Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbejde præsenterer en protokol for etablering af en cellesuspension kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) blade, der kan bruges til at studere metabolismen af eksterne forbindelser, der kan tages op af hele planten, såsom insekticider.

Abstract

Der blev udviklet en platform for undersøgelse af insekternes metabolisme ved hjælp af in vitro-væv af te-planten. Blade fra sterile Tea plantlets blev induceret til at danne løse hård hud på murashige og Skoog (MS) basal Media med planten hormoner 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre (2,4-D, 1,0 mg l-1) og kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus dannet efter 3 eller 4 runder af subculturing, hver varede 28 dage. Løs hård hud (ca. 3 g) blev derefter inokuleret i B5 flydende medier indeholdende de samme plante hormoner og blev dyrket i en ryste inkubator (120 rpm) i mørke ved 25 ± 1 °c. Efter 3 − 4 subkulturer blev en cellesuspension afledt af teblad etableret ved et subkulturforhold på mellem 1:1 og 1:2 (suspension moder væske: frisk medium). Ved hjælp af denne platform, seks insekticider (5 μg mL-1 hver thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoat, og omethoat) blev føjet til Tea Leaf-afledte cellesuspension kultur. Metabolismen af insekticiderne blev sporet ved hjælp af væskekromatografi og gaskromatografi. For at validere nytten af tecelle affjedrings kulturen blev metabolitterne af thiamethoxan og dimethoat til stede i behandlede cellekulturer og intakte planter sammenlignet ved hjælp af massespektrometri. I behandlede tecellekulturer blev der fundet syv metabolitter af thiamethoxan og to metabolitter af dimethoat, mens der i behandlede intakte planter kun blev fundet to metabolitter af thiamethoxam og en af dimethoat. Brugen af en cellesuspension forenklet den metaboliske analyse i forhold til brugen af intakte teplanter, især for en vanskelig matrix som te.

Introduction

Te er en af de mest udbredte ikke-alkoholholdige drikkevarer i verden1,2. Te er fremstillet af bladene og knopper af woody flerårig Camellia sinensis L. Tea planter dyrkes i store plantager og er modtagelige for talrige insekt skadedyr3,4. Insekticider til organophosphorus og neonicotinoid anvendes ofte som systemiske insekticider5 for at beskytte teplanter mod skadedyr såsom hvid fluer, blad tragte og nogle lepidopteran-arter6,7. Efter påføring absorberes disse insekticider eller omplaceres i planten. Inden for anlægget kan disse systemiske insekticider omdannes gennem hydrolyse, oxidation eller reduktions reaktioner med plante enzymer. Disse transformation produkter kan være mere polære og mindre giftige end de overordnede forbindelser. For nogle organophosphater er bioaktiviteterne for visse produkter imidlertid højere. F. eks. metaboliseres acephat til den mere giftige methamidophos8,9og dimethoat til omethoat10,11. Plante Stofskifteundersøgelser er således vigtige for fastlæggelsen af et pesticidstofs skæbne i en plante12.

Plantevævs kulturer har vist sig at være en nyttig platform for undersøgelse af pesticid metabolismen, idet de identificerede metabolitter svarer til dem, der findes i intakte planter13,14,15. Brugen af vævskulturer, især celle ophængs kulturer, har flere fordele. For det første kan eksperimenter udføres fri for mikroorganismer og dermed undgå interferens fra pesticid omdannelse eller nedbrydning ved mikrober. For det andet, vævskultur giver konsekvent materialer til brug til enhver tid. For det tredje er metabolitterne lettere at udtrække fra vævskulturer end fra intakte planter, og vævskulturer har ofte færre begravelsen forbindelser og lavere kompleksitet af forbindelser. Endelig kan vævskulturer lettere bruges til at sammenligne en række pesticider metabolisme i et enkelt eksperiment16.

I denne undersøgelse, en cellesuspension afledt af bladene af sterilt-dyrket Tea plantlet blev etableret med succes. Den te cellesuspension kultur blev derefter brugt til at sammenligne afledning adfærd af seks systemiske insekticider.

Denne detaljerede protokol har til formål at give nogle retningslinjer, således at forskerne kan etablere en plante vævskultur platform nyttigt for at studere den metaboliske skæbne af xenobiotika i te.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. te hård hud kultur

Bemærk: sterile blade stammer fra in vitro-dyrkede plantlet linjer, der først blev udviklet i Forskergruppen17. Alle procedurer op til punkt 5 blev udført i en steril laminar flow hætte, bortset fra kulturtid i en inkubator.

  1. Juster pH-værdien for de to medier (Murashige og Skoog [MS] basal medium og Gamborgs B5-væske medium) til 5,8 før autoklavering (121 °C, 20 min).
  2. Skær langs den midterste vene af et sterilt blad ved hjælp af en saks, og derefter underopdele hver halvdel i små stykker af ca 0,3 cm x 0,3 cm i en petriskål.
  3. Anbring de sterile eksplanteret væv (de små blad stykker) på MS basal medier, der indeholder plante hormonerne 2,4-D (1,0 mg l-1) og kt (0,1 mg l-1). Seks eksplanteret væv kan anbringes i en 300 ml kolbe indeholdende 100 ml MS basal Media.
  4. Kultur de ovennævnte blad eksplanteret væv ved en konstant temperatur på 25 °c i mørke. Efter 28 dage, Vælg den første generation af induceret hård hud og overførsel til frisk kolbe (en subkultur). Opnå den løse og smullige hård hud efter 3 − 4 subkulturer.

2. te cellesuspension kultur

  1. Skær de kraftige, frielige og løse calluser fra det faste medium i små stykker (område her 0,5 − 2 mm) ved hjælp af et sterilt kirurgisk blad under sterile forhold.
  2. Vejer omkring 3 g af de små stykker af callus. Hård hud anbringes i en 150 ml kolbe indeholdende 20 ml B5 flydende medier suppleret med 2,4-D (1,0 mg l-1) og kt (0,1 mg l-1).
  3. Opfør væske cellesuspensionen ved en konstant temperatur (25 ± 1 °C) i en ryste inkubator ved 120 rpm i mørke.
  4. Efter 7 til 10 dages dyrkning, fjerne kultur kolberne og lad dem stå i et par minutter.
  5. Tag alle supernatanten som frø materiale til subkultur til frisk medium (subkultur forholdet mellem suspension moder væske til frisk medium varierede mellem 1:1 og 1:2). Fjern de udfældede, store kalluser.
  6. Få den sidste veldyrkede celle affjedrings kultur efter 3 − 4 subkulturcyklusser på 28 dage hver.

3. bestemmelse af triphenyltetrazoliumchlorid af cellernes levedygtighed

  1. Dræb en prøve af levende celler ved 100 °C i 10 min som en kontrol celle før levedygtig farvning.
  2. Der centrifugeres al celle affjedrings kultur i 8 minutter ved 6000 x g. Supernatanten fjernes, inden cellerne suspenderes i 2,5 mL fosfat-buffer-buffer (PBS) (pH 7,3), og den rystes i 1 min. i hånden.
  3. Tilsæt 2,5 mL af 0,4% triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-opløsningen, og omrystes med hånden igen.
  4. Blandingen inkueres i 1 time i en stående inkubator (30 °C).

4. behandling og prøvetagning af tecelle affjedrings kulturer med insekticider

  1. Der tilsættes en alikvot 400 μL filter steriliseret stamopløsning (500 μg mL-1) af fire neonicotinoider (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid og imidaclothiz) eller to organophosphater (dimethoat og omethoat) i celle ophængs kulturer Henholdsvis.
    Bemærk: Hvis målet er at sammenligne xenobiotiske adfærd, skal du bruge den samme mor batch af celle suspensioner til at teste de forskellige forbindelser.
  2. Kultur prøverne af celle suspensioner med insekticider ved konstant temperatur (25 ± 1 °C) og ryste inkubator hastighed (120 rpm). Tag prøverne (Se trin 4,3 eller 4,4) på 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 og 75 dage.
  3. For at afprøve en prøve, der indeholder et neonicotinoid, udtages en 1 mL alikvot af den homogene cellekultur, anbringes i et 1,5 mL plastik centrifugeglas og centrifugeres ved 4000 x g i 2 min.
    1. Supernatanterne passerer gennem en 0,22-μm porestørrelse filter membran før analyse af højtydende væskekromatografi-ultraviolet (HPLC-UV) og ultra-højtydende væskekromatografi-firpolet Time-of-Flight (UPLC-QTOF) masse SPEKTROMETRI (tabel over materialer).
  4. For at afprøve en prøve, der indeholder et organophosphat, fjernes en 500 μL alikvot cellekultur, og der anbringes et 35 mL centrifugeglas eller et 1,5 mL plastik centrifugeglas (den sidstnævnte prøve tilberedes på samme måde som neonicotinoid).
    1. Der tilsættes 0,1 g natriumchlorid og 5 mL acetone/ethylacetat (3:7, v/v) i et 35 mL centrifugeglas af 500 μL prøverne.
    2. Vortex blandingerne i 1 min, og derefter lade dem hvile i 10 min.
    3. Der tages 2,5 mL af supernatanten i et 10 mL glas rør, som fordamper til nær tørhed ved hjælp af en nitrogen fordamper ved 40 °C.
    4. Remanensen opløses med 1 mL acetone, vortex i 1 min., passerer den gennem en 0,22-μm filter membran før analyse af gaskromatografi-flamme Fotometrisk detektor (GC-FPD).

5. prøveforberedelse af intakt teplante med insekticider

Bemærk: det intakte teplante forsøg blev udført i et hydroponisk system ved hjælp af tefrøplanter dyrket i 50 mL af en næringsstofopløsning (30 NH4+, 10 No3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 ca2 +, 25 mg2 +, 0,35 fe2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 MN2 +, 0,1 Zn2 +, 0,025 cu2 +, 0,05 mo+og 10 al3 +, i mg L-1)18. Et forsøgs drivhus var under en lys-mørk cyklus (12 timer lys og 12 h mørke) ved 20 °C ved Anhui Agricultural University.

  1. Sæt fem planter i en 4 L plastik gryde i 15 dage.
  2. Der tilsættes 0 ppm (kontrol) eller 100 ppm thiamethoxam eller dimethoat til plastik Potter.
  3. Forbered den intakte plante prøve i henhold til den tidligere metode, bortset fra præibende19, og derefter analysere med massespektrometri for en præcis massespektrum.

6. instrument analyse

  1. HPLC-analyse af den metaboliske opførsel af neonicotinoider
    1. Brug en HPLC-UV (tabel over materialer) til at detektere indholdet og metaboliske produkter af thiamethoxam og acetamiprid ved en bølgelængde på 254 nm og af imidacloprid og imidaclothiz ved 270 nm i prøver fra punkt 4,3.
      Bemærk: HPLC-UV-betingelsen var den samme som den tidligere undersøgelse19.
  2. GC-analyse af den metaboliske opførsel af organophosphater
    1. Detektér indholdet af dimethoat og omethoat i prøver fra punkt 4,4 af en GC-FPD ved hjælp af en chiral kolonne (tabel over materialer).
    2. Brug nitrogen som bækgas, og Indstil strømningshastigheden ved 1,0 mL min-1.
    3. Indstil Start temperaturen til 120 °C, og hold den nede i 5 min. Øg temperaturen til 150 °C ved 30 °C min-1 og hold i 3 min. stigning til 170 °c ved 10 °c min-1 og hold i 7 min. Endelig øges til 210 °C ved 30 °C min-1 og derefter holdes i 5 min.
    4. Indstil injektions temperaturen til 200 °C i splitfri tilstand; Indstil detektor temperaturen til 250 °C.
    5. Indstil Injektionsvolumen til 1 μL.
  3. UPLC-QTOF-analyse af insekstofmetabolitterne i cellekultur
    1. Detektere metabolitterne af insekticider i cellekultur (prøver fra afsnit 4,3) ved hjælp af UPLC-QTOF med en C18-kolonne (tabel over materialer).
    2. Indstil strømningshastigheden til 0,2 mL min-1. Indstil Injektionsvolumen til 10 μL.
    3. For de neonicotinoid-behandlede prøver indstilles den indledende mobile fase til 85% A (5 mM ammonium-format vand) og 15% B (acetonitril). Over 10 min, øge mobile fase B til 38% og vende tilbage til 15% over 1 min, hold i 9 min.
    4. For de organophosphat-behandlede prøver, Indstil den indledende mobile fase til 55% A (0,1% myresyre vand) og 45% B (acetonitril). Over 5 min, øge mobile fase B til 70%, derefter vende tilbage til 45% af B over 0,5 min, hold for 2,5 min.
    5. Indstil QTOF-Operations parametrene på følgende måde: gastemperatur, 325 °C; tørring gas (kvælstof), 10 L min-1; gas temperatur, 350 °C; gas flow, 11 L min-1; kapillær spænding, 4000 V; dysespænding, 1000 V; fragmentorens spænding, 100 v for insekticider til neonicotinoid eller 110 v for insekticider til organisk fosforsyre skimmer spænding, 65 V; fungerer i positiv ion-tilstand.
    6. Indstil instrumentet til det fulde scannings spektrum og mål MS/MS-tilstand.
    7. Behandl dataene ved hjælp af nøjagtige masse værktøjer. Udlede metabolitter uden standardprodukter fra MS/MS annotation samt litteratur12,15,20,21,22.
  4. UPLC-Orbitrap-analyse af insekstofmetabolitterne i intakt planteekstrakt
    1. Detektér metabolitterne af insekticider i intakt planteekstrakt ved hjælp af UPLC-Orbitrap-massespektrometri (tabel over materialer).
    2. Indstil massespektrometri (tabel over materialer) driftsparametre som følger: kappe gas tryk, 35 arb; gastemperatur, 300 °C; dysespænding, 3,5 KV; kapillar temperatur, 350 °C.
    3. Sæt eluering programmer som ovenfor (trin 6.3.3 og 6.3.4) for uplc-QTOF analyse af cellekultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion af hård hud fra blade høstet fra felt dyrkede tetræer og fra blade, der er fjernet fra teplanter dyrket in vitro i et sterilt miljø, blev sammenlignet ved at måle kontaminering, bruning og induktion efter 28 dages dyrkning på MS-medier ( Figur 1a). Væksten i callus blev registreret ved 20, 37, 62 og 90 dages kultur (figur 1b). Den hård hud, der stammer fra de in vitro-dyrkede blade, viste en kraftigere vækst end den, der stammede fra de dyrkede blade i hele 90 dage med dyrkning. Den hård hud fra de sterile blade var lyse gule, mens hård hud fra marken dyrkede blade var brun (figur 1b).

Ved en koncentration på 1,0 mg L-1 af 2,4-D23blev koncentrationen af kt optimeret. På 0,05 mg L-1 kt, den hård hud vækstrate var langsom, teksturen var lidt kompakt, og hård hud var hvid i farve (figur 2c); ved 0,1 mg L-1 kt koncentration var vækstraten for hård hud den højeste, op til 61,5% (figur 2a), teksturen var løs, og farven var gullig (figur 2c); da kt blev forhøjet til 0,5 mg L-1, var hård hud kompakt og uregelmæssig og brun i midten (figur 2c). Efter at KT-koncentrationen var blevet udvalgt, blev koncentrationen af 2,4-D yderligere undersøgt. Ved en kombination af 1 mg l-1 2,4-D og 0,1 mg l-1 kt var vækstraten for hård hud den højeste, nåede 46,9%, og udseendet af hård hud var den bedste (figur 2b,D).

Efter den 2nd subkultur på solide medier, var mere end halvdelen af overfladen af hver fjernet blade dækket af voksende hård hud (figur 3a). Efter 4th Subculture, blad sektioner var helt dækket af callus. Efter 5th Subculture, den hård hud tekstur begyndte at blive kompakt med nogle hvide og brune pletter på bunden.

Når subkulturcyklussen var 21 dage lang (figur 3b), var hård hud energisk, men den største vækst mængde var ikke nået, hvilket indikerer, at hyppig subkultur ville resultere i mindre hård hud beløb. Når subkulturcyklussen var 28 dage lang, var hård hud vokset kraftigt, farven var gullig farve og teksturen var løs. Efter 35 dage begyndte hård hud at brune fra midten. Den hård hud var i den værste tilstand, med en dyb brun farve og ikke længere vokser, på 42 dage.

To former for flydende medier blev sammenlignet for deres virkninger på væksten af hård hud og farven på cellesuspensionen (figur 4). Tre forskellige forhold mellem Moder væsken og det totale volumen af dyrknings væsken blev afprøvet. I løbet af de 75 dage dyrkning, celletætheden steg gradvist i kulturer startede på alle tre nøgletal. Forholdet på 15 g celler i 40 mL friske medier (v/v) gav en værdi for optisk densitet (OD) betydeligt højere end 4 g i 40 mL (v/v) og 6 g i 40 mL (v/v) (figur 5a). Efter 4 subkultur cyklusser af 28 dage hver, en te cellesuspension system blev etableret med succes fra steril te hård hud i B5 flydende medier (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Sammenligning af hård hud induktion fra plukkede blade og sterile plantlet blade. (A) sammenligning af hård hud induktion fra blade høstet fra plantagen-dyrkede teplanter og fra blade, der er fjernet fra sterile, in vitro-dyrkede plantletter. Der blev observeret explants for kontaminering, bruning og induktion af callus. B) sammenligning af væksten i hård hud af blade, der er afledt af plantage-dyrkede teplanter (sæt 1) og sterile in vitro-dyrkede beplantninger (sæt 2): fotografierne var på forskellige dage: 20 (paneler a); 37, litrab); 62, litrac); og 90 (d). Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Vækstrate og vækst status af te-blad afledt hård hud under forskellige plante hormon koncentrationer. Vækstraten (a) og vækst status (C) for teblade afledt hård hud under forskellige kt-koncentrationer og 1 mg L-1 2,4-D; Vækstraten (B) og vækst status (D) af hård hud under forskellige 2,4-D koncentrationer og 0,5 mg L-1 kt. Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Callus-status efter forskellige antal subkulturcyklusser (a) og forskellige længder af subkulturcyklusser (B). Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Indflydelse af forskellige medietyper på hård hud vækst i flydende suspension kultur system. (A) B5 medium. B) MS medium. Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Den optiske tæthed værdier og TTC farvning. (A) OD680 -værdien af cellesuspension startede i forskellige forhold fra 0 til 75 dage; (B) den TTC farvning af levende og kontrol celler. Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Processen med at etablere en tecelle affjedrings kultur ved konstant temperatur (25 ± 1 °c) i en mørk inkubator. Steril kultur af te plantere som kilde til blad eksper (a); Te blad inokuleres på MS medium med 2,4-D (1,0 mg L-1) og KT (0,1 mg l-1) (b); Indledende kultiveret hård hud efter 28 dage (c); Callus egnet til cellesuspension efter 4 subkulturer cyklusser af 28 dage hver (d); De resterende trin var ved samme temperatur, men med en konstant hastighed på 120 rpm i en ryste inkubator: callus inokuleres i B5-medium i 7 til 10 dage (e). Seedet cellesuspension efter fjernelse af den udfældede og store hård hud (f); Subkulturen for cellesuspension efter 1 cyklus på 28 dage (g); Ældre cellesuspension efter 3-4 subkultur cyklusser af 28 dage hver (h). Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: metabolismen af 5 μg/ml af 6 insekticider i tecelle suspensions kultur og i medier (CK) inkuperet ved konstant temperatur (25 ± 1 °c) og ryste inkubator hastighed (120 rpm) over 75 dage. Thiamethoxan (a), imidacloprid (B), acetamiprid (C), Imidaclothiz (D), dimethoat (E1) og omethoat (F); (E2) Produktion over tid af metabolitten af dimethoat (omethoat) produceret i dimethoat-behandlet cellekultur og medier. Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: Total ionkromatogrammer (TICs) af ekstrakterne fra ubehandlet kontrol cellekultur, thiamethoxam-behandlet cellekultur, thiamethoxam-behandlede medier (celle-fri) efter 75 dage. Toppe 1-5, 7 og 8 var metabolitter af thiamethoxam, og Peak 6 var thiamethoxam (a); TICs af ekstrakter fra dimethoat-behandlet cellekultur, dimethoat-behandlede medier (celle-fri), og ubehandlet kontrol celler efter 60 dage. Toppene 1 og 2 var metabolitter af dimethoat, og Peak 3 var dimethoat (B); TICs af ekstrakter fra thiamethoxam-behandlede (øvre) og ubehandlet (lavere) intakte planter (C); TICs af ekstrakter fra dimethoat-behandlede (øvre) og ubehandlet (lavere) intakte planter (D); Dimethoatmetabolitten ved tR 1,86 min i intakte planter (D1); Der blev ikke påvist forbindelser ved tR 1,86 min i ubehandlede planter (D2). Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 3: den sekundære massespektrometri, der anvender uplc-QTOF af toppe afledt af kulturer behandlet med a) thiamethoxam og (B) dimethoat. Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 4: den sekundære massespektrometri med Q-exactive af toppe afledt af intakt plante behandlet med thiamethoxam (a1, a2 og a3) og dimethoat (B1 og B2). Dette tal er blevet ændret fra Jiao et al.24. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel præsenterer den detaljerede proces med at etablere en model af pesticid metabolisme i teplantevæv, herunder udvælgelsen af explants, bestemmelse af cellernes levedygtighed, og etablering af en tecelle suspension kultur med høj metaboliske Aktivitet. Alle dele af et plantevæv kan anvendes til at initiere hård hud i et steriliseret miljø25. Tea blade blev valgt til hård hud indledning i denne undersøgelse, ikke kun fordi bladene har tendens til at være mindre forurenet end de dele under jorden, men også fordi de er den spiselige del af afgrøden og det vigtigste mål for pesticid ansøgning.

I denne undersøgelse, induktions raten og vækst status af hård hud fra blade plukket fra marken og fra blade fjernet fra en steril plantlet dyrkes in vitro blev sammenlignet. De sterile blade havde meget lavere brunings-og kontaminerings rater og en højere induktions hastighed sammenlignet med felt dyrkede blade. Dette skyldtes sandsynligvis, at blade fra Mark dyrkede planter ikke kun gennemgik overflade sterilisering ved hjælp af ethanol og kviksølv, men også en ændring i vækst miljøet, mens sterile blade blev dyrket i et sterilt miljø og kunne anvendes direkte uden yderligere sterilisering. Hertil kommer, at hård hud afledt af in vitro-dyrkede, sterile planter viste mere kraftig vækst end de dyrkede blade i løbet af 90 dage dyrkning. Blade fra sterile plantere var mere egnet til induktion af te hård hud, ikke kun på grund af deres høje hård hud induktion og lav forurening satser, men også på grund af den kortere præ-behandling tid og uafhængighed fra sæsonmæssige faktorer.

Til kulturen løs og smuldelig callus, skal de afgørende parametre, primært plantevækst regulator niveauer og længden af og antallet af subkultur cyklusser, skal optimeres25. 2,4-D kan effektivt fremme hård hud induktion og vækst og er den mest udbredte hormon i hård hud kultur26. Subkulturtid og subkulturcyklus længde er også vigtige for hård hud kultur25. Efter 2 til 4 subkulturer af 28 dage i hver cyklus, havde hård hud en løs tekstur med en gullig farve og ingen bruning. Optimerings forsøgene fastslog, at den bedste hård hud induktions protokol var at placere blad eksplanteret væv fra sterile plantninger på MS basal Media indeholdende 1 mg l-1 2,4-D og 0,1 mg l-1 kt og til at overføre explant/hård hud hver 28 dage for en i alt 4 subkulturcyklusser. Denne protokol initierede løs og smuldelig hård hud, der var egnet til initiering af en cellesuspension.

I plantevævs kultur kan det faste medium, der anvendes til vækst af hård hud, ofte anvendes til celle affjedrings kultur i flydende form23. Der henviser til, at te kommer til at være store mængder af polyfenoler i MS basal medium, der indeholder en høj koncentration af uorganiske salte, hvilket resulterer i hård hud Browning27,28. I denne undersøgelse blev flydende B5-medier og MS-medier testet begge. De gennemsnitlige vækstrater blev ikke fundet signifikant forskel mellem de to kulturer (16,66% i B5 basal Media og 15,77% i MS basal Media; Figur 4). Men, de hård hud var brun i MS basal medier. Så, B5 basal Media blev valgt i den foreslåede metode.

Ilt er vigtigt at plante cellevækst og metabolisme. I flydende kultur, en overdreven volumen af væske vil mindske iltkoncentrationen og hæmme cellevækst, mens for lidt væske også hæmmer cellevækst25. Der blev testet flere væske forhold til kolbe volumen (mL væske: mL kolbe). På grundlag af celle vækstens tørvægt efter 21 d er væsken: kolbe forholdet rangeret som følger: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. I dette studie blev 40 mL kulturvæske anbragt i en 150 mL kolbe (40 mL: 150 mL) udvalgt efter hvordan cellesuspensionen så ud som observeret med det blotte øje.

Planteceller kan ikke vokse godt, når celletætheden er for høj eller for lav. Således påvirker andelen af moder celle suspensions kulturen til det friske medium på tidspunktet for subkulturen vækstpotentialet i cellerne29. Denne undersøgelse anvendte OD værdien af den homogene cellesuspension kultur til at repræsentere mængden af cellevækst. Inokulation med 15 g moder væske i 40 mL af det totale volumen af kulturvæske (v/v) var velegnet til cellevækst. Subkulturforholdet var lig med mellem 1:1 og 1:2 (suspension moder væske: frisk medium).

Cellernes levedygtighed inden for tecellens affjedrings kultur blev testet af TTC-farvning. Den farveløs TTC sammensatte kan konverteres til den røde farvet formazan af dehydrogenaser i mitokondrier af levende celler, men farven kan ikke ændres fra døde celler (figur 5b). Denne metode bekræftede vækst status af cellerne i flydende kultur.

Oprettelsen af en te cellesuspension kultur giver en let in vitro-forskning platform for at studere metabolisme og metabolitter af forskellige pesticider. Uafhængigt af sæsonen og vejret, cellesuspension kulturer kan behandles med forskellige pesticider, forskellige koncentrationer af aktive ingrediens, og for forskellige længder af tid. De metabolitter, der produceres i tecelle suspensions kulturer, svarer til dem, der udvindes fra intakte planter (supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Interessant nok blev der påvist syv metabolitter af thiamethoxam og to metabolitter af dimethoat i tecelle suspensions kulturen, men kun to metabolitter af thiamethoxam og en for dimethoat i behandlede intakte planter (supplerende figur 1, Supplerende figur 2og supplerende figur 3). Dette kan være på grund af den lettere udvinding fra celler uden voksagtige neglebånd, færre forbindelser fra te blande sig med massespektrometri resultater (matrix effekt), eller den enklere metabolit profil af teceller sammenlignet med hele planten.

Resultaterne viste, at thiamethoxam blev lettere metaboliseret af tecellen sammenlignet med de andre tre neonicotinoider (supplerende figur 4). Begge organophosphater (dimethoat og omethoat) blev metaboliseret hurtigere end neonicotinoider. Disse resultater viser mangfoldigheden af de metaboliske veje og metaboliske regulering i tecellen, som skal undersøgt yderligere.

Anvendelse af intakte planter til undersøgelse af insekternes metabolisme og til identificering af insekstofmetabolitterne giver talrige vanskeligheder, herunder barrierer for absorption og langdistancetransport af både Initial-og nedbrydnings forbindelser inden for anlægget30. Cellesuspension kulturer kunne ikke kun løse dette problem, men også reducere matrix interferens i prøveanalyse sammenlignet med ekstrakt fra friske blade24. Denne forskning viste, at te cellesuspension kulturer er en effektiv platform for at studere metabolismen af xenobiotiske forbindelser i teplanten. Det kan betjenes som en tilstand til at studere metabolismen af xenobiotika i andre planter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den nationale Nøgleforskning & Development program (2016YFD0200900) i Kina, den nationale naturvidenskabelige fundament i Kina (no. 31772076 og No. 31270728), Kina postdoc Science Foundation (2018M630700), og åbne fond af State Key laboratorium for Tea Plant biologi og udnyttelse (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Tags

Biokemi te cellesuspension intakt te plante insekt plante metabolisme metabolisme massespektrometri
Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (<em>Camellia sinensis </em>L.) Blade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J.,… More

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter