster med hjälp av en bootstrap-procedur.
   2. Skapa sedan tomter för varje test situation och experimentellt tillstånd (se figur 2 och figur 3). Slutligen, utföra en multipel Regressions analys att jämföra intensiteten av gäspa smitta mellan test situationer (se nedan).

Representative Results

Råttorna valdes ut från en tidigare producerad sub-line av Sprague-Dawley råttor som valdes ut för täta gäspningar (cirka 22 gäspar per timme³¹). Men de nio par obekanta och nio par bekanta hanråttor (mellan 2,5 och 3 månaders ålder) som används per test situation gäspade cirka 12 gånger per timme, i genomsnitt¹⁸. Därför test situationer för att mäta gäspning smitta delvis hämmad gäspningar beteende.

Gäspning smitta mättes över en rad tidsfönster som varierade från 1 till 10 min. figur 2 visar den genomsnittliga skillnaden i gäspning priser mellan okända hanråttor i smitta och icke-smitta villkor för varje gång fönster och test situation. Dessa gäspa smitta kurvor visar att endast OC råttor (i burar med en perforerad, ogenomskinlig avdelare) visade gäspning smitta, vilket är uppenbart från tid fönster 4 och framåt, eftersom CI av medelvärden inte överlappar med CI av slumpmässigt tilldelade nummer gäspar under 60 min period. Bandet uppgav, som väntat, att en slumpmässig fördelning av antalet gäspar i varje råtta under observations perioden producerade gäspning priser som pendlade vid ungefär noll, utan att visa några uppenbara mönster.

Den multipel linjära Regressions modell som monterats på data indikerade att kurvorna från de fyra test situationerna var signifikant annorlunda (F_{1, 3} = 11,5, p < 0,0001). Specifikt var gäspning smitta starkare i OC råttor än: VC råttor (råttor i burar med en icke-perforerad, klar avdelare; t =-3,8, p < 0,001), VOC-råttor (råttor i burar med en perforerad, klar avdelare; t =-5,74, p < 0,0001) och nvoc-råttor (råttor i burar med en icke-perforerad, ogenomskinlig avdelare; t =-2,64, p < 0,01). I samtliga fall var frihets graderna 695, eftersom analysen tog hänsyn inte bara till de fyra test situationerna, utan även till de tio tidsfönstren. Eftersom dessa villkor genererade autokorrelerade mätningar, en autokorrelation term lades till (Arma, autoregressiv glidande medelvärde) till den statistiska modellen. De övergripande trenderna under de 10 tidsfönstren skilde sig också statistiskt från en 0 lutning (F_{1, 1} = 11,99, p < 0,0001). Figur 3 visar samma analys som i figur 2, tillämpad på kända hanråttor. I detta fall, ingen av de fyra test situationer stimuleras gäspning smitta eftersom deras CI överlappade med slumpmässigt genererade CI-bandet. Det fanns inga skillnader mellan de fyra test situationerna (F_{1, 3} = p = 0,14). även om, den totala ökningen av gäspning smitta under 10 tidsfönster skiljde sig från en 0 lutning (F_{1, 1} = 9, p < 0,01).

Den roll som lukt i det sociala livet av däggdjur kan vara anledningen till att endast oc råttor visade gäspning smitta och gäspade oftare än VC råttor¹⁸. Visuella LED trådar kanske inte har underlättat gäspningar, eftersom Albino råttor inte ser, liksom icke-Albino råttor. Emellertid, VC råttor gäspade dubbelt så mycket som gruppen av råttor individuellt placerade i en observations bur bredvid en tom bur¹⁸. Detta konstaterande stöder slutgiltigt den sociala karaktären av gäspningar och föreslår att gäspning smitta i råttor är beroende av lukt signaler. Emellertid, den senare stöder endast graden av förtrogenhet mellan par råttor som deltar i gäspning smitta, och auditiva LED trådar är den troliga kanalen genom vilken gäspning smitta inträffar¹⁸.

Sammantaget är dessa oväntade resultat enligt förutsägelse att bekanta snarare än okända råttor kommer att Visa smittsam gäspningar. Även om de presenterade resultaten inte använder en positiv kontroll (vi har inga data där smittsam gäspningar observeras i nära besläktade individer), man tror att denna metod är opartisk för smittsam gäspningar i okända råttor. Flera element stöder ett sådant påstående. Första, bekanta och obekanta råttor skilde sig inte i de genomsnittliga frekvenserna av gäspningar¹⁸; Således verkade skillnaderna i gäspning smitta här inte bero på hur ofta de gäspa. För det andra är det faktum att samma antal gäspar per råtta slumpmässigt tilldelades observations perioden och att detta inte gav upphov till gäspning i någon grupp gör konstaterandet av smittsam gäspningar i obekanta råttor mer robust. Slutligen tillämpades en korrelationsanalys (för att upptäcka samtida matchning av beteende) tidigare¹⁸ till samma data uppsättning som användes här, och resultatet sammanföll med vad som hittades. Därför är denna metod känslig nog att upptäcka och mäta förändringar i smittsam gäspningar.

Alternativt kan det ifrågasättas om det som hittades här är smittsam gäspningar. Ett sådant problem är inte exklusivt för denna studie. Det finns två perspektiv som smittar gäspningar och dess kausalitet har väckt oro. För det första verkar empati inte vara den enda faktorn bakom smittsam gäspning¹⁸, som arter som inte förväntas Visa empati och/eller mentala tillstånd erkännande färdigheter såsom får och råttor kan fortfarande Visa smittsam gäspningar. För det andra finns det en växande oro för att det som kallas smittsam gäspning kanske inte är som sådant. Under många decennier (Thorpe, 1956; nämnt tidigare¹⁰) har smittsamma, stereotypa beteende mönster och smittsam gäspningar i synnerhet ansetts vara ett uttryck för socialt underlättande. På senare tid, Kapitány och Nielsen²⁵ föreslog genom användning av simulerade data att vad som är en Perceptuell mönster-erkännande fel kan vara felaktigt kallas smittsam gäspningar. Därför kan problemet inte ligga i hur smittsam gäspningar mäts utan snarare i hur den definieras.

Sammanfattnings vis är den metod som föreslås här användbar för att upptäcka gäspning smitta. Dessutom är det bra att kasta vissa sensoriska signaler, vilket minskar antalet sensoriska signaler till endast en eller två. Ytterligare experiment för att testa specifika förutsägelser är nödvändiga för att särskilja effekterna av en känsla från de andra.

Figur 1 : Schematisk av observations uppsättningen för att mäta smittsam gäspning. Fyra individuella burar arrangerades parvis på vardera sidan av det inverterade T-formade bordet. I varje par var burarna mot varandra med akryl avdelare däremellan. Den specifika test situationen avgör om avdelaren mellan burarna har hål och om den är klar eller ogenomskinlig. Video kamerorna var strategiskt placerade för att spela in någon förekomst av gäspningar beteende. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Gäspning spridnings kurvor för nio par obekanta manliga råttor som exponerats för (a) lukt signaler, (B) visuella LED trådar, (C) lukt och visuella LED trådar, och (D) varken visuella eller lukt signaler. Varje cirkel representerar den genomsnittliga skillnaden i gäspning ränta med 95% KONFIDENS intervall (CI) från en råtta som gäspade i samma minut eller i minut (tidsfönster) före gäspning av andra råtta och när det inte gäspa. Gäspning Rate värden ovanför den streckade linjen indikerar gäspning smitta, medan värden under den streckade linjen indikerar icke-gäspning smitta. Den heldragna linjen som förbinder punkterna vid varje tidsfönster används för att ange den genomsnittliga skillnaden i gäspningshastigher vid varje tidsfönster när antalet gäspar av varje råtta slumpmässigt tilldelades 60 min observations period. Det mörkgråa bandet indikerar en 95% CI som erhålls genom att kombinera den slumpmässiga data uppsättningen från de fyra test situationerna vid varje tidsfönster (en kontinuerlig nyans används för att under lätta tolkningen av figuren). Ett par råttor som exponerats för lukt signaler togs bort från analysen eftersom ingen av råttorna gäspade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Yawn spridnings kurvor för nio par bekanta hanråttor som exponerats för (a) lukt signaler, (B) visuella LED trådar, (C) lukt och visuella LED trådar, och (D) varken visuella eller lukt signaler. Varje cirkel representerar den genomsnittliga skillnaden i gäspning ränta med 95% KONFIDENS intervall (CI) från en råtta som gäspade i samma minut eller i minut (tidsfönster) före gäspning av andra råtta och när det inte gäspa. Gäspning Rate värden ovanför den streckade linjen indikerar gäspning smitta, medan värden under den streckade linjen indikerar icke-gäspning smitta. Den heldragna linjen visar den genomsnittliga skillnaden i gäspning priser vid varje tidsfönster när antalet gäspar av varje råtta var slumpmässigt fördelas till 60 min observations perioden. Det mörkgråa bandet indikerar en 95% CI som erhålls genom att kombinera slumpmässig data uppsättning från de fyra test situationerna vid varje tidsfönster. Ett par råttor som exponerats för visuella signaler togs bort från analysen eftersom en av råttorna inte gäspa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det finns kritiska steg i den metod som bör beaktas för att få lyckade resultat. Bekanta råttor måste dela hem burar i minst 1,5 månader efter avvänjning och innan du kör experimenten. Men obekanta råttor måste leva i separata hem burar. I båda fallen måste par råttor komma från olika kullar men vara så lika i ålder som möjligt. När det gäller observations burar, bör deras hål matcha dem i avdelare, eftersom detta är det enda sättet att garantera lukt kontakt mellan råttorna. Avdelarna, å andra sidan, bör vara tillräckligt tydliga för att säkerställa visuell kontakt eller ogenomskinlig nog för att säkerställa ingen visuell kontakt. Träskiljevägg mellan ett par råttor och den andra måste vara tillräckligt för att förhindra råttorna på ena sidan från att se dem på andra sidan. En annan viktig aspekt är den lämpliga utformningen av experimentet. Närhelst det finns en misstanke om att en process kan vara vinklad, bör ett slumpmässigt förfarande genomföras³⁰.

Metoden bör inte utgöra allvarliga problem för användarna. Att göra hålen i glaset var det största tekniska problemet, och på grund av detta användes akryl istället. Glas får dock användas för att tillverka hela observations burar, förutsatt att professionell rådgivning erhålls. Det bör säkerställas att kanterna på hålen är inlämnade för att undvika glas flisor som kan skada råttorna. Det rekommenderas dock inte att modifiera huvud metoden (t. ex. att göra hålen större). Dessutom, användning av en kombinerad grupp av män och kvinnor kan göra det svårt att upptäcka gädd smitta.

De avdelare som används här kan vara otillräcklig för att förhindra råttorna från att använda auditiva LED trådar, eftersom råttor kan producera och uppfatta ljud vid frekvenser där materialen i observations burar och avdelare sannolikt inte blockera. Men denna situation i sig gör det möjligt att dra satsen att auditiv Cues orsakat gäspning smitta¹⁸ och att lukt signaler endast underlättade erkännandet av partnerns grad av förtrogenhet. Den metod som föreslås här ger därför fortfarande rimliga belägg för att identifiera de sinnen som är inblandade i smittsamma gäspningar och deras intensitet.

Tidigare metoder har utformats för att studera smittsam gäspningar i laboratorie miljöer främst genom att presentera videor till de experimentella individerna^12,13, men dessa var tvivelaktiga metoder i termer av biologisk giltighet. Den metod som presenteras här löser denna oro genom att använda socialt samverkande djur under förhållanden som mer liknar vad som sker i den verkliga världen. Dessutom är det möjligt att samtidigt undersöka deltagandet av flera sensoriska metoder i en enda experimentell uppsättning. Det är erkänt att denna metod inte absolut diskriminerar mellan effekterna av auditiva signaler och andra sensoriska signaler. Men en väl utformad ytterligare experiment kan tillåta forskare att härleda den mest sannolika sensoriska modalitet inblandade¹⁸. En möjlig noninvasiv lösning är användningen av vitt brus för att maskera ljud och eliminera auditiva signaler. På samma sätt kan forskarna utsätta naiva råttor till sängkläder från OC råttor för att avgöra vilken roll lukt sinnet, vilket är ett bevisat förfarande i social underlättande studier³².

Användningen av denna metod kan utvidgas till att studera gäspning smitta i andra arter. Till exempel kan denna uppsättning användas efter enkla modifieringar med djur som möss och hamstrar för att jämföra gäspning spridnings kurvor. Jämförelser mellan olika arter kan avslöja oväntade mönster. Den grundläggande experimentella planen kan arbeta med större djur som marsvin, katter och kaniner. Likaså kan metoden användas för att studera andra potentiellt smittsamma beteenden såsom grooming och repor. Den R-baserade program kan minska den tid som används för att beräkna gäspning smitta för flera tidsfönster och kan användas för att mäta gäspa smitta i andra ryggradsdjur, förutsatt att användaren tidigare har samlat relevanta uppgifter.

Sammanfattnings vis, de främsta fördelarna med denna metod är att leda till förvärv av gäspning smittspridning kurvor och medhjälp i diskriminering mellan de relativa rollerna av sensoriska metoder inblandade. Förvärvet av gäspning spridnings kurvor är, såvitt vi vet, en ny metod som kan vara till nytta för att mäta styrkan i en smitta och observera hur denna intensitet varierar mellan arter. Därför kan metoden också användas med vissa modifieringar i andra djur arter såsom får¹⁶, vargar¹⁵, hundar³³, ormar³⁴, och fisk⁵. I alla dessa arter utom ormar har gäspningar tidigare dokumenterats. I själva verket, en metod som liknar den som presenteras här har använts framgångs rikt i undulater²⁷. Denna metod kan också användas för att studera andra typer av beteenden som är smittsamma. Till exempel, beteenden som emotionell reaktivitet, grooming, och repor i gnagare kan vara smittsam. I själva verket visade den metod som föreslås här smittsam känslomässig reaktivitet hos bekanta råttor¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.