Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

Эта работа представляет собой протокол для создания культуры клеточной подвески, полученной из чая(Camellia sinensis L.) листья, которые могут быть использованы для изучения метаболизма внешних соединений, которые могут быть рассмотрены всего растения, такие как инсектициды.

Abstract

Разработана платформа для изучения метаболизма инсектицидов с использованием тканей в пробирке чайного растения. Листья из стерильных чайных растений были индуцированы, чтобы сформировать свободные каллусы на Мурашиге и Skoog (MS) базальных носителей с растительными гормонами 2,4-dichlorophenoxyacetic кислоты (2,4-D, 1,0 мг L-1) и kinetin (KT, 0,1 мг L-1). Каллус формируется после 3 или 4 раундов субкультирования, каждый из которых длится 28 дней. Свободный каллуса (около 3 г) затем прививался в В5 жидких носителей, содержащих те же растительные гормоны и культивировался в дрожащий инкубатор (120 об/мин) в темноте при 25 и 1 градус цельсия. После субкультуры, 3х4, клеточная суспензия, полученная из листьев чая, была установлена в соотношении субкультуры в диапазоне от 1:1 до 1:2 (жидкость для матери подвески: свежая среда). Используя эту платформу, шесть инсектицидов (5 мкг мл мл-1 каждый тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, имидаботиз, диметоат и ометоят) были добавлены в культуру клеточной суспензии, полученной из чайного листа. Метаболизм инсектицидов отслеживался с помощью жидкой хроматографии и газовой хроматографии. Для проверки полезности культуры суспензии чайных клеток метаболиты тиаметоксана и диметоата, присутствующие в обработанных клеточных культурах и нетронутых растениях, были сравнены с помощью масс-спектрометрии. В обработанных культурах чайных клеток было обнаружено семь метаболитов тиаметоксана и два метаболита диметоата, в то время как в обработанных нетронутых растениях были обнаружены только два метаболита тиаметоксама и один диметоат. Использование клеточной суспензии упростило метаболический анализ по сравнению с использованием нетронутых чайных растений, особенно для сложной матрицы, такой как чай.

Introduction

Чай является одним из наиболее широко потребляемых безалкогольных напитков в мире1,2. Чай производится из листьев и почек древесных многолетних Camellia sinensis L. Чай растения выращиваются на обширных плантациях и восприимчивы к многочисленным насекомым-вредителям3,4. Органофосфор и неоникотиноидные инсектициды часто используются в качестве системных инсектицидов5 для защиты чайных растений от вредителей, таких как белокрылки, листовые бункеры, и некоторые виды лепидоптеран6,7. После применения эти инсектициды поглощаются или перемещаются в растение. Внутри растения эти системные инсектициды могут трансформироваться путем гидролизов, окисления или снижения реакций растительных ферментов. Эти продукты преобразования могут быть более полярными и менее токсичными, чем родительские соединения. Однако, для некоторых органофосфатов, биоактивность некоторых продуктов выше. Например, ацефат метаболизируется в более токсичные метамидофос8,9,и диметоат в ометоате10,11. Таким образом, метаболические исследования растений имеют важное значение для определения судьбы пестицида в пределах завода12.

Культуры тканей растений оказались полезной платформой для исследования метаболизма пестицидов, с выявленными метаболитами, аналогичными тем, которые содержатся в нетронутых растениях13,14,15. Использование культур тканей, особенно культур суспензии клеток, имеет ряд преимуществ. Во-первых, эксперименты могут проводиться без микроорганизмов, избегая тем самым вмешательства в трансформацию пестицидов или деградацию микробов. Во-вторых, культура тканей обеспечивает последовательные материалы для использования в любое время. В-третьих, метаболиты легче извлекать из культур тканей, чем из нетронутых растений, и ткани культур часто имеют меньше интершеринговых соединений и более низкой сложности соединений. Наконец, культуры тканей могут быть более легко использованы для сравнения серии метаболизма пестицидов в одном эксперименте16.

В этом исследовании была успешно установлена клеточная суспензия, полученная из листьев выращенного стерильным чайного растения. Культура подвески чайных клеток была затем использована для сравнения поведения рассеяния шести системных инсектицидов.

Этот подробный протокол предназначен для обеспечения некоторых указаний, так что исследователи могут установить платформу культуры тканей растений полезно для изучения метаболических судьба ксенобиотики в чае.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура чайного каллуса

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные листья были получены из витровых растительных линий, впервые разработанных в исследовательской группе17. Все процедуры до раздела 5 проводились в стерильном ламинарном капюшоне, за исключением культурного времени в инкубаторе.

  1. Отрегулируйте рН двух носителей (Мурашиге и Скуг «MS» базальная среда и Гамборг B5 жидкой среды) до 5,8 до автоклавирования (121 КС, 20 мин).
  2. Нарежьте вдоль средней вены стерильного листа ножницами, а затем разделите каждую половину на мелкие кусочки около 0,3 см х 0,3 см в чашке Петри.
  3. Поместите стерильные экспланты (мелкие кусочки листьев) на базальные носители MS, содержащие растительные гормоны 2,4-D (1,0 мг Л-1) и КТ (0,1 мг Л-1). Шесть эксламов могут быть помещены в колбу 300 мл, содержащую 100 мл базальных носителей MS.
  4. Культура выше листа explants при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию в темноте. После 28 дней, выберите первое поколение индуцированного каллуса и перенести на свежую колбу (субкультуру). Приобретайте рыхлый и рыхлый каллуса после субкультур ы 3х4.

2. Культура подвески клетки чая

  1. Разрежьте энергичные, рыхлые и рыхлые мозоли из твердой среды на мелкие кусочки (диапазон здесь 0,5-2 мм) с помощью стерильного хирургического лезвия в стерильных условиях.
  2. Вес около 3 г маленьких кусочков каллуса. Поместите каллус в колбу 150 мл, содержащую 20 мл жидких носителей B5, дополненных 2,4-D (1,0 мг L-1) и KT (0,1 мг L-1).
  3. Культура жидкой подвески клеток при постоянной температуре (25 и 1 кВ) в встряхивая инкубатор при 120 об/мин в темноте.
  4. После 7 до 10 дней культивирования, удалить культуры фляги и дайте им постоять в течение нескольких минут.
  5. Возьмите все супернатанта в качестве семенного материала для субкультуры в свежую среду (субкультуры соотношение подвесной материнской жидкости к свежей средней диапазоне между 1:1 и 1:2). Удалите осажданные, большие мозоли.
  6. Получите окончательную хорошо выращенную культуру подвески клеток после 3-4 циклов субкультуры по 28 дней каждый.

3. Трифенил тетразолий хлорид асссид жизнеспособности клеток

  1. Убейте образец живых клеток при 100 градусах По Цельсия в течение 10 минут в качестве контрольной ячейки до окрашивания жизнеспособности.
  2. Центрифуга все культуры подвески клеток в течение 8 мин при 6000 х г. Удалите супернатант перед приостановкой клеток в 2,5 мл фосфатно-буферного соленого (PBS) буфера (pH 7.3), и встряхните его в течение 1 мин вручную.
  3. Добавьте 2,5 мл раствора хлорида трифенил тетразолий (ТТК) и снова пожмите рукой.
  4. Инкубировать смесь в течение 1 ч в стоящем инкубаторе (30 градусов по Цельсию).

4. Обработка и отбор проб суспензии чайных клеток культур с инсектицидами

  1. Добавьте аликот в 400 л фильтростеризованного стокового раствора (500 мкг млл .1) четырех неоникотиноидов (тиаметоксам, ацетамиприд, имидаклоприд и имидаботиз) или два органофосфата (диметоат и ометоат) в клеточную суспензию, Соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цель состоит в том, чтобы сравнить ксенобиотповедения, используйте ту же мать партии клеточных суспензий для тестирования различных соединений.
  2. Культура образцы клеточных суспензий с инсектицидами при постоянной температуре (25 и 1 кС) и скорость встряхивания инкубатора (120 об/мин). Возьмите пробы (см. шаг 4.3 или 4.4) на 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 75 дней.
  3. Чтобы проверить образец, содержащий неоникотиноид, удалите 1 мл аликот однородной клеточной культуры, поместите его в пластиковую центрифугу мощностью 1,5 мл и центрифугу на 4000 х г в течение 2 мин.
    1. Передайте супернатанты через 0,22-мкм пор-размер фильтра мембраны перед анализом высокопроизводительной жидкой хроматографии-ультрафиолетового (HPLC-UV) и сверхвысокой производительности жидкой хроматографии-квадруполь время полета (UPLC-TOF) массы спектрометрия (Таблица материалов).
  4. Чтобы проверить образец, содержащий органофосфат, удалите 500-й аликот клеточной культуры и поместите в центрифугу мощностью 35 мл или пластиковую центрифугу мощностью 1,5 мл (подготовьте последний образец, как у неоникотиноидной).
    1. Добавьте 0,1 г хлорида натрия и 5 мл ацетона/этилового ацетата (3:7, v/v) в центрифугу 35 мл из 500 образцов л.
    2. Vortex смеси в течение 1 мин, а затем дать им отдохнуть в течение 10 мин.
    3. Возьмите 2,5 мл супернатанта в стеклянную трубку 10 мл и испаряйтесь до почти сухости с помощью азотного испарителя при 40 градусах Цельсия.
    4. Растворите остатки с 1 мл ацетона, вихрем в течение 1 мин, пройдите его через мембрану фильтра 0,22 мкм перед анализом с помощью газовой хроматографии-пламенного фотометрического детектора (GC-FPD).

5. Образцовая подготовка нетронутого чайного растения с инсектицидами

ПРИМЕЧАНИЕ: Нетронутые испытания чай завода было проведено в гидропонной системе с использованием чайныхсаженцев, выращенных в 50 мл питательного раствора (30 NH 4, 10 NO3-, 3,1 PO4-, 40 K,20 Ca2", 25 Mg2 "0,35 Fe2 "0,1 B 3", 1,0 млн.т 2", 0,1 "n2", 0,025 Cu2", 0,05 М,и 10 Al3", в мг L-1)18. Экспериментальная теплица находилась под светлым циклом (12 ч света и 12 ч темноты) при 20 градусах Цельсия в Аграрном университете Аньхой.

  1. Положите пять растений в 4 l пластиковый горшок в течение 15 дней.
  2. Добавьте 0 промилле (контроль) или 100 промилле тиаметоксама или диметоата в пластиковые горшки, соответственно.
  3. Подготовьте нетронутый образец растения по предыдущему методу, за исключением предварительного замачивания19,а затем проанализируйте с масс-спектрометрией для точного массового спектра.

6. Анализ инструментов

  1. HPLC анализ метаболического поведения неоникотиноидов
    1. Используйте HPLC-УФ(Таблица материалов) для обнаружения содержания и метаболических продуктов тиаметоксам и ацетамиприда на длине волны 254 нм, а также имидаклоприд и имидатотриз на 270 нм в образцах из раздела 4.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние HPLC-UV было таким же, как и предыдущее исследование19.
  2. ГК-анализ метаболического поведения органофосфатов
    1. Обнаружение содержания диметоата и ометоата в образцах из раздела 4.4 с помощью GC-FPD с помощью хиральной колонки(Таблицаматериалов).
    2. Используйте азот в качестве переносица газа и установите скорость потока на уровне 1,0 мл мин-1.
    3. Установите начальную температуру до 120 градусов по Цельсию, и удерживайте ее в течение 5 мин. Увеличьте температуру до 150 градусов по Цельсию при температуре 30 градусов по Цельсию-1 и удерживайте в течение 3 мин. Увеличьте до 170 градусов по Цельсию при температуре 10 градусов по Цельсию-1 и удерживайте в течение 7 мин. Окончательно увеличивайте до 210 градусов по Цельсию при 30 градусах по Цельсиюмин -1, а затем удерживайте в течение 5 мин.
    4. Установите температуру впрыска до 200 градусов по Цельсию в режиме без сплита; Установите температуру детектора до 250 градусов по Цельсию.
    5. Установите объем инъекции до 1 зл.
  3. Анализ уПЛК-ТОФ метаболитов инсектицидов в клеточной культуре
    1. Обнаружение метаболитов инсектицидов в клеточной культуре (образцы из раздела 4.3) с помощью UPLC-TOF с колонкой C18 (Таблицаматериалов).
    2. Установите скорость потока до 0,2 мл мин-1. Установите объем инъекции до 10 зл.
    3. Для неоникотиноидных проб установите начальную мобильную фазу до 85% А (5 мМ аммония для воды) и 15% B (ацетонитрил). Более 10 мин, увеличить мобильный этап B до 38% и вернуться к 15% в течение 1 мин, удерживайте в течение 9 мин.
    4. Для обработанных органофосфатами образцов установите начальную подвижную фазу до 55% А (0,1% для воды с использованием кислоты) и 45% В (ацетонитрил). Более 5 мин, увеличить мобильную фазу B до 70%, затем вернуться к 45% B в течение 0,5 мин, удерживайте в течение 2,5 мин.
    5. Установите параметры операции ВТОО: температура газа, 325 градусов по Цельсию; сушки газа (азот), 10 л мин-1; температура оболочки газа, 350 градусов по Цельсию; поток оболочки газа, 11 л мин-1; капиллярное напряжение, 4000 В; напряжение сопла, 1000 В; напряжение фрагменторов, 100 V для неоникотиноидных инсектицидов или 110 В для инсектицидов органофосфора; скиммер напряжение, 65 В; работает в положительном ионном режиме.
    6. Установите инструмент в полный спектр сканирования и целевой режим MS/MS.
    7. Обработка данных с помощью точных средств массовой информации; Вывод метаболитов без стандартных продуктов из MS / MS аннотации, а также литературы12,15,20,21,22.
  4. UPLC-Orbitrap анализ метаболитов инсектицидов в нетронутом растительном экстракте
    1. Обнаружение метаболитов инсектицидов в нетронутом растительном экстракте с помощью масс-спектрометрии UPLC-Orbitrap(Таблицаматериалов).
    2. Установите параметры работы масс-спектрометрии(Таблицаматериалов) следующим образом: давление газового оболочки, 35 арб; температура газа, 300 градусов по Цельсию; напряжение сопла, 3,5 кВ; температура капилляров, 350 градусов по Цельсию.
    3. Установите программы elution в качестве выше (шаги 6.3.3 и 6.3.4) для анализа upLC-TOF клеточной культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Индукция каллуса из листьев, собранных из выращенных на местах чайных деревьев и из листьев, вырезанных из чайных растений, выращенных в пробирке в стерильной среде, сравнивалась путем измерения загрязнения, подрумянивания и индукции после 28 дней выращивания на MS media ( Рисунок 1А). Каллус рост был зарегистрирован на 20, 37, 62 и 90 дней культуры(рисунок 1B). Каллус, полученный из выращенных в пробирке листья показали более энергичный рост, чем каллуса, полученных из полевых листьев в течение всего 90 дней выращивания. Каллус из стерильных листьев был ярко-желтый, в то время как каллус из выращенных на поле листьев был коричневый(рисунок 1B).

При концентрации 1,0 мг Л-1 из 2,4-D23,концентрация КТ была оптимизирована. На 0,05 мг L-1 КТ, каллус темпроста был медленным, текстура была немного компактной, и каллус был белого цвета(рисунок 2C); на 0,1 мг L-1 KT концентрации, каллус темп роста был самым высоким, до 61,5%(рисунок 2A), текстура была свободной, и цвет был желтоватый (рисунок2C); когда КТ был увеличен до 0,5 мг L-1, каллус был компактным и нерегулярным и коричневый в центре(рисунок 2C). После того, как была выбрана концентрация КТ, концентрация 2,4-D была дополнительно изучена. При сочетании 1 мг L-1,4-D и 0,1 мг L-1 КТ, каллус темп роста был самым высоким, достигнув 46,9%, и появление каллус был лучшим (Рисунок2B,D).

После2-й субкультуры на твердых носителях, более половины поверхности каждого вырезанного листа было покрыто растущим каллуса (рисунок3A). После4-й субкультуры, лист разделы были полностью покрыты каллуса. После5-й субкультуры текстура каллуса стала компактной с некоторыми белыми и коричневыми пятнами на дне.

Когда цикл субкультуры был 21 дней(рисунок 3B), каллус был энергичным, но наибольший объем роста не был достигнут, указывая, что частая субкультура приведет к меньшей каллуса суммы. Когда цикл субкультуры был 28 дней, каллуса выросли энергично, цвет был желтоватый цвет и текстура была свободной. Через 35 дней каллуса из центра начало коричневеть. Каллус был в худшем состоянии, с глубоким коричневым цветом и больше не растет, на 42 дней.

Два вида жидких носителей были сравнена для их влияния на рост каллуса и цвет суспензии клетки(рисунок 4). Были протестированы три различных соотношения материнской жидкости к общему объему культуры жидкости. В течение 75 дней культивирования плотность клеток постепенно увеличивалась, в культурах начиналось все три соотношения. Соотношение 15 г ячеек в 40 мл свежих носителей (v/v) дало значение оптической плотности (OD) значительно выше, чем у 4 г в 40 мл (v/v) и 6 г в 40 мл (v/v)(рисунок 5A). После 4 циклов субкультуры по 28 дней каждый, система подвески чайных клеток была успешно создана из стерильного чайного каллуса в жидких носителях B5(рисунок 6).

Figure 1
Рисунок 1 : Сравнение индукции каллуса из собранных листьев и стерильных листьев растительного растения. (A) Сравнение индукции каллуса из листьев, собранных из выращенных на плантациях чайных растений и из листьев, вырезанных из стерильных, выращенных в пробирке растениях. Экспланты наблюдались при загрязнении, подрумянивании и индукции каллуса. (B) Сравнение роста каллуса листьев, полученных из плантаций выращенных чайных растений (набор 1) и стерильных в пробирке выращенных растений (набор 2): Фотографии были в разные дни: 20 (панели ); 37(б); 62(с); и 90(d ). Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Темпы роста и рост статуса чайного листа производные каллуса при различных концентрациях гормонов растений. Темпы роста(A ) и состояние роста (C) чай-лист производных каллуса при различных концентрациях КТ и 1 мг L-1 2,4-D; Темпы роста(B ) и статус роста (D) каллуса при различных концентрациях 2,4-D и 0,5 мг L-1 KT. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Статус Каллуса после различных количеств циклов субкультуры (A) и разной длины циклов субкультуры (B). Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Влияние различных типов носителей на рост каллуса в жидкой системе культуры подвески. (A) B5 средний. (B) MS средний. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Значения оптической плотности и окрашивание ТТК. (A) Значение OD680 клеточной подвески началось в разных соотношениях от 0 до 75 дней; (B) TTC окрашивание живых и контрольных клеток. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Процесс установления культуры суспензии чайных клеток при постоянной температуре (25 и 1 кС) в темном инкубаторе. Стерильная культура чайных растений вкачестве источника листа explant (a); Листья чая прививают на среде MS с 2,4-D (1,0 мг L-1)и КТ (0,1 мг L-1) (b ); Первоначальный культурный каллусчерез 28 дней (с); Каллус подходит для клеточной подвески после 4циклов субкультуры по 28 дней каждый (d); Остальные шаги были на той же температуре, но на постоянной скорости 120 об/мин в трясущемся инкубаторе: Каллус прививается в среду B5 в течение 7-10 дней (е); Суспензия семя клетки после удаления осажденного и большого каллуса (f); Субкультура клеточной суспензии после1 цикла 28 дней (г); Зрелая клеточная суспензия после 3-4 циклов субкультуры по 28 дней каждый (ч). Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 1: Метаболизм 5 мкг/мл 6 инсектицидов в культуре суспензии чайных клеток и в средствах массовой информации (CK) инкубируется при постоянной температуре (25 и 1 кВс) и встряхивания скорость инкубатора (120 об/мин) в течение 75 дней. Тиаметоксан (A),имидаклоприд (B),ацетамиприд (C),имидататтаз (D),диметоат (E1 , и omethoate (F); (E2) Производство с течением времени метаболита диметоата (ометоата), производимого в диметоатной клеточной культуре и носителях. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная рисунок 2: Всего ионных хроматограмм (TICs) экстрактов из необработанных культуры контрольных клеток, тиаметоксам-обработанных клеточной культуры, тиаметоксам лечения средств массовой информации (клетки бесплатно) после 75 дней. Пики 1-5, 7 и 8 были метаболитами тиаметоксам и Пик 6 былтиаметоксам ( A); TIC экстрактов из диметоат-обработанных клеточной культуры, диметоат-обработанных средств массовой информации (клетки, свободной), и необработанных контрольных клеток после 60 дней. Пики 1 и 2 были метаболитами диметоата, а пик 3был диметоатом (B); TICs экстрактов из тиаметоксам-обработанных (верхних) и необработанных(нижних) нетронутых растений (C); TICs экстрактов из диметоат-обработанных (верхних) и необработанных (нижних) нетронутых растений (D); Метаболит диметоата на tR 1.86 мин в нетронутых растений (D1); В необработанных растениях (D2) не обнаружено соединений на 1,86 мин. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная рисунок 3: Вторичная масс-спектрометрия с использованием UPLC-TOF пиков, полученных из культур, обработанных тиаметоксам и (B) диметхоатом. Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная рисунок 4: Вторичный масс-спектрометрия с использованием з-Эксактивировать пики, полученные из нетронутых растений, обработанных тиаметоксам (A1, A2 и A3) и диметоатом (B1 и B2). Эта цифра была изменена с Цзяо и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье представлен подробный процесс создания модели метаболизма пестицидов в тканях чайного растения, включая выбор эксплантаторов, определение жизнеспособности клеток, а также создание культуры суспензии чайных клеток с высоким метаболизмом Деятельности. Любые части растительной ткани могут быть использованы для инициирования каллуса в стерилизованной среде25. Чайные листья были выбраны для каллуса инициации в этом исследовании, не только потому, что листья, как правило, менее загрязнены, чем части под землей, но и потому, что они являются съедобной частью урожая и основной целью применения пестицидов.

В этом исследовании были сопоставлены темпиндуции и рост каллуса из листьев, взятых с поля, и из листьев, вырезанных из стерильного растения, выращенного в пробирке. Стерильные листья имели гораздо более низкие показатели подрумянивания и загрязнения и более высокий уровень индукции по сравнению с выращенными на местах листьями. Это было вероятно, потому что листья из выращенных на местах растений не только подверглись поверхностной стерилизации с использованием этанола и ртути, но и изменения в среде роста, в то время как стерильные листья культивировались в стерильной среде и могут быть использованы непосредственно без дополнительная стерилизация. Кроме того, каллуса, полученных из в пробирке выращенных, стерильных растений показали более энергичный рост, чем полевые листья в течение 90 дней выращивания. Листья из стерильных растений были более пригодны для индукции чайного каллуса, не только из-за их высокой индукции каллуса и низких показателей загрязнения, но и из-за более короткого времени предварительной обработки и независимости от сезонных факторов.

Для культуры рыхлых и рыхлых каллуса, важнейшие параметры, в первую очередь уровни регулятора роста растений и длина и количество циклов субкультуры, должны быть оптимизированы25. 2,4-D может эффективно способствовать каллус индукции и роста и является наиболее широко используемым гормоном в культуре каллуса26. Времена субкультуры и длина цикла субкультуры также важны для каллуса культуры25. После 2 до 4 субкультур ы 28 дней каждого цикла, каллуса была свободная текстура с желтоватым цветом и не подрумянивания. Эксперименты по оптимизации определили, что лучшим протоколом индукции каллуса было место листовых высадок из стерильных растений на базальных носителях MS, содержащих 1 мг L-1 2,4-D и 0,1 мг L-1 KT и передавать эксплантировать/каллус каждые 28 дней для в общей сложности 4 цикла субкультуры. Этот протокол инициировал рыхлый и рыхлый каллус, который был подходящим для начала клеточной подвески.

В культуре ткани завода, твердая среда используемая для роста каллуса часто может быть использована для культуры суспензии клетки в жидкой форме23. В то время как чай приходит в большое количество полифенолов в MS базальной среде, содержащей высокую концентрацию неорганических солей, в результате чего каллус подрумянивания27,28. В этом исследовании были протестированы жидкие B5-носители и MS-носители. Средние темпы роста не были обнаружены существенной разницы между двумя культурами (16,66% в базальных средствах Массовой информации B5 и 15,77% в басовых средствах массовой информации MS; Рисунок 4). Тем не менее, мозоли были коричневыми в MS базальных средств массовой информации. Таким образом, базальные средства массовой информации B5 были выбраны в предложенном методе.

Кислород имеет важное значение для роста клеток растений и метаболизма. В жидкой культуре, чрезмерный объем жидкости уменьшит концентрацию кислорода и тормозит рост клеток, в то время как слишком мало жидкости также подавляет рост клеток25. Было протестировано несколько соотношений объема жидкости и колбы (жидкость мЛ: мЛ колба). Основываясь на сухом весе роста клеток после 21 d, жидкость: колба отношения ранжируются следующим образом: 30:150 gt; 40:150 В этом исследовании, 40 мл культуры жидкости был помещен в 150 мл колбу (40 мл: 150 мл) был выбран в соответствии с тем, как клеточная подвеска выглядела, как наблюдается невооруженным глазом.

Растительные клетки не могут хорошо расти, когда плотность клеток слишком высока или слишком низка. Таким образом, доля культуры суспензии клеток матери к свежей среде во время субкультуры влияет на потенциал роста клеток29. В этом исследовании использовалось значение OD однородной культуры суспензии клеток для представления количества клеточного роста. Прививка с 15 г материнской жидкости в 40 мл общего объема культуры жидкости (v/v) подходит для роста клеток. Соотношение субкультуры было равно между 1:1 и 1:2 (подвесная материнская жидкость: свежая среда).

Клеточная жизнеспособность в культуре суспензии чайных клеток была проверена tTC окрашиванием. Бесцветные соединения ТТК могут быть преобразованы в красный цвет formazan дегидрогеназы в митохондриях живых клеток, но цвет не может быть изменен с мертвых клеток (Рисунок 5B). Этот метод проверил состояние роста клеток в жидкой культуре.

Создание культуры суспензии чайных клеток обеспечивает легкую исследовательскую платформу in vitro для изучения метаболизма и метаболитов различных пестицидов. Независимо от сезона и погоды, культуры подвески клеток можно обработать различными пестицидами, различными концентрациями активного ингредиента, и для различных длин времени. Метаболиты, производимые в культурах суспензии чайных клеток, были аналогичны тем, которые были извлечены из нетронутых растений(Дополнительная рисунок 1 и Дополнительная рисунок 2). Интересно, что семь метаболитов тиаметоксам и два метаболита диметоата были обнаружены в культуре суспензии чайных клеток, но только два метаболита тиаметоксама и один для диметхоата в обработанных нетронутых растений (Дополнительная рисунок 1, Дополнительная рисунок 2, и дополнительная рисунок 3). Это может быть из-за легче извлечения из клеток без восковой кутикулы, меньше соединений из чая вмешательства в результаты масс-спектрометрии (матричной эффект), или простой метаболит профиль чайных клеток по сравнению со всем растением.

Результаты показали, что тиаметоксам был более легко метаболизируется чайной клеткой по сравнению с тремя другими неоникотиноидами(Дополнительная рисунок 4). Оба органофосфата (диметоат и ометоат) метаболизовались быстрее, чем неоникотиноиды. Эти результаты показывают разнообразие метаболических путей и метаболически регуляции в чайной клетке, которые нуждаются в дальнейшем изучении.

Использование нетронутых растений для изучения метаболизма инсектицидов и для выявления метаболитов инсектицидов представляет многочисленные трудности, в том числе барьеры для поглощения и междугородной транспортировки как начальных, так и распада соединений в пределах завода30. Культуры суспензии клеток могли не только решить эту проблему, но и уменьшить матричную интерференцию в анализе выборки по сравнению с экстрактом из свежих листьев24. Это исследование доказало, что культуры суспензии чайных клеток являются эффективной платформой для изучения метаболизма ксенобиотические соединения в чайном растении. Он может быть подан в качестве режима для изучения метаболизма ксенобиотики в других растениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и развития (2016YFD0200900) Китая, Национальным фондом естественных наук Китая (No 31772076 и No 31270728), Китайским фондом постдокторской науки (2018M630700) и Открытым фондом Государственная ключевая лаборатория биологии и утилизации чайных растений (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Tags

Биохимия Выпуск 148 суспензия чайных клеток нетронутое чайное растение инсектицид метаболизм растений обмен веществ масс-спектрометрия
Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая<em>(Камелия Sinensis </em>L.) Листья
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J.,… More

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter