Summary
Dieses Protokoll beschreibt Xenograft- und orthotopische Mausmodelle der menschlichen Schilddrüsentumorigenese als Plattform, um mikroRNA-basierte Inhibitorbehandlungen zu testen. Dieser Ansatz ist ideal, um die Funktion nicht-kodierender RNAs und ihr Potenzial als neue therapeutische Ziele zu untersuchen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression durch ihre Fähigkeit, mRNA zu destabilisieren und die Translation von Ziel-mRNAs zu hemmen. Eine ständig wachsende Anzahl von Studien hat miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie als therapeutische Ziele identifiziert, was der Krebsbewertung und -behandlung eine zusätzliche Dimension hinzufügt. Im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs resultiert die Tumorgenese nicht nur aus Mutationen in wichtigen Genen, sondern auch aus der Überexpression vieler miRNAs. Dementsprechend entwickelt sich die Rolle von miRNAs bei der Kontrolle der Schilddrüsen-Genexpression als wichtiger Mechanismus bei Krebs. Hierbei stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirkung der miRNA-Hemmer-Verabreichung als therapeutische Modalität bei Schilddrüsenkrebs mit menschlichen Tumor-Xenograft- und orthotopischen Mausmodellen zu untersuchen. Nach der Entwicklung stabiler Schilddrüsentumorzellen, die GFP und Luziferase exezieren, werden Zellen in nackte Mäuse injiziert, um Tumore zu entwickeln, denen Biolumineszenz folgen kann. Die In-vivo-Hemmung einer miRNA kann das Tumorwachstum reduzieren und miRNA-Genziele hochregulieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Bedeutung einer bestimmten miRNA in vivo zu bewerten, zusätzlich zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.
Introduction
Schilddrüsenkrebs ist eine endokrine Malignität mit zunehmender Inzidenz, obwohl sie im Allgemeinen ein gutes Ergebnis hat1. Dennoch entwickeln einige Patienten aggressive Formen der Krankheit, die nicht behandelbar sind und die molekularen Grundlagen sind schlecht verstanden2.
miRNAs sind 22-Nukleotid-lange nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression in vielen Geweben regulieren, typischerweise durch Basispaarbindung an die 3' untranslationale Region (3'UTR) von Target Messenger RNAs (mRNAs), die mRNA-Abbau oder translationale Repression auslösen 3 , 4. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Deregulierung der microRNA-Expression ein Kennzeichen von Krebs ist, da diese Moleküle proliferative Signalisierung, Migration, Invasion und Metastasierung modulieren und Resistenzen gegen Apoptose bieten können. 5,6. In den letzten Jahren haben viele Studien miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie therapeutische Ziele7identifiziert, die eine neue Dimension für die Krebsbewertung und -behandlung bieten.
miRNAs haben in der humanen molekularen Onkologie als Schlüsseltreiber der menschlichen Schilddrüsenneoplasmen8,9,10,11,12. Unter den miRNAs up-reguliert, miR-146b ist stark überexprimiert in Papillarschildkarzinom (PTC) Tumoren und wurde gezeigt, dass signifikant erhöhen Zellproliferation, und mit Aggressivität und trostlosen Prognose assoziiert werden6, 12 , 13 , 14 , 15. Darüber hinaus reguliert miR-146b mehrere Schilddrüsengene, die an der Differenzierung beteiligt sind12, sowie wichtige Tumorsuppressorgene wie PTEN16 und DICER117. Trotz ihrer Bedeutung in der Krebsbiologie befindet sich die miRNA-basierte Krebstherapie noch in den Anfängen, und nur sehr wenige Studien haben sich mit Schilddrüsenkrebs befasst - der häufigste der endokrinen Tumoren18. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit zwei verschiedenen Mausmodellen mit vom Menschen abgeleiteten Tumoren, bei dem die Verabreichung eines synthetischen miRNA-Hemmers (AntagomiR), der speziell eine zelluläre miRNA hemmt, das Tumorwachstum blockieren kann. Wir verwendeten zuerst ein gemeinsames Xenograft-Modell, und die lokale Intratumor-Verabreichung eines AntagomiR verringerte das Tumorwachstum gemessen als eine Reduktion der Tumorbiolumineszenz16. Da die Etablierung robuster Mausmodelle, die die Progression des menschlichen Tumors imitieren, unerlässlich ist, um einzigartige therapeutische Ansätze zu entwickeln, ist die orthotopische Implantation primärer menschlicher Tumoren eine wertvollere Plattform für die klinische Validierung neuer Medikamente als subkutane Implantationsmodelle. Um das therapeutische Potenzial der AntagomiR besser einschätzen zu können, haben wir daher ein orthotopisches Mausmodell mit systemischer Entbindung im Blutstrom verwendet, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Gemeinschaftsrecht (86/609/EWG) und dem spanischen Gesetz (R.D. 1201/2005) mit Zustimmung der Ethikkommission des Consejo Superior de Investigaciones Cientéficas (CSIC, Spanien) durchgeführt.
1. Flankenimpfung von Zellen und intratumorale AntagomiR-Behandlung
- Zellvorbereitung
- Entwickeln Sie eine Cal62-Humanschilddrüsenkrebs-Zelllinie (KRASG12R und p53A161D-Mutationen), um ein transgenes Konstrukt zu überprimieren, das GFP und Luziferase konstitutiv ausdrückt (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Wählen Sie die transgenen Zellen nach Antibiotikaresistenz oder durch Sortieren der GFP-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie.
- Wachsen Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch Penicillin, Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5%CO2.
- 1 x 106 Zellen in 50 l Phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 4 °C aussetzen.
- Zellimpfung in die Flanken von Mäusen
- Mischen Sie die Zellen mit der gleichen Menge an Kellermembranmatrix. Fügen Sie z. B. 1 x 106 Zellen in 50 l PBS zu 50 l Kellermembranmatrix hinzu (siehe Tabelle der Materialien) und mischen Sie sie vorsichtig.
notiz: - Subkutan 100 l der Probe (Zellen in PBS + Kellermembranmatrix) in die linke Flanke von 6 Wochen alten immundefizienten BALB/c nu/nu-Mäusen mit einer 1 ml Insulinspritze mit einer 27G 1'2'' (0,4x13 mm) Nadel.
- Mischen Sie die Zellen mit der gleichen Menge an Kellermembranmatrix. Fügen Sie z. B. 1 x 106 Zellen in 50 l PBS zu 50 l Kellermembranmatrix hinzu (siehe Tabelle der Materialien) und mischen Sie sie vorsichtig.
- Intratumorale AntagomiR-Behandlung.
- Setzen Sie die AntagomiR (siehe Materialtabelle) oder die Negativkontrolle in 500 l RNase-freiem destilliertem Wasser aus.
- Bereiten Sie vor der Injektion 2 nmol des AntagomiR oder die Kontrolle zusammen mit einem In-vivo-Abgabereagenz (siehe Materialtabelle) für jede Injektion vor.
- Mischen Sie zunächst die AntagomiR-Lösung (siehe Materialtabelle)und den Komplexierungspuffer (siehe Materialtabelle)im Verhältnis 1:1. Fügen Sie z. B. 80 L miRNA-Hemmerlösung (16 nmol) zu 80 L Komplexierungspuffer hinzu (im In-vivo-Lieferreagenz-Kit enthalten, siehe Tabelle der Materialien).
- Bringen Sie das In-vivo-Lieferreagenz auf Raumtemperatur. Fügen Sie 160 l in ein 1,5-ml-Rohr und sofort 160 l verdünnte AntagomiR-Lösung hinzu. Restreagenz auf -20 °C zurückgeben. Bei Bedarf das Reagenz nach dem Auftauen bis zu einer Woche bei 4 °C lagern.
- Wirbel sofort (10 s) zur Sicherstellung der Komplexierung der In-vivo-Abgabe Reagenz-AntagomiR.
- Inkubieren Sie das in vivo-Lieferreagem-AntagomiR-Gemisch 30 min bei 50 °C. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz, um die Probe wiederherzustellen.
- Verdünnen Sie den Komplex 6-fach, indem Sie 1360 l PBS pH 7.4 hinzufügen und gut mischen.
- Fahren Sie mit der In-vivo-Lieferung des Reagenz-AntagomiR-Komplexes (8 Mäuse/Bedingung) fort, oder lagern Sie den Komplex bis zu einer Woche vor der Injektion bei 4 °C. Injizieren Sie 200 l intratumoral in jeden Tumor (2 nmol AntagomiR).
HINWEIS: Das Volumen und die Menge des AntagomiR ist unabhängig vom Tumorvolumen.
- Führen Sie die Behandlung 3 Mal pro Woche (Montag, Mittwoch und Freitag) für 2 Wochen.
- Analyse des Tumorwachstums
- Mit einer 1 ml Spritze mit einer 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) Nadel werden 50 l einer 40 mg/ml-Lösung des D-Luziferin-Substrats (siehe Materialtabelle)subkutan zu jedem Zeitpunkt injiziert.
- Nach 8 min Nachinjektion die Mäuse mit 3% Isofluran mit Sauerstoff vermischt anästhesieren. Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme) und passen Sie die Anästhesieabgabe entsprechend an, um die chirurgische Ebene aufrechtzuerhalten.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um austrocknung zu verhindern.
- Stellen Sie das biolumineszierende Signal mit in vivo Bildgebungssoftware ab (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Caliper können auch verwendet werden, um das Tumorvolumen und das Tumorwachstum zu messen. - Sobald die Biolumineszenzsignale erhalten sind, analysieren Sie das Tumorwachstum, indem Sie beide Behandlungen vergleichen und die Signifikanz mit einem t-Test bestimmen. Verwenden Sie das SEM, um die Varianz innerhalb der Gruppe zu analysieren.
- Mit einer 1 ml Spritze mit einer 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) Nadel werden 50 l einer 40 mg/ml-Lösung des D-Luziferin-Substrats (siehe Materialtabelle)subkutan zu jedem Zeitpunkt injiziert.
- Tumorexzision
- Sieben Tage nach dem Ende der AntagomiR-Behandlung opfern Sie die Mäuse, verbrauchen den Tumor und extrahieren Protein und/oder RNA für zukünftige Analysen. Alternativ, Abschnitt der Tumoren und fixieren Sie sie für die Immunhistochemie.
2. Schilddrüse orthotopische Inokulation von Zellen und systemische AntagomiR-Behandlung
- Zellvorbereitung
- Entwickeln Sie eine Cal62 menschliche Schilddrüsenkrebs-Zelllinie, um ein transgenes Konstrukt zu überprimieren, das GFP und Luziferase konstitutiv ausdrückt. Wählen Sie die transgenen Zellen nach Antibiotikaresistenz oder durch Sortieren der GFP-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie.
- Wachsen Sie diese Zellen in DMEM, ergänzt mit Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) und 10% FBS bei 37 °C und 5%CO2.
- 1 x 105 Zellen in 5 l PBS suspendieren.
- Zellimpfung in die Schilddrüse von Mäusen
- Injizieren Sie 100 l Analgetika (Buprenorphin) und 100 l Antibiotikum (Cephalosporin) subkutan in 7 Wochen alte BALB/c nu/nu Mäuse. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Alkohol.
- Injizieren Sie 5 l der Zelllösung in die Schilddrüse der Mäuse.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit 3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt und legen Sie es unter einem Stereomikroskop in einem sterilen Durchflussschrank. Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme) und passen Sie die Anästhesieabgabe entsprechend an, um die chirurgische Ebene aufrechtzuerhalten.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um austrocknung zu verhindern.
- Für jede Maus, desinfizieren Sie den Hals mit Iodopovidon und machen Einen Schnitt von ca. 2 cm in der Haut mit der Schere. Sobald geöffnet, entblößen Sie den Hals, indem Sie die Speicheldrüsen verdrängen.
- Sezieren Sie die Riemenmuskeln mit Sezieren Zangen und / oder Schere, um die Luftröhre und die Schilddrüse auszusetzen. Mit einer 10-L-Mikroliterspritze injizieren Sie 5 l der Zelllösung in den rechten Schilddrüsen-Lobul, der sich an der Seite des Cricoid-Knorpels befindet.
- Positionieren Sie die Speicheldrüsen neu und veransen Sie den Schnitt mit Seide mit geflochtenen, beschichteten, nicht resorbierbaren Nähten.
- Fügen Sie Iodopovidon in den Wundbereich und legen Sie die Maus auf eine thermische Decke, während es sich von der Anästhesie erholt.
- Am nächsten Tag nach der Operation subkutan analgetisch (Buprenorphin) injizieren und 3 ml flüssiges Ibuprofen (40 mg/ml) 1 Woche lang in 250 ml Trinkwasser geben.
- Systemische AntagomiR Behandlung
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt 2-3 Wochen nach der Zellinjektion durch, wenn das biolumineszierende Signal nachweisbar ist.- Setzen Sie die AntagomiR oder die Negativkontrolle in destilliertem RNase-freiem Wasser aus.
- Bereiten Sie vor der Injektion 7 nmol des AntagomiR oder der Kontrolle zusammen mit dem In-vivo-Abgabereagenz für jede Injektion vor.
- Für die AntagomiR und die In-vivo-Abgabe-Reagenz-Lösung s siehe Schritt 1.3, aber 7 nmol des miRNA-Hemmers pro Maus hinzufügen.
- Die Lösung intravenös durch retro-orbitale Injektion der venösen Sinus der Maus verabreichen. Verwenden Sie Isofluran, um Anästhesie zu induzieren.
HINWEIS: Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme). - Behandeln Sie die Mäuse 3 mal pro Woche (Montag, Mittwoch und Freitag) für 2 Wochen.
- Analyse des Tumorwachstums
- Bestimmen Sie das Tumorbiolumineszenzsignal zweimal wöchentlich, um das Tumorwachstum zu berechnen.
- Injizieren Sie 50 l einer 40 mg/ml Lösung des D-Luziferin-Substrats zu jedem Zeitpunkt durch subkutane Injektion.
- Nach 8 min Nachinjektion die Mäuse mit 3% Isofluran gemischt mit Sauerstoff ansien und das biolumineszierende Signal mit in vivo Bildgebungssoftware abbilden.
- Sobald die Biolumineszenzsignale erhalten sind, analysieren Sie das Tumorwachstum, indem Sie beide Behandlungen vergleichen und die Signifikanz mit einem t-Test bestimmen. Verwenden Sie das SEM, um die Varianz innerhalb der Gruppe zu analysieren.
- Bestimmen Sie das Tumorbiolumineszenzsignal zweimal wöchentlich, um das Tumorwachstum zu berechnen.
- Tumorexzision
- Sieben Tage nach dem Ende der AntagomiR-Behandlungsphase opfern Sie die Mäuse, verbrauchen den Tumor und extrahieren Protein und/oder RNA für zukünftige Analysen. Alternativ, Abschnitt der Tumoren und fixieren Sie sie für die Immunhistochemie.
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Representative Results
Wir verwendeten zwei verschiedene Mäusemodelle, um zu bestimmen, ob die Neutralisation einer miRNA das Tumorwachstum unterdrücken könnte. Dementsprechend wurden die menschlichen Tumorschild-Cal62-luc-Zellen subkutan in die Flanken von Nacktmäusen injiziert, um ein Xenographenmodell zu erzeugen. Nach zwei Wochen wurden Tumore festgestellt und konnten mit Sätteln gemessen werden. Zu diesem Zeitpunkt wurden Mäuse intratumoral mit dem miR-146b-Hemmer injiziert, oder eine entsprechende Kontrolle, und das Tumorvolumen wurde für weitere zwei Wochen verfolgt (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1Bdargestellt, wurde das Wachstum von Tumoren, die intratumoral mit dem miR-146b-Hemmer (anti-146b) (n=8) injiziert wurden, in Bezug auf die negative Kontrollgruppe (n=4) oder die Kochungskontrollgruppe (nicht dargestellt) signifikant unterdrückt. miRNAs sind ein wichtiges Merkmal der Genregulation, da sie mehrere Ziel-mRNAs regulieren. Dementsprechend sind OncomiRs wichtige Regulatoren von Tumorsuppressor-Genen. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der intratumoralen Expressionsniveaus dieser Gene, die nach der Behandlung mit dem miRNA-Hemmer getestet werden können. Darüber hinaus können auch die Konzentrationen einiger Proliferationsmarker untersucht werden, die durch die geringere Expression von proliferierendem Zellkernantigen (PCNA) in antagomiR-behandelten Tumoren veranschaulicht werden als bei kontrollbehandelten Tumoren (Abbildung 2). Auch die Wiederherstellung der miRNA-Targets kann durch die Analyse von tumorextrahierter RNA oder Protein untersucht werden, wie die höhere Expression von PTEN in den antagomiR(anti-146b) behandelten Tumoren zeigt (Abbildung 2). Zusammen zeigen diese Daten, dass die In-vivo-Hemmung einer miRNA wirksam ist und therapeutisch für die Behandlung von Schilddrüsenkrebs genutzt werden kann.
Um das therapeutische Potenzial eines miRNA-Hemmers besser einschätzen und das Mausmodell zu verbessern, haben wir ein orthotopisches Modell entwickelt, bei dem menschliche Tumorschild-Cal62-luc-Zellen direkt in den rechten Schilddrüsenlappen von Nacktmäusen gesät wurden. Nach 3 Wochen wurden die Schilddrüsentumoren festgestellt, wie Biolumineszenzsignale im Hals der Mäuse und durch grobe Gewebeanalyse und Immunhistochemie, mit Hämatoxylin und Eosin und GFP-Färbung von Zellen, respektvoll, demonstrierten. Wie in Abbildung 3dargestellt, zeigen die Epithelzellen, die das Kolloid umgeben, die Schilddrüsenfollikelarchitektur von der Maus aus. GFP-positive Zellen, die mit den Follikel durchsetzt sind, zeigen eindeutig, dass menschliche Cal62-Zellen richtig injiziert wurden und sich innerhalb der Schilddrüse der Maus vermehren. Sobald die Tumoren gebildet wurden, injizierten wir 13 Mäuse intravenös mit dem miR-146b-Hemmer (n=8) oder einer geeigneten Kontrolle (n=5), und das Tumorvolumen wurde für weitere zwei Wochen verfolgt (Abbildung 4A). Wir fanden heraus, dass das Tumorwachstum in der systemischen AntagomiR-behandelten Gruppe signifikant verringert wurde (Abbildung 4B). Insbesondere wurde die Expression des neu beschriebenen miR-146b-Target DICER1 im Primärtumor nach der Anti-miR-146b-Behandlung erhöht (Abbildung 5). Diese Daten zeigen, dass die Hemmung der endogenen miRNA-Expression und damit die Wiederherstellung ihrer Zielgene als Therapie bei Schilddrüsenkrebs16,17verwendet werden könnte.
Abbildung 1. Der miR-146b-Hemmer beeinträchtigt das etablierte Wachstum des Schilddrüsentumors. Cal62-Luciferase-exzierende Zellen (Cal62-luc) wurden subkutan injiziert. Nach der Etablierung von Xenografts wurde ein synthetischer miR-Hemmer (anti-146b) (n=8) oder eine Negative Kontrolle (n=4) intratumoral verabreicht. (A) Zeitleiste. (B) Links: Das Bild zeigt das Biolumineszenzsignal der behandelten Tumoren, das mit in vivo Bildgebungssoftware abgebildet ist. Rechts: Die Grafik zeigt die Erhöhung der Tumorstrahlung zu den angegebenen Zeiten in Xenografts ab Behandlungsbeginn mit dem miRNA-Hemmer (dunkelgrau) oder der Negativkontrolle (grau). (C) Darstellung der Endpunktstrahlungszunahme der behandelten Tumoren. Die Werte stehen für den Mittelwert von SEM. *p < 0,05; **p <0.01. Figur angepasst von Ramérez-Moya et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. PCNA-Proteinexpression nimmt ab und PTEN-Proteinexpression nimmt bei miR-146b-Inhibitor-behandelten Tumoren zu. Protein aus den mit Kontrolle oder miR-146b-Inhibitor behandelten Tumoren wurde für die westliche Blotting mit Antikörpern gegen PCNA oder PTEN erhalten. Figur angepasst von Ramérez-Moya et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Intratumorale Maus Schilddrüsenfollikel im orthotopischen Modell. Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (Obere Platte) und oder einem Antikörper gegen GFP (Unterplatte) der orthotopischen Mäusetumoren 28 Tage nach der Impfung mit Cal62-luc GFP-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Der miR-146b-Hemmer beeinträchtigt das etablierte Wachstum des Schilddrüsentumors. Cal62-Luciferase-exzierende Zellen (Cal62-luc) wurden in die Schilddrüse der Mäuse injiziert. Nach dem Aufstellen der Tumoren (3 Wochen) wurde ein synthetischer miRNA-Hemmer (anti-146b) (n=8) oder eine Negative Kontrolle (n=5) systemisch verabreicht. (A) Zeitleiste. (B) Links: Das Bild zeigt das Biolumineszenzsignal der behandelten Tumoren, das mit in vivo Bildgebungssoftware abgebildet ist. Rechts: Die Grafik zeigt die Erhöhung der Tumorstrahlung zu den angegebenen Zeiten ab Behandlungsbeginn mit dem miRNA-Hemmer (blau) oder der Negativkontrolle (grün). (C) Darstellung der Endpunktstrahlungszunahme der behandelten Tumoren. Die Werte stehen für den Mittelwert von SEM. *p < 0,05. Figur angepasst von Ramérez-Moya et al.17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. DIE DICER1-Proteinexpression nimmt bei miR-146b-Inhibitor-behandelten Tumoren zu. Immunhistochemie mit einem DICER1-Antikörper in den orthotopischen Tumoren nach Behandlung mit miR-146b-Inhbitor oder Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung der In-vivo-Funktion einer miRNA, um ihre Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression und ihr Potenzial als therapeutisches Ziel bei Schilddrüsenkrebs besser zu verstehen. Die hier beschriebenen Tumor-Xenograft-Modelle basieren auf der Verwendung von Zellen, die durch ihr Biolumineszenzsignal verfolgt werden können, was die Messung des Tumorwachstums in vivo unter dem Einfluss einer Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Verwendung einer miRNA-basierten Behandlung für Schilddrüsenkrebs, die sich derzeit in den frühen Stadien befindet.
Wir testeten zunächst die Machbarkeit einer miRNA als therapeutisches Ziel mit einem subkutanen Xenograft-Modell, bei dem Schilddrüsentumorzellen in die Flanken immundefiziatter Mäuse injiziert wurden. Wir injizierten dann intratumoral die AntagomiR. Dieses Modell kann für mehrere Krebsarten verwendet werden, um die Bedeutung spezifischer miRNAs oder OncomiRs in vivo in menschlichen Krebszellen zu testen. Vorteile dieser Technik sind, dass es relativ einfach durchzuführen und auch schnell, mit minimalem Tierleid. Ein großer Nachteil der Technik ist jedoch, dass sie den menschlichen Zustand nicht genau imitiert, da die Zellen subkutan injiziert werden und nicht in das Ursprungsorgan. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendeten wir ein robusteres Modell, indem wir eine chirurgische orthotopische Implantation biolumineszierender Schilddrüsentumorzellen in die Schilddrüse der Mäuse durchführten. Obwohl diese Technik komplizierter und zeitaufwändiger ist, ermöglicht sie die Untersuchung des Tumorwachstums in seiner "nativen" Umgebung, der Schilddrüse. Eine Stärke dieser Methode ist, dass es die Untersuchung der Tumorzellverbreitung als Metastasierung ermöglicht, in der Regel in der Lunge, die mit in vivo Bildgebungssoftware ausgewertet werden kann. Eine weitere Stärke ist, dass die systemische Abgabe des AntagomiR eine potenzielle menschliche Behandlung imitiert und die Analyse der Schilddrüsenreaktion ermöglicht. Darüber hinaus verursachte die systemische Injektion des AntagomiR keine nachteiligen Auswirkungen auf die Tiere, da Parameter wie Serumglukosespiegel oder Lebermorphologie nicht verändert wurden17.
Es gibt einige kritische Schritte. Im orthotopen Mausmodell sollte die Injektion der Tumorzellen genau in der Schilddrüse und nicht im benachbarten Gewebe durchgeführt werden. So ist es notwendig, mit Immunohistochemie zu zeigen, dass die Schilddrüsenarchitektur erhalten bleibt und dass die injizierten Zellen die Schilddrüse infiltriert haben und nicht mit der Drüse vorhanden sind. Darüber hinaus sollte bei Xenograft- und orthotopischen Modellen die Größe der Tumoren in den verschiedenen Tiergruppen zu Beginn der Behandlung ähnlich sein, um in allen Fällen einem ähnlichen Wachstumsmuster zu folgen. Schließlich ist es wichtig zu zeigen, dass die Expression der Ziele nach der microRNA (in unserem Fall miR-146b) nach einer AntagomiR-Behandlung verändert wird.
Als mögliche zukünftige Anwendung dieses Modells könnten Patientenzellen in Mausmodelle injiziert werden, um zu analysieren, wie die Hemmung einer miRNA das Tumorwachstum eines bestimmten Patienten beeinflussen könnte, ein nützlicher Ansatz für Präzision und personalisierte Medizin auf der Grundlage miRNAs.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Raquel Arocha Riesco für ihre Unterstützung bei der Behandlung und Pflege von Mäusen. Wir danken Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) und Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanien) für die Schenkung der CMV-Firefly luc- IRES-EGFP bzw. Cal62-Luc Zellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R.
- Lin, S., Gregory, R. I.
- Hammond, S. M.
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , In press (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
