Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59322
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Summary

פרוטוקול זה מתאר מבע ו אורתובנושא מודלים העכבר של בלוטת התריס האנושית tumorigenesis כפלטפורמה לבדוק טיפולים מעכבי מבוססי-אורנה. גישה זו אידיאלית כדי ללמוד את הפונקציה של RNAs ללא קידוד והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות חדשות.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) הם הרגולטורים חשובים של ביטוי גנים דרך היכולת שלהם לערער את היציבות mRNA ולעכב את התרגום של Mrna היעד. מספר גדל והולך של מחקרים זיהו miRNAs כסמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, וגם כמו מטרות טיפוליות, הוספת ממד נוסף להערכת סרטן וטיפול. בהקשר של סרטן בלוטת התריס, התוצאות tuמוריגנזה לא רק מוטציות בגנים חשובים, אלא גם מהבעת היתר של miRNAs רבים. בהתאם, התפקיד של miRNAs בשליטה של ביטוי גנים בלוטת התריס מתפתחת כמנגנון חשוב בסרטן. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעות של משלוח miRNA-מעכבי כמו מודאליות טיפולית בסרטן בלוטת התריס באמצעות השתלת הגידול האנושי מודלים אורתוקפית העכבר. לאחר בלוטת התריס יציבה הנדסה מוסרי תאים המבטא GFP ו לluciferase, תאים מוזרק לתוך עכברים ערומים לפתח גידולים, אשר ניתן לאחר מכן ביולומינסנציה. בעיכוב vivo של miRNA יכול להפחית את צמיחת הגידול ו upregulate miRNA מטרות גנים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את חשיבותו של miRNA נחושה בvivo, בנוסף לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

Introduction

סרטן בלוטת התריס הוא ממאירות אנדוקרינית עם שכיחות הולך וגובר, למרות במונחים כלליים יש תוצאה טובה1. עם זאת, חלק מהחולים לפתח צורות אגרסיביות של המחלה כי הם ללא טיפול ובסיסים מולקולריים הבינו בצורה עלובה2.

miRNAs הם 22-נוקלאוטיד ארוך שאינו קידוד RNAs כי לווסת ביטוי גנים ברקמות רבות, בדרך כלל על ידי כריכת זוג בסיס ל 3 ' אזור untranslational (3 ' UTR) של שליח היעד RNAs (mRNAs), הפעלה של השפלה או הדיכוי הטרנסאפילי של Mrnas מיכל שלוש , 4. יש ראיות הגוברת הוכחת כי רגולציה של הביטוי מיקרואורנה הוא סימן ההיכר של סרטן, כמו אלה מולקולות לווסת איתות מתרבים, הגירה, הפלישה גרורות, והוא יכול לספק התנגדות אפופטוזיס 5,6. בשנים האחרונות, מחקרים רבים זיהו miRNAs כמו סמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, כמו גם מטרות טיפוליות7, מתן ממד חדש להערכת סרטן וטיפול.

mirnas לקחו את הבמה במרכז האונקולוגיה האנושית כמו נהגים מרכזיים של האדם בלוטת התריס נחיים8,9,10,11,12. בין miRNAs מוסדר, מיר-146b הוא מבוטא מאוד בבלוטת התריס קרצינומה (PTC) גידולים והוכח באופן משמעותי להגדיל את התפשטות התא, ולהיות משויך אגרסיביות ופרוגנוזה עגומה6, מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. יתר על כן, מיר-146b מסדיר מספר גנים בלוטת התריס המעורבים בבידול12, וגם גנים חשובים מדכא הגידול כגון PTEN16 ו DICER117. למרות החשיבות שלהם בביולוגיה של סרטן, miRNA מבוססי טיפול בסרטן עדיין בשלבים המוקדמים שלה, ומחקרים מעטים מאוד התייחסו לסרטן בלוטת התריס-התכופים ביותר של גידולים האנדוקרינית18. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שני דגמי העכבר השונים עם האדם הנגזר גידולים, שבו המינהל של מירנה סינתטי מעכבי (antagomiR) כי מעכב באופן ספציפי miRNA הסלולר יכול לחסום את צמיחת הגידול. השתמשנו לראשונה במודל משותף של מבע, ואת intratumor המקומי הממשל של antagomiR ירד גידול הגידול נמדד כירידה בביולומילומינציה הגידול16. בגלל הקמתה של דגמים חזקים של העכבר מחקה התקדמות הגידול האנושי חיוני כדי לפתח גישות טיפוליות ייחודי, אורתודהשרשה של גידולים אנושיים העיקרי היא פלטפורמה יקר יותר עבור אימות קליני של תרופות חדשות מאשר דגמים השרשה תת-עורית. כך, על מנת להעריך טוב יותר את הפוטנציאל התרפויטי של antagomiR, השתמשנו מודל העכבר אורתוטופית עם משלוח מערכתי בזרם הדם, קבלת תוצאות זהות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק הקהילה האירופי (86/609/EEC) ולחוק הספרדי (ר לוך 1201/2005), באישור ועדת האתיקה של המשרד העליון של Consejo (CSIC, ספרד).

1. מאגף לתאי תאים וטיפול antagomiR מוסרי

  1. הכנה לתאים
    1. מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא (קראסG12R ו p53A161D מוטציות) כדי לבטא את המבנה הטרנסגניים המבטא באופן מוגזם gfp ו לוציפראז (Cmv-ללוק גחלילית-IRES-egfp). בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.
    2. לגדל את התאים בדולב́s שונה הנשר ́s בינונית (DMEM) שיושלם עם פניצילין, סטרפטומיצין ו 10% סרום בפרה העובר (FBS) ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    3. להשעות 1 x 106 תאים ב 50 μl של פוספט מאגור פוספטים (PBS) ב 4 ° c.
  2. תא החיסון לתוך מאגפים של עכברים
    1. מערבבים את התאים עם אותה כמות של מטריצת קרום המרתף. לדוגמה, להוסיף 1 x 106 תאים ב 50 ΜL של PBS כדי 50 μl של מטריצה קרום המרתף (ראה טבלת חומרים) ולערבב בעדינות.
      הערה
    2. הכנס 100 μL של המדגם (תאים ב-PBS + המרתף ממברנה הממברנה) תת-עורי לתוך האגף השמאלי של החיסוני 6-שבוע-בן BALB/c נו/נו עכברים באמצעות מזרק 1 מ"ל אינסולין עם 27g 1/2 ' ' (0.4 x13 mm) מחט.
  3. טיפול antagomiR.
    1. השהה את antagomiR (ראה טבלת חומרים) או את השליטה השלילית ב-500 μl של מים מזוקקים חינם RNase.
    2. לפני ההזרקה, להכין 2 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב (ראה לוח חומרים) עבור כל זריקה.
      1. ראשית לערבב את הפתרון antagomiR (ראה טבלת חומרים) ואת מאגר complexation (ראה לוח חומרים) ביחס 1:1. לדוגמה, להוסיף 80 μL של הפתרון miRNA-מעכב (16 nmol) ל 80 μL של complexation מאגר (כלול בערכה vivo משלוח משלוחים, ראה טבלת חומרים).
      2. הביאו את האספקה הvivo. הכימית לטמפרטורת החדר הוסף 160 μL ל שפופרת 1.5-mL ומיד להוסיף 160 μL של פתרון antagomiR מדולל. החזר את התוספת הכימית ל-20 ° c. במקרה הצורך, יש לאחסן את המנה הכימית ב-4 ° צ' למשך שבוע לאחר הפשרה.
      3. מערבולת מיד (10 s) כדי להבטיח complexation של vivo משלוח מגיב-antagomiR.
      4. מודטה the vivo משלוח מגיב antagomiR תערובת במשך 30 דקות ב 50 ° c. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לשחזר את המדגם.
      5. לדלל את מורכבות 6-קיפול על-ידי הוספת 1360 μL של PBS pH 7.4 ומערבבים היטב.
      6. המשך עם משלוח vivo של מתחם הantagomiR-מגיב (8 עכברים/תנאי), או אחסן את הקומפלקס ב -4 ° צ' עד שבוע לפני ההזרקה. הכנס 200 μL מוסרית לכל גידול (2 nmol של antagomiR).
        הערה: אמצעי האחסון והכמות של antagomiR אינו תלוי בעוצמת הגידול.
    3. לבצע את הטיפול 3 פעמים בכל שבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך 2 שבועות.
  4. ניתוח גידול בגידולים
    1. הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב (ראה טבלת חומרים) תת-עורי בכל נקודת זמן עם מזרק 1 מ ל עם שולחן 27g 1/2 ' ' (0.4 mm x 13 מ"מ) מחט.
      1. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן. להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.
      2. החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
    2. צלם את האות הביולומיאלי עם תוכנת הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים).
      הערה: אפשר להשתמש גם כדי למדוד את נפח הגידול ואת צמיחת הגידול.
    3. לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.
  5. כריתה של הגידול
    1. שבעה ימים לאחר סיום הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.

2. בלוטת התריס אורתוטופית של תאים וטיפול antagomiR מערכתי

  1. הכנה לתאים
    1. מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא כדי לבטא מבנה טרנסגניים המבטא באופן מוגזם GFP ו לluciferase. בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.
    2. לגדל תאים אלה בתוספת DMEM עם אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) ו-10% FBS ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    3. להשעות 1 x 105 תאים 5 ΜL של PBS.
  2. תא החיסון לבלוטת התריס של עכברים
    1. הכנס 100 μL של כאבים (בופרינורפין) ו 100 μL של אנטיביוטיקה (צפלוספורין) תת-עורי לתוך 7-שבוע בן BALB/c נו/נו עכברים. לחטא את אתר ההזרקה. עם אלכוהול
    2. הכנס 5 μL של פתרון התא לתוך בלוטת התריס של העכברים.
      1. לשים את העכבר באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ולמקם אותו תחת stereomicroscope בארון זרימה סטרילית.  להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.
      2. החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
      3. עבור כל עכבר, לחטא את הצוואר עם שפתי-העין ולעשות חתך של המשוער 2 ס מ בעור עם מספריים. לפתוח פעם, לחשוף את הצוואר על ידי העקירה של בלוטות הרוק.
      4. לנתח את שרירי הרצועה באמצעות מלקחיים ו/או מספריים לחשוף את קנה הנשימה ואת בלוטת התריס. באמצעות הזרקת מזרק מיקרולויטר 10 μL 5 μL של פתרון התא לתוך כדורית בלוטת התריס הימנית, ממוקם בצד של הסחוס cricoid.
      5. למקם מחדש את בלוטות הרוק ולתפור את החתך עם משי באמצעות התפר קלוע, מצופה, לא נספגים תפרים.
      6. הוסף שפתי-על לאזור הפצע ולמקם את העכבר על שמיכה תרמיים בזמן שהוא מתאושש מן ההרדמה.
    3. למחרת לאחר ניתוח, להזריק תת-עורי משכך כאבים (buprenorphine) ולהוסיף 3 מ ל איבופרופן נוזלי (40 mg/mL) לתוך 250 mL של מי שתייה במשך 1 שבוע.
  3. AntagomiR מערכתית טיפול
    הערה: בצע שלב זה 2-3 שבועות לאחר הזרקת התא, כאשר האות הביולומיאלי נמצא בזיהוי.
    1. השהה את antagomiR או את השליטה השלילית במים מזוקקים RNase-free.
    2. לפני הזריקה, להכין 7 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב עבור כל זריקה.
      1. עבור antagomiR ו ב vivo מסירה הכנה הפתרון מגיב לראות שלב 1.3 אבל להוסיף 7 nmol של מעכב miRNA לכל עכבר.
    3. מנהל את הפתרון באופן מבוקר על ידי הזרקה רטרו מסלולית של הסינוס ורידים של העכבר. בסדר.
      הערה: להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (צביטה הבוהן המשרד).
    4. פנקו את העכברים 3 פעמים בשבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך שבועיים.
  4. ניתוח גידול בגידולים
    1. לקבוע את אות הגידול הביולומיאלי פעמיים בשבוע כדי לחשב את צמיחת הגידול.
      1. הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב בכל נקודת זמן באמצעות הזרקה תת עורית.
      2. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ותמונה האות ביולומינטיום עם תוכנת דימות vivo.
    2. לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.
  5. כריתה של הגידול
    1. שבעה ימים לאחר סיום תקופת הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו שני מודלים עכברים שונים כדי לקבוע אם נטרול של miRNA יכול לדכא את צמיחת הגידול. לכן, הגידול האנושי בלוטת התריס Cal62-לוק תאים היו תת-עורי וזרק לתוך מאגפים של עכברים ערומים כדי ליצור דגם xenograph. לאחר שבועיים הוקמו גידולים וניתן למדוד אותם בעזרת מחוגות. בשלב זה, עכברים הוזרקו מבחינה מוסרית עם מיר-146b-מעכבי, או שליטה מתאימה, ואת נפח הגידול היה בעקבות שבועיים נוספים (איור 1A). כפי שמוצג באיור 1B, הצמיחה של גידולים intratumorally מוסרית הוזרק עם מיר-146b-מעכב (anti-146b) (n = 8) הייתה מדוכא באופן משמעותי ביחס לקבוצת הבקרה השלילית (n = 4) או קבוצת הבקרה מלוחים (לא מוצג). miRNAs הם תכונה חשובה של רגולציה גנים, כפי שהם מווסת מספר mRNAs היעד. לכן, oncomiRs הם הרגולטורים חשובים של גנים מדכא הגידול. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של רמות ביטוי intratumoral של גנים אלה, אשר ניתן לבדוק לאחר הטיפול עם miRNA-מעכבי. בנוסף, רמות של כמה סמנים התפשטות יכול להיות גם למד, מומחש על ידי הביטוי התחתון של אנטיגן מתרבים התא הגרעיני (PCNA) ב-antagomiR מטופלים גידולים מאשר שליטה מטופלים גידולים (איור 2). גם את ההתאוששות של מטרות miRNA ניתן לחקור באמצעות ניתוח של הגידול-RNA שחולצו או חלבון, כפי מומחש על ידי הביטוי הגבוה יותר של PTEN ב antagomiR (anti-146b) מטופלים גידולים (איור 2). באופן קולקטיבי, נתונים אלה חושפים כי בעיכוב vivo של miRNA יעיל יכול להיות מנוצלת מבחינה רפואית לטיפול בסרטן בלוטת התריס.

כדי להעריך טוב יותר את הפוטנציאל התרפויטי של miRNA-מעכבי ולשפר את מודל העכבר, יצרנו מודל אורתוטופית, שבו הגידול האנושי בלוטת התריס Cal62-לוק היו במישרין באונה הימנית של עכברים ערומים. לאחר 3 שבועות, גידולים בלוטת התריס הוקמו, כפי שהפגינו על ידי אותות biלומינסנציה בצוואר של עכברים ועל ידי ניתוח רקמות ברוטו ואימונוהיסטוכימיה, עם המטאוקסילין ו-אאוזין ו GFP של תאים, מכבד את העיבוד. כפי שמוצג באיור 3, התאים האפיתל המקיפים את קולואיד להפגין את הארכיטקטורה בלוטת התריס זקיק מהעכבר. תאים GFP-חיוביים בתוספת עם זקיקי, חד-משמעית הוכחת כי התאים האנושיים Cal62 הוזרק כראוי מתרבים בתוך בלוטת התריס של העכבר. לאחר גידולים נוצרו, הזרקנו 13 עכברים באופן מבוקר עם מיר-146b-מעכב (n = 8) או שליטה מתאימה (n = 5), ואת נפח הגידול היה בעקבות שבועיים נוספים (איור 4A). מצאנו כי צמיחת הגידול הצטמצמה באופן משמעותי בקבוצה מערכתית antagomiR-שטופלו (איור 4B). בעיקר, את הביטוי של ה146b מתואר מחדש מיר-היעד DICER1 בגידול הראשוני הוגדלה לאחר הטיפול אנטי מיר-146b (איור 5). נתונים אלה מדגימים כי עיכוב של ביטוי מירדוגני ולכן שחזור של גנים היעד שלה יכול לשמש כטיפול בסרטן בלוטת התריס16,17.

Figure 1
איור 1. מיר-146b-מעכב פוגע הקים גידול אנושי בבלוטת התריס. Cal62-לוציפראז המבטא תאים (Cal62-לוק) הזריקו תת-עורי. לאחר הוקמו xenografts, מעכבי מיר סינתטי (anti-146b) (n = 8) או שליטה שלילית (n = 4) היה מנוהל מבחינה מוסרית. (א) ציר זמן. (ב) משמאל: התמונה מציגה את האות ביולובידאת נקודת הקצה של הגידולים שטופלו הדמיה עם תוכנת הדמיה vivo. מימין: הגרף מראה זוהר הגידול להגדיל בזמנים המצוין ב xenografts מתחילת הטיפול עם miRNA-מעכבי (אפור כהה) או את השליטה השלילית (אפור). (ג) ייצוג של גידול זוהר נקודת הקצה של גידולים שטופלו. ערכים מייצגים ממוצע ± SEM. * p < 0.05; * * p < 0.01. הדמות הותאמה מראמרס-מויה ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. ביטוי חלבון PCNA פוחתת ו PTEN ביטוי חלבון עולה בגידולים מיר-146b-מעכב-טיפול. חלבון מן הגידולים שטופלו בשליטה או מיר-146b מעכב התקבל עבור בלוק המערבי עם נוגדנים PCNA או PTEN. הדמות הותאמה מראמרס-מויה ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. זקיקי התריס של העכבר intratumoral במודל הנושא אורתוקטבי. צביעת עם המטאוקסילין ו אאוזין (הפאנל העליון) או נוגדן GFP (הפאנל התחתון) של העכברים אורתוטופית גידולים 28 ימים לאחר החיסון עם תאים Cal62-לוק GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. מיר-146b-מעכב פוגע הקים גידול אנושי בבלוטת התריס. Cal62-לוציפראז המבטא תאים (Cal62-לוק) הוזרק בלוטת התריס של העכברים. לאחר גידולים הוקמו (3 שבועות), מירנה סינתטי-מעכבי (anti-146b) (n = 8) או שליטה שלילית (n = 5) היה מנוהל באופן מערכתית. (א) ציר זמן. (ב) משמאל: התמונה מציגה את האות ביולובידאת נקודת הקצה של הגידולים שטופלו הדמיה עם תוכנת הדמיה vivo. מימין: הגרף מראה הזוהר הגידול להגדיל בזמנים המצוין מתחילת הטיפול עם מגדל miRNA (כחול) או שליטה שלילית (ירוק). (ג) ייצוג של גידול זוהר נקודת הקצה של גידולים שטופלו. ערכים מייצגים ממוצע ± SEM. * p < 0.05. הדמות הותאמה מראמרס-מויה ואח '17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. DICER1 ביטוי חלבון גדל בגידולים מיר-146b-מעכבי מטופלים. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן DICER1 בגידולים אורתודטופית לאחר הטיפול עם מיר-146b-inhbitor או שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נייר זה מתאר שיטה ללמוד בפונקציה vivo של miRNA כדי להבין טוב יותר את תפקידה בייזום הגידול והתקדמות, ואת הפוטנציאל שלה כיעד טיפולית בסרטן בלוטת התריס. מודלים מבע הגידול כאן מבוססים על השימוש בתאים שניתן מעקב על ידי האות הביולומינציה שלהם, המתיר את המדידה של גידול בגידול בvivo תחת השפעת הטיפול. בנוסף, אנו מתארים את השימוש בטיפול miRNA מבוסס על סרטן בלוטת התריס, אשר כרגע בשלבים המוקדמים.

בדקנו לראשונה את הכדאיות של miRNA כיעד טיפולית באמצעות מודל השתלת תת עורית, שבו תאים סרטניים בבלוטת התריס הוזרק לתוך מאגפים של עכברים לקויה. לאחר מכן הזרקנו. מוסרית לantagomiR מודל זה יכול לשמש עבור מספר סוגי סרטן כדי לבדוק את המשמעות של miRNAs או oncomiRs ספציפיים ב vivo בתאי סרטן אנושיים. היתרונות של טכניקה זו הם כי היא פשוטה יחסית לבצע וגם מהירה, עם סבל בעלי חיים מינימליים. החיסרון העיקרי של הטכניקה, עם זאת, הוא שהוא אינו מחקה היטב את המצב האנושי בגלל התאים מוזרק תת-עורי ולא לתוך איבר המוצא. כדי להתגבר על מגבלה זו, השתמשנו מודל חזק יותר על ידי ביצוע השתלת כירורגית אורתוטופית של תאים סרטניים בלוטת התריס לתוך בלוטת התריס של העכברים. למרות טכניקה זו היא מסובכת יותר זמן רב, זה מאפשר את המחקר של גידול גידול בסביבה "יליד" שלה, בלוטת התריס. חוזק של שיטה זו היא כי היא מאפשרת את המחקר של הפצת תא מוסרי כמו גרורות, בדרך כלל בריאות, אשר ניתן להעריך עם vivo תוכנה הדמיה. כוח נוסף הוא כי המסירה מערכתית של antagomiR מחקה טיפול אנושי פוטנציאלי מאפשר ניתוח של תגובת בלוטת התריס. יתר על כן, הזרקה מערכתית של antagomiR לא לגרום להשפעות שליליות על בעלי חיים, כמו פרמטרים כמו רמות הגלוקוז סרום או מורפולוגיה של הכבד לא שונו17.

. יש כמה צעדים קריטיים במודל העכבר האורתודינאלית, ההזרקה של תאים מוסריים צריך להתבצע בדיוק בבלוטת התריס ולא ברקמה השכנה. לכן, יש צורך להפגין עם אימונוהיסטוכימיה כי האדריכלות בלוטת התריס נשמרת וכי התאים הזריקו לחדור את בלוטת התריס ואינם מציגים עם בלוטת. בנוסף, עבור שני מודלים מבע ו אורתודביט, גודל הגידולים בקבוצות שונות של בעלי חיים צריך להיות דומה בתחילת הטיפול כדי לעקוב אחר דפוס הצמיחה דומה בכל המקרים. לבסוף, חשוב להדגים כי הביטוי של מטרות המטה של מיקרוארנה (במקרה שלנו מיר-146b) משתנים לאחר antagomiR טיפול

כיישום אפשרי בעתיד של מודל זה, תאי החולה יכול להיות מוזרק לתוך מודלים העכבר כדי לנתח כיצד עיכוב של miRNA יכול להשפיע על צמיחת הגידול של מטופל ספציפי, גישה שימושית עבור דיוק ורפואה אישית מבוסס על . כן, מירנאס

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לרקל ארצ'ה ריסקו על עזרתה בטיפול ובדאגה לעכברים. אנו מודים ד ר. J. בלאנקו (המכון הקטלוני לכימיה מראש-CSIC) ו ד ר. מאטו (מכון דה Reserca de l ' בית החולים דה לה סנטה Creu אני סנט פאו) ברצלונה (ספרד) עבור gifting של CSIC-גחלילית לוק-IRES-EGFP ו Cal62-לוק תאים, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor Thermo Fisher 4464088 In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration Corning #354248
DICER antibody Abcam ab14601 IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent Thermo Fisher IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 Thermo Fisher 4464077 In Vivo Ready
PCNA antibody Abcam ab92552 WB: 1/2,000
PTEN antibody Santa Cruz sc-7974 WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122799 Diluted in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
  3. Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
  4. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  5. Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
  6. Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
  7. Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
  8. Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
  9. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
  10. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
  11. Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
  12. Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
  13. Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
  14. Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
  15. Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
  16. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
  17. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , In press (2019).
  18. Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 150 מעכב miRNA בלוטת התריס גידול בגידולים העכבר מודלים מבוססי miRNA טיפול מיר-146b סרטן בלוטת התריס
ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L.,… More

Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Acuña-Ruiz, A., Zaballos, M. A., Santisteban, P. In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59322, doi:10.3791/59322 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter