Summary
Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.
Abstract
Organoids afgeleid van het verteerd weefsel zijn multicellulaire driedimensionale (3D) constructies die beter recapituleren in vivo omstandigheden dan cel monolayers. Hoewel ze niet volledig kunnen modelleren in vivo complexiteit, behouden ze een aantal functionaliteit van het oorspronkelijke orgel. In kanker modellen, organoids worden vaak gebruikt om tumor cel invasie studie. Dit protocol beoogt te ontwikkelen en te karakteriseren organoids van de normale en bestraalde muis borstklier weefsel om de straling reactie in normale weefsels te evalueren. Deze organoids kunnen op toekomstige in vitro kanker studies worden toegepast om de interactie van de tumor cel met bestraalde organoids te evalueren. De borstklieren werden ontleed, bestraald tot 20 GY en verteerd in een Collagenase VIII oplossing. De epitheel organoids werden gescheiden via centrifugaal differentiatie, en 3D organoids werden ontwikkeld in 96-goed laag-adhesie microplaten. Organoids drukte de kenmerkende epitheel teller cytokeratine 14 uit. Macrofagen interactie met de organoids werd waargenomen in co-cultuur experimenten. Dit model kan nuttig zijn voor het bestuderen van tumor-stromale interacties, infiltratie van immune cellen, en de polarisatie van de macrofagen binnen een bestraald micro-milieu.
Introduction
Ongeveer 60% van de drievoudige negatieve borstkanker (TNBC) patiënten kiezen voor borst-conserverende therapie (BCT) als een vorm van behandeling1. In deze behandeling modaliteit, de tumor die een deel van het borstweefsel wordt verwijderd, en de omliggende normale weefsel wordt blootgesteld aan ioniserende straling om eventuele resterende tumorcellen te doden. De behandeling vermindert herhaling in veel van de bevolking van borstkanker; echter, ongeveer 13,5% van de behandelde patiënten met TNBC ervaring locoregionale herhalingen2. Daarom, het bestuderen van hoe straling kan aanwerven circulerende tumorcellen (ctcs) zal leiden tot belangrijke inzichten in de lokale recidief3,4.
Het vorige werk heeft aangetoond dat de straling van het normale weefsel rekrutering van diverse cel types5verhoogt. In pre-klinische modellen van TNBC, bestraling van normaal weefsel toegenomen macrofagen en vervolgens tumor cel rekrutering tot normale weefsels5. De immune status beïnvloedde de rekrutering van de tumor cel aan bestraalde plaatsen, met de migratie van de tumor cel waargenomen in immuungecompromitteerde onderwerpen. Recapitulerend deze interacties met behulp van organoids afgeleid van de borstklieren zal de observatie van de cel migratie en cel-stromale interacties in real-time met microscopie en live cel beeldvorming om de rol van straling schade te bepalen in het veranderen tumor cel gedrag.
Muis borstklieren organoids hebben geholpen bij het ophelderen van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de borstklier. Een borst organite is een multicellulaire, driedimensionale constructie van geïsoleerde borst epitheel dat groter is dan 50 μm6,7,8,9,10. Met behulp van primaire epitheel organoids, Simian et al. geëvalueerd noodzakelijke factoren voor vertakking in de borstklier7. Shamir et al. ontdekte dat de verspreiding kan plaatsvinden zonder een epitheel om mesenchymale overgang, het verstrekken van inzicht in de gemetastaseerde Cascade8. Methoden voor het genereren en karakteriseren organoids van de borstklier weefsel zijn goed ingeburgerd6,11,12,13. Nochtans, aan onze kennis, zijn de methodes om bestraalde organoids van borstklieren te kweken niet gemeld. Een protocol voor het kweken van en het kenmerken van bestraalde organoids zou een kritieke stap in Recapitulerend straling-veroorzaakte immune en de rekrutering van de tumor cel zijn.
In deze paper, rapporteren we een methode voor het kweken en karakteriseren bestraalde borstklier epitheel organoids in lage adhesie microplates bekleed met een hydrofiele polymeer dat de vorming van sferoïden ondersteunt. Deze organoids werden samen met macrofagen gekweekt om de kinetiek van infiltratie van de immune cel te onderzoeken. Dit werk kan worden uitgebreid tot co-kweken organoids met vetcellen te recapituleren borstklieren kenmerken, borstkanker cellen te visualiseren tumor cel aanwerving, en CD8 + T cellen te bestuderen tumor-immune cel interacties. Eerder vastgestelde protocollen kunnen worden gebruikt om bestraalde organoids te evalueren. Eerdere modellen co-kweken borstklieren organoids en immuun cellen hebben licht werpen op de mechanismen van metastase en verspreiding. Denardo et al. vond dat CD4 + T Cell regulering van tumorgeassocieerde macrofagen verbeterde een gemetastaseerde fenotype van de borst adenocarcinomen14. Er zijn ook cocultuur modellen gebruikt om mechanismen van biologische ontwikkeling te verhelderen. Plaks et al. verduidelijkte de rol van CD4 + T cellen als down-regulatoren van de borst organogenese15. Echter, onze groep is de eerste om een procedure van het visualiseren van hoe normaal weefsel straling invloeden immuun cel gedrag vast te stellen. Omdat normaal weefsel bestraling is aangetoond dat tumor cel rekrutering te verbeteren5, kan dit Protocol verder worden ontwikkeld om te analyseren hoe tumorcellen gedrag wordt gewijzigd door bestraling van normale weefsels en cellen, wat leidt tot een beter begrip van kanker recidief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de Vanderbilt University Institutional Animal Care en use Comite.
1. voorbereiding van muizen en cel aanwinst (aangepast van Nguyen-Ngoc et al.11)
- Offer athymic nu/nu muizen (8-10 weken oud) met behulp van CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig de huid met behulp van 70% ethanol.
- Resekte abdominale en Lies borstklieren van muizen met behulp van pre-gesteriliseerde schaar en Tang. Verwijder de lymfeklieren voordat resectie. Spoel in steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (Figuur 1a).
- Plaats het in 15 mL tubes met 10 mL van Dulbecco gemodificeerde Eagle media/nutriënten mengsel F12 (DMEM/F12) voor transport. Monsters kunnen worden gehouden 's nachts bij 4 ° c of onmiddellijk verwerkt. Blijf op het ijs.
- Bestraal monsters van 20 GY met behulp van een cesium bron (Figuur 1b).
- 45 min na bestraling, plaats de borstklieren in een 35 mm steriele cel plaat en gehakt met Scalpels (figuur 1C, D). Gehakt met ongeveer 40 slagen tot het weefsel ontspant en de stukken worden verkregen die niet groter zijn dan ongeveer 1 mm2 in gebied.
- Transfer naar de Collagenase oplossing in een 50 mL centrifuge Tube. Collagenase oplossing bestaat uit 2 mg/mL Collagenase (Zie tabel van materialen), 2 mg/ml trypsine, 5% v/v foetale boviene serum (FBS), 5 μg/ml insuline, en 50 μg/ml GENTAMICINE in DMEM/F12 media. Gebruik 10 mL Collagenase oplossing per muis.
- Plaats in een waterbad bij 37 °C, elke 10 min vortexen voor 30-60 min. de spijsvertering is compleet wanneer de Collagenase oplossing bewolkt is (Figuur 1e, F).
- Spin vaststelling van de verteerde oplossing op 450 x g voor 10 min bij kamertemperatuur (RT). Drie lagen zullen worden waargenomen. De bovendrijvende is samengesteld uit vet, de middelste laag is een waterige oplossing, en de bodem is een pellet. De pellet zal verschijnen rood als het gaat om een mengsel van Epitheelcellen, individuele stromale cellen, en rode bloedcellen (figuur 1g).
- Precoat alle pipetten, pipet tips, en centrifuge buizen met boviene serum albumine (BSA) oplossing voorafgaand aan contact. BSA oplossing bestaat uit 2,5 w/v% BSA in Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Voor pre-coating, voeg dan gewoon verwijderen BSA oplossing aan de binnenkant van de pipet Tip en buizen. BSA oplossing kan worden hergebruikt, hoewel het moet worden steriel gefilterd voor elk experiment.
- Voor extra herstel, de overdracht van de bovendrijvende naar een verse BSA gecoat 15 mL buis. Pipetteer krachtig op en neer om de vette laag te verspreiden. Centrifugeer bij 450 x g voor 10 min bij RT. aspireren de bovendrijvende, waardoor een kleine hoeveelheid van de media in de buis om te voorkomen dat opzuigen de cel pellet.
- Aspireren de waterige laag uit de buis met de originele pellet.
- Voeg 10 mL DMEM/F12 aan de buis met de originele pellet en de overdracht naar de tweede buis. Pipetteer krachtig om de twee pellets te combineren en op te schorten.
- Centrifugeer bij 450 x g voor 10 min bij RT. aspireren de bovendrijvende en voeg 4 ml DMEM/F12 toe aan de buis.
- Voeg 40 l van deoxyribonuclease (DNase) toe aan de vering en schud voorzichtig met de hand voor 2-5 min bij RT. DNase oplossing bestaat uit 4 U/mL DNase in DMEM/F12.
- Voeg 6 mL DMEM/F12 en pipet grondig toe. Centrifugeer de buis bij 450 x g voor 10 min bij RT.
- Aspireren bovendrijvende aan de 0,5 mL merk. Opnieuw op te schorten in 10 mL DMEM/F12 en pipet grondig.
- Pulse tot 450 x g en stop 4 s na het bereiken van die snelheid.
- Herhaal stappen 1.16-1.17 drie keer om organoids te zuiveren via centrifugaal differentiatie. De pellet moet nu een gebroken witte kleur, bestaande uit slechts epitheel organoids (figuur 1h).
Opmerking: Organoids kan ook worden gefilterd met steriele mesh 40 μm filters. Na stap 1,16, Pipetteer media die organoids door een filter in een centrifugebuis bevatten, en dan met 5 tot 10 mL van DMEM/F12 media spoelen. Flip het filter over een nieuwe 50 mL centrifuge Tube. Passeren 10 mL van DMEM/F12 media door, gaan de tegenovergestelde manier om af te spoelen elke retentate. De retentate moet bestaan uit organoids, en het filtraat moet bestaan voornamelijk uit stromale cellen, die kunnen worden weggegooid of bewaard indien gewenst.
2. bepaling van dichtheid en plating organoids
- Opnieuw op te schorten pellet in 10 mL van DMEM/F12. Pipet grondig om een homogene oplossing te creëren.
- Transfer 50 µ L naar een 30 mm Petri schaaltje, en Bekijk onder een fasecontrast Microscoop op 20x. Tel het aantal organoids met een Tally teller.
Nota: hier zijn de pipet uiteinden constant gebruikt met een minimale diameter van 457 μm, die 5-10 keer de diameter van de organoids is die worden gezaaid. Voor het overzetten van volumes van 2 mL of groter (bijv. stappen 1,16 en 2,1), gebruik van serologische pipetten met een diameter van meer dan 1.500 μm. - Bereken de organite dichtheid met behulp van de volgende vergelijking:
De gewenste dichtheid is 1.000 organoids/mL om verdere verdunning te vereenvoudigen. Als de dichtheid te laag is, centrifugeer bij 450 x g voor 5 min en aspireren media. Voeg media toe die nodig zijn om 1.000 organoids/mL te bereiken, en Pipetteer grondig om een homogeen mengsel te creëren.- Om te groeien organoids in een eiwit matrix, zaad organoids bij een concentratie van 1 organite/L in collageen type 1 verdund tot 87% of in de kelder membraan geëxtraheerd uit Engelbreth-Holm-zwerm muis Sarcoom. Tijdens het werken met monsters, houden op ijs.
- Om organoids te bevriezen, breng het gewenste volume naar een aparte centrifugebuis. Spin neer bij 450 x g voor 5 min. aspireren media, en voeg dan het zelfde volume van 90% FBS/10% DMSO toe. Hersuspendeer de organoids, en vervolgens de hoeveelheid in cryobuizen. Transfer naar-80 ˚ C, en vervolgens naar vloeibare stikstof binnen een week.
- Om te ontdooien, warm in een 37 ˚ C water bad voor een min. centrifuge op 450 x g voor 5 min, en dan aspireren bevriezing media. Spoel met steriele DPBS en centrifugeer vervolgens opnieuw. Aspireren DPBS en voeg organite media.
- Pipetteer 50 µ L (50 organoids) in elk goed van de lage hechtings plaat (figuur 1i).
- Voeg 150 µ L van organite media toe om het totale werkende volume aan 200 µ L. Organite media te brengen bestaat uit 1% penicilline-streptomycine en 1% insuline-transferrin-selenium (zijn) in DMEM/F12 media.
- Elke 2 dagen vervangen media zorgvuldig.
Opmerking: lage hechtings platen zijn geen weefselcultuur behandeld; Daarom kunnen de cellen gemakkelijk worden losgemaakt. Aspireren Media langzaam door het kantelen van de plaat en het invoegen van de pipet tip aan de rand van elk goed. Laat een kleine hoeveelheid van de media in de bodem van de put. Voeg langzaam nieuwe media toe om te voorkomen dat onnodige shear krachten worden toegepast op organoids.
3. co-kweken met macrofagen
- Onderhoud GFP of dTomato-gelabelde RAUWe 264,7 macrofagen in DMEM media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Zaad 1 x 104,5x 104, of 1 x 105 cellen/ml in organite media.
- Gebruik Live Cell phase contrast en TL-beeldvorming om macrofagen infiltratie in de tijd te controleren.
4. immunofluorescentie kleuring van organoids
Nota: Organoids kan in lage adhesie putten worden bevlekt of kan naar kamer dia's worden overgebracht. Om de overdracht, voorzichtig pipet omhoog en omlaag tot organoids hebben losgemaakt van de platen. Transfer naar kamer dia's en incubeer voor 4-8 h zodat organoids zich aan het plaatoppervlak kunnen houden.
- Verwijder organite medium uit de putten door zorgvuldig opzuigen. Fix monsters met 10% neutraal gebufferd formaline voor 15 min bij RT.
- Was 3x 5 min in 1x PBS. Indien gewenst kunnen vaste monsters worden opgeslagen bij 4 °C gedurende een week voor verdere kleuring.
- Permeabilize met 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleen glycol voor 5 min.
Opmerking: om vlek voor F-actine, incubeer monsters met phalloidin verdund 1:1000 en 1,67 nM bisbenzimide kern kleurstof in 1% PBS/BSA voor 1 h bij RT. Ga vervolgens verder met stap 4,8. - Bermeabilize met 0,5 PBS. De steekproeven kunnen bij 4opy beelden en immunefluorescentie beelden worden opgeslagen. mechanismen die bijdragen aan CTC rlock met 5% normaal geiten serum in 0,1% PBS/polyethyleenglycol sorbitanester monolaurate (PBST) voor 1 h bij RT. was 3x 5 min met PBS.
- Incubeer met anti-Cytokeratine 14 verdund 1:1000, E-cadherine verdund 1:200, of strakke verbinding proteïne één verdund 1:100 in 1% NGS in PBST voor 1 h bij RT. was 3x 5 min in PBST.
- Incubeer met geit anti-konijn secundair verdund 1:200 met 1% NGS/PBST voor 1 h bij RT. dek af met folie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Was 3x 5 min in PBS. Gebruik de nucleaire kleurstof (Zie tabel van materialen) om kernen vlek.
- Was 3x 5 min in PBS. Bij gebruik van kamer glijbaan, monteren met een dekglaasje. Store verpakt in folie bij 4 °C voor maximaal 2 weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestraalde epitheel borsten organoids werden met succes verkregen van de muis borstklieren, verwerkt, en gekweekt op lage-adhesie platen (Figuur 1). Organite opbrengst werd getest door zaaien in verschillende groei omgevingen (Figuur 2a-G). Zaaien cellen direct op weefselcultuur behandeld 10 cm cel platen leverde een overgroei van fibroblast cellen. Fibroblasten werden geïdentificeerd onder fasecontrast microscopie in of in de buurt van hetzelfde vlak van de focus als organoids, en ze snel groeide uit van plated organoids binnen een paar dagen. Een uitgroei van fibroblasten werd ook waargenomen toen organoids in kelder membraan en collageen eiwit matrices (figuur 2e, F) werden gezaaid.
Een verscheidenheid aan voorwaarden werden getest in het optimaliseren van bestraalde organite groei (figuur 2H). Collagenase types I en VIII van Clostridium histolyticum werden gebruikt als enzym in de organite spijsvertering stap12,16,17. Organite opbrengsten waren significant hoger na de spijsvertering met collagenase VIII. Dit kan te wijten zijn aan de zuiveringsprocessen die worden gebruikt bij de productie van het enzym: Collagenase type I is gedeeltelijk gezuiverd en kan onnodige schade aan membraaneiwitten en receptoren veroorzaken, wat leidt tot slechte organite vorming, cel lysis, of over-vertering16 , 17 , 18. geen significante verschillen in opbrengst tussen bestraalde en controle organoids werden waargenomen.
Bestraalde organoids zou kunnen worden gekweekt in lage adhesie platen (Figuur 3a-C) of binnen de kelder membraan (figuur 3D-G), maar de meest snelle groei vond plaats in lage adhesie platen (figuur 3H). Organoids gerecapituleerd borstklier kenmerken. Witte pijlpunten geven constructies morfologisch vergelijkbaar met leidingen en lobben19, 20,21 (figuur 3c), die kritisch zijn voor de productie en het vervoer van melk in de borstklier21. Echter, verdere karakterisering is nodig om deze observatie te bevestigen. Groeitrends wezen erop dat niet-bestraalde organoids groeide sneller dan bestraalde organoids (figuur 3H), waarschijnlijk te wijten aan cel groeiarrestatie als gevolg van mechanismen van DNA-schade reparatie; echter, de trend was niet statistisch significant22. Het occasionele klonteren van lage adhesie organoids werd waargenomen, en organoids kon tot twee weken worden gekweekt alvorens te scheiden.
Organoids uitgedrukt epitheel kenmerken, die werden geëvalueerd door immunofluorescentie kleuring van cytokeratine 14 (K14), e-cadherine (e-CAD), en strakke verbinding proteïne 1 (zo-1)23,24,25 ( Figuur 4). Bestraalde organoids uitgedrukt epitheel markeringen. K14, een teller van myoepithelium23, werd uitgedrukt sterk op de oppervlakte van bestraalde Organoids (figuur 4a). Bovendien, E-CAD en ZO-1 werden uitgedrukt binnen cellulaire verbindingen van organoids (figuur 4b, C). Deze eiwitten zijn essentieel voor een goede cel adhesie24. Na bestraling bleven organoids hun epitheel karakteristieken behouden.
Fluorescerende kleuring van organoids kan worden gevisualiseerd binnen lage Kleef platen met behulp van fluorescentie microscopie (figuur 5a-D); de duidelijkste visualisatie is echter verkregen via confocale microscopie (figuur 5e-F). Gecorrigeerde totale fluorescentie intensiteit werd berekend door het aftrekken van de achtergrond en normaliseren door organite gebied (figuur 5g). Het groeien organoids in de 96-goed lage adhesie platen ook vereenvoudigde co-cultuur experimenten. Wanneer gezaaid bij concentraties typisch in de borstklier, macrofagen co-gelokaliseerd met controle en bestraald organoids (Figuur 6)24,26.
Figuur 1. Methode workflow. (A) deborstklieren werden ontleed van muizen. De buik en Lies borstklieren werden gebruikt. (B) de borstklieren werden bestraald in 50 ml centrifuge tubes die DMEM/F12 media bevatten. (C) de borstklieren werden overgebracht naar steriele zes-goed platen en gesneden met chirurgische scalpels tot gehakt (D). Ede melkklieren werden overgebracht naar 50 ml centrifuge buizen met 5 ml steriele DMEM/F12-media per klier en verteerd in een Collagenase VIII-oplossing (F). (G) na te zijn overgebracht naar een 15 ml buis, centrifugaal differentiatie werd gebruikt om stromale cellen te verwijderen, enkele cellen, en rode bloedcellen, waargenomen in een rode pellet (witte pijl-hoofd) totdat alleen witte epitheel organoids werden verkregen (H ). (I). 50 organoids werden geplateerd in 200 µ l van media in 96-goed lage adhesie platen en afgebeeld met behulp van fasecontrast microscopie schaal bar vertegenwoordigt 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Organite plating in 3D-eiwit matrices en op weefselcultuur behandeld plastic. Organoids gezaaid in collageen (a) en kelder membraan (B), afgebeeld na 84 uur van de groei. Uitgroei van fibroblasten opgetreden in matrix plated organoids (C, D). Fasecontrast beelden van organoids gesorteerd via filtratie werden verkregen 192 uur na het zaaien. Geen grote verschillen tussen het filtraat (E) en Retentate (F) werden waargenomen, met beide resulterend in Confluent fibroblastgroei. Cellen in E en F werden gezaaid op weefselcultuur behandeld plastic. Na trypsinizing voor 5 min bij RT, werden fibroblasten verwijderd via aspiratie; echter, de resterende epitheelcellen vormden een monolayer cultuur in plaats van drie-dimensionale organoids (G). Schaal staven voor A-G vertegenwoordigen 100 µm.hverschillende Collagenase types (I (CI) en VIII (CVIII)) en cel verwerkingsmethoden (filtratie en centrifugaal differentiatie (cent diff)) werden getest, en organite opbrengst per borstklier was gekwantificeerd (n = 2 klieren voor CI, filter; 2 klieren voor CVIII, filter; 4 klieren voor CI, cent diff, en 12 klieren voor CVIII, cent diff). De statistische significantie werd bepaald met behulp van een twee-tailed, ongepaarde t-toets, * * * p < 0.0001. Foutbalken geven standaardfout weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Representatieve Organite groei. De hetcontrast beelden van de fase van bestraalde organite groei in lage adhesie platen verkregen 20 (a), 44 (B), en 106 (C) uren na het zaaien. Witte pijlpunten geven structuren die soortgelijke morfologie hebben om leidingen en lobben. Fasecontrast beelden van bestraalde organite groei in de kelder membraan verkregen 42 (D), 66 (E), 60 (F), en 114 (G) uur na het zaaien. Schaal balken vertegenwoordigen 50 µm. H. De oppervlakte metingen werden verkregen in verschillende groeiomstandigheden: organoids onmiddellijk gezaaid na de spijsvertering en sorteren (bestraald (●), controle (▪)), en organoids gezaaid in de kelder membraan (bestraald (○), controle (□)) (n = 3 klieren elk). Gebied berekeningen werden gemaakt met behulp van ImageJ software. Foutbalken geven standaardfout weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Epitheel marker expressie op bestraalde Organoids. Cytokeratine 14 (K14, groen), een marker voor de basale laag van plaveiselcel en niet-plaveiselcel epitheel, werd uitgedrukt op bestraalde organoids (a). E-cadherine (E-CAD), een proteïne essentieel voor adhesie, werd uitgedrukt binnen de verbindingen tussen cellen in bestraalde organoids (B). Het strakke verbindings eiwit één (ZO-1) werd ook uitgedrukt binnen de verbindingen van de cel van bestraalde organoids (C). Beelden werden verkregen in kamer dia's via confocale microscopie. Een nucleïnezuur vlek werd gebruikt om te visualiseren kernen (blauw). Alle organoids werden vastgesteld en afgebeeld na een week van de groei. Schaal staven zijn 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. F-actine expressie in organoids. F-actine (rood), een microfilament in Epitheelcellen, werd uitgedrukt met een lagere intensiteit in niet-bestraalde organoids (a, C, E) dan in bestraalde (B, D, F) organoids. Een nucleïnezuur vlek werd gebruikt om te visualiseren kernen (blauw). De beelden werden genomen op lage adhesie 96-goed platen (a, B) en 16-goed kamer dia's (C, D). Beelden werden ook genomen met behulp van confocale microscopie (E, F). Alle organoids werden vastgesteld en afgebeeld na een week van de groei. Schaal staven zijn 50 µm. G. Phalloidin fluorescentie gegevens van lage adhesie plaat beelden werden gekwantificeerd in ImageJ (n = 3 klieren). Foutbalken geven standaardfout aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Evalueren cel-cel interacties via macrofagen-organite co-cultuur. Macrofagen (rood) geïnfiltreerd controle (A) en bestraalde (B) organoids. Schaal staven vertegenwoordigen 50 μm. Gemiddeld percentage van macrofagen in het afbeeldingsveld (C) werd gemeld bij 24 uur van co-cultuur voor controle (geel) en bestraald (oranje) organoids (n = 3 klieren voor elk monster). Macrofagen werden gezaaid bij concentraties van 10.000 cellen/mL, 50.000 cellen/mL, en 100.000 cellen/mL, en hun infiltratie werd gevangen om de 30 minuten via Live Cell fluorescentie Imaging. Alle co-Culture experimenten begonnen 7 dagen na de eerste organite zaaien. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een twee-tailed, niet-gepaarde t-test, * p < 0.05, * * * p < 0.0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we een methode ontwikkeld voor reproduceerbare groei en karakterisering van bestraalde borst organoids (Figuur 1). Een stralingsdosis van 20 GY werd toegepast op de spiegel vorige in vivo modellen van de cel van de tumor rekrutering5. Bestraling van de borstklieren ex vivo voorafgaand aan organite vorming toegestaan voor isolatie van stralingsschade effecten zonder een overeenkomstige infiltratie van het immuunsysteem cellen. De ontwikkeling van een in vitro bestraald normaal weefsel model maakt real-time bekijken van cellulaire interacties die kunnen bijdragen tot straling geïnduceerde CTC aanwerving11,12.
Nauw na stappen 1.5-1.18 was kritiek voor het maximaliseren van organite opbrengst. Wij voegden ontdooide hoeveelheid geconcentreerde Collagenase aan de spijsverterings oplossing toe. Vanwege de zeer viskeuze aard van de geconcentreerde Collagenase hoeveelheid, kunnen er enkele variaties in hoeveelheid en dus in enzymatische activiteit, dus organite spijsvertering moet nauwlettend worden gevolgd om te voorkomen dat over-vertering. Het is ook belangrijk om organoids te verteren in een 50 mL buis, omdat dit zorgt voor een gelijkmatige oppervlakte voor de spijsvertering. Andere studies hebben gebruikt filtratie voor het zuiveren van organoids19,23; echter, we verkregen een veel hogere opbrengst zuiveren met centrifugaal differentiatie (figuur 2H). Pre-coating pipetten, pipet tips, en centrifuge buizen met de BSA oplossing is essentieel voor het maximaliseren van de opbrengst. Organoids merkbaar hechten aan ongecoat plastic wanneer de oplossing toepassing wordt verwaarloosd.
Grote zorg moet worden genomen om te voorkomen opzuigen organoids. Dit is een risico dat optreedt bij het zuiveren, veranderen van de media, en kleuring voor TL-markeringen. Het gebruiken van lage adhesie platen voor de groei staat voor gemakkelijke overdracht van organoids toe en verwijdert de behoefte aan organoids om in OCT voor verdere het bevlekken, een procedure worden gedeeld die voor kelder membraan ingebedde organoids11wordt vereist. Naast de voordelen van een superieure groei, zaaien bestraald organoids in lage adhesie platen vereist minder stappen en was minder technisch uitdagend dan kweken organoids in de kelder membraan of collageen. Nochtans, wanneer het bevlekken voor tellers, kan het nuttig zijn om organoids onder een microscoop te bekijken om ervoor te zorgen dat de toevallige aspiratie niet voorkomt.
Bovendien zijn er veel overwegingen die moeten worden verantwoord wanneer Imaging organoids. Binnen de kelder membraan embedded organoids, occasionele fibroblastgroei kan worden waargenomen (figuur 2c, D). Fibroblast uitgroei in 3D gekweekte organoids kan worden veroorzaakt door organoids het maken van contact met het weefselcultuur behandelde oppervlak als adhesie leidt tot upgereguleerde fibroblast groeifactor productie in de aanhangige cellen27. Interessant, is de morfologie van deze fibroblasten opvallend gelijkaardig aan pre-adipocyten aangezien beide cel types spichtige, langwerpige vormen28tentoonstellen. Bij nader onderzoek kunnen blootstelling aan insuline, dexamethason en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) cellen met een adipogenic afstamming opleveren, wat een verschuiving naar een meer sferische cellulaire vorm aanspoort die geassocieerd wordt met adipocyten28, 29. we verkregen duidelijke beelden met behulp van fasecontrast microscopie van vrij groeiende lage adhesie (Figuur 3a-C) en kelder membraan ingebed (figuur 3D-G) organoids. Tracking individuele organite groei in lage adhesie platen, echter, was moeilijk te wijten aan minimale focale hechtingen tussen de cellen en goed oppervlak, wat resulteert in organite beweging en af en toe aspiratie.
Eenmaal gekleurd voor oppervlakte-markers, de confocale microscopie gesmolten duidelijker marker lokalisatie (figuur 5e, F) dan Widefield microscopie (figuur 5a-D). Van fluorescentie kwantificatie, trends in phalloidin expressie suggereren dat bestraalde organoids uitgedrukt verhoogde F-actine ten opzichte van de controle (figuur 5g). Actine cytoskelet reorganisatie is waargenomen in dermale microvasculaire endothelial cellen bestraald op vergelijkbare doseringen30.
Voor uitgebreide Imaging sequenties, zoals time lapse co-cultuur met immuun cellen (Figuur 6), een live cel beeldvorming kamer met vochtigheid en co2 controle is vereist31. Live Cell beelden genomen om de 30 minuten bleek dat macrofagen co-gelokaliseerd met organoids na 24 uur (Figuur 6a, B), bij voorkeur migreren naar bestraalde organoids (figuur 6C). Macrofagen infiltratie in bestraald normaal weefsel is waargenomen in vivo, wordt toegeschreven aan chemokinen en cytokine gradiënten, en meestal voorafgaat CTC recruitment5. Toekomstige studies zullen klassiek en alternatief geactiveerde macrofagen interacties met organoids evalueren als gepolariseerde macrofagen dynamiek kan een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de reactie op straling32,33. Aanvullende analyses zullen het gevolg van serum honger en de groeieffecten van kweken organoids in complete media evalueren, aangezien deze variabelen significante effecten kunnen hebben op organite-immune cel interacties. Dit systeem kan verder worden aangepast voor co-cultuur met andere soorten cellen, met inbegrip van CD8 + T cellen, stromale cellen, adipocyten, en borstkanker cellen. Real-time observatie met technieken zoals Live Cell Imaging zal vergemakkelijken de opheldering van mogelijke mechanismen die bijdragen aan CTC rekrutering voor bestraald normaal weefsel, die aanzienlijke gevolgen kunnen hebben voor patiënten die lijden aan terugkerende TNBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Laura L. Bronsart voor het verstrekken van GFP en dTomato-gelabelde RAUWe 264,7 macrofagen. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H.
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
