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Cancer Research

चूहे में ट्यूमर की वृद्धि को कम करने के लिए MicroRNA के Vivo निषेध में

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59322
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Summary

इस प्रोटोकॉल microRNA आधारित अवरोध करनेवाला उपचार का परीक्षण करने के लिए एक मंच के रूप में मानव थायराइड tumorigenesis के xenograft और orthotopic माउस मॉडल का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण गैर-कोडिंग आरएनए के कार्य और नए चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उनकी क्षमता का अध्ययन करने के लिए आदर्श है।

Abstract

MicroRNAs (mirnAs) MRNA को अस्थिर करने और लक्ष्य MRNAs के अनुवाद को बाधित करने की क्षमता के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं. अध्ययन की एक बढ़ती संख्या कैंसर निदान और रोग का निदान के लिए संभावित biomarkers के रूप में miRNAs की पहचान की है, और भी चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में, कैंसर मूल्यांकन और उपचार के लिए एक अतिरिक्त आयाम जोड़ने. थायराइड कैंसर के संदर्भ में, tumorigenesis न केवल महत्वपूर्ण जीन में उत्परिवर्तन से परिणाम है, लेकिन यह भी कई miRNAs के overexpression से. तदनुसार, थायराइड जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण में miRNAs की भूमिका कैंसर में एक महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में विकसित हो रहा है. इसमें, हम मानव ट्यूमर xenograft और orthotopic माउस मॉडल का उपयोग कर थायराइड कैंसर में एक चिकित्सीय मोडलिटी के रूप में miRNA-इनहिबिटर वितरण के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इंजीनियरिंग स्थिर थायराइड ट्यूमर कोशिकाओं GFP और luciferase व्यक्त करने के बाद, कोशिकाओं को नग्न चूहों में इंजेक्शन के ट्यूमर विकसित कर रहे हैं, जो bioluminscence द्वारा पीछा किया जा सकता है. एक miRNA के vivo निषेध ट्यूमर के विकास को कम करने और miRNA जीन लक्ष्य ों को विनियमित कर सकते हैं. इस विधि का उपयोग नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के अलावा विवो में निर्धारित मिर्ना के महत्व का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

थायराइड कैंसर एक बढ़ती हुई घटना के साथ एक अंत: स्रावी द्रोह है, हालांकि सामान्य शब्दों में यह एक अच्छा परिणामहै 1. फिर भी, कुछ रोगियों को रोग है कि untreatable हैं और आणविक ठिकानों खराब समझ रहे हैं2के आक्रामक रूपों का विकास.

mrRNAs 22-न्यूक्लिओटाइड लंबी गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो कई ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, आमतौर पर लक्ष्य दूत आरएनए (एमआरएनए) के 3' untranslational क्षेत्र (3'UTR) के लिए आधार-युग्म बाध्यकारी द्वारा, MRNA अवक्रमण या अनुवादात्मक दमन को ट्रिगर करते हैं 3 , 4. इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि माइक्रोआरएन अभिव्यक्ति का विनियमन कैंसर की पहचान है, क्योंकि ये अणु प्रजननात्मक संकेतन, प्रवास, आक्रमण और मेटास्टेसिस को मॉडलेट करते हैं और एपोप्टोसिस के प्रति प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं 5,6. हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से कैंसर निदान और रोग का निदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चिकित्सीय लक्ष्य7के लिए संभावित biomarkers के रूप में miRNAs की पहचान की है, कैंसर मूल्यांकन और उपचार के लिए एक नया आयाम प्रदान.

मिराना ने मानव आण्विक ऑन्कोलॉजी में मानव थाइरोइड नियोप्लाज्म8,9,10,11,12के प्रमुख चालकों के रूप में केंद्र स्तर पर ले लिया है . MiRNAs अप विनियमित में, miR-146b अत्यधिक Papillary थायराइड Carcinoma (PTC) ट्यूमर में overexpressed है और काफी सेल प्रसार में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया था, और आक्रामकता और निराशाजनक पूर्वानुमान के साथ जुड़े होने के लिए6, 12 , 13 , 14 , 15. इसके अलावा , miR-146b भेदभाव12में शामिल कई थायराइड जीन को नियंत्रित करता है , और यह भी PTEN16 और DICER117के रूप में महत्वपूर्ण ट्यूमर निरोधक जीन . कैंसर जीव विज्ञान में उनके महत्व के बावजूद, miRNA आधारित कैंसर चिकित्सा अपनी प्रारंभिक अवस्था में अब भी है, और बहुत कुछ अध्ययनों से थायराइड कैंसर को संबोधित किया है - अंत: स्रावी ट्यूमर18के सबसे अक्सर . यहाँ हम मानव व्युत्पन्न ट्यूमर के साथ दो अलग माउस मॉडल का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जिसमें एक सिंथेटिक miRNA अवरोध करनेवाला के प्रशासन (antagomiR) है कि विशेष रूप से एक सेलुलर miRNA ट्यूमर विकास ब्लॉक कर सकते हैं रोकता है. हम पहले एक आम xenograft मॉडल का इस्तेमाल किया, और एक antagomiR के स्थानीय intratumor प्रशासन ट्यूमर bioluminscence16में कमी के रूप में मापा ट्यूमर विकास में कमी आई. क्योंकि मजबूत माउस मॉडल मानव ट्यूमर प्रगति नकल की स्थापना अद्वितीय चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए आवश्यक है, प्राथमिक मानव ट्यूमर के orthotopic प्रत्यारोपण से नई दवाओं के नैदानिक सत्यापन के लिए एक अधिक मूल्यवान मंच है अधस्त्वक् implantation मॉडल. इस प्रकार, बेहतर antagomiR की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए, हम रक्त प्रवाह में प्रणालीगत वितरण के साथ एक orthotopic माउस मॉडल का इस्तेमाल किया, एक ही परिणाम प्राप्त करने.

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Protocol

पशु प्रयोग यूरोपीय समुदाय कानून (86/609/EEC) और स्पेनिश कानून (R.D. 1201/2005) के अनुपालन में किया गया था, Consezo सुपीरियर डे Investigaciones Cient]ficas (CSIC, स्पेन) की आचार समिति के अनुमोदन के साथ.

1. कोशिकाओं और इंट्राट्यूमरल एंटागोमीआर उपचार का फ्लेंक टीका

  1. सेल की तैयारी
    1. एक Cal62 मानव थायराइड कैंसर सेल लाइन इंजीनियर (KRASG12R और p53A161D उत्परिवर्तनों) एक transgenic निर्माण है कि गठन GFP और luciferase व्यक्त करता है overexpress करने के लिए (CMV-Firefly ल्यूक-IRES-eGFP). एंटीबायोटिक प्रतिरोध द्वारा या प्रवाह साइटोमेट्री के साथ GFP सकारात्मक कोशिकाओं छँटाई द्वारा ट्रांसजेनिक कोशिकाओं का चयन करें।
    2. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2के साथ पूरक कोशिकाओं को बढ़ाएँ।
    3. फास्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 50 डिग्री एल में 1 x 106 कोशिकाओं को निलंबित 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. चूहों के पार्श्वों में कोशिका टीका
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक ही राशि के साथ कोशिकाओं को मिलाएं. उदाहरण के लिए, पीबीएस के 50 डिग्री एल में 1 x 106 कोशिकाओं को 50 डिग्री सेल्सियस में मिलाकर 50 डिग्री सेल्सियस की सामग्री मैट्रिक्स (सामग्री की सारणीदेखें ) और धीरे से मिलाएं।
      नोट:
    2. नमूने के 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन (पीबीएस में कोशिकाओं + तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) 6 सप्ताह पुराने इम्यूनोन्यूफेसिमोनिबल BALB/c nu/nu चूहों के बाएं पार्श्व में एक 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर एक 27G 1/2' (0.4x13 मिमी) सुई के साथ.
  3. इंट्राट्यूमरल एंटागोमिआर उपचार।
    1. AntagomiR को निलंबित करें (सामग्री की तालिकादेखें ) या RNase-मुक्त आसुत जल के 500 डिग्री सेल्सियस में ऋणात्मक नियंत्रण।
    2. इंजेक्शन से पहले, प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एक में विवो वितरण अभिकर्मक के साथ antagomiR या नियंत्रण के 2 nmol तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      1. सबसे पहले एंटागोमिR विलयन (सामग्री की सारणीदेखें ) तथा संकुलन बफर (सामग्री की सारणीदेखें) को 1ः1 अनुपात में मिलाएं। उदाहरण के लिए, 80 डिग्री सेल्सियस मिरना-अवरोधक समाधान (16 nmol) को 80 डिग्री सेल्सियस संकुलीकरण बफर (विवो वितरण अभिकर्मक किट में शामिल, सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
      2. कमरे के तापमान के लिए vivo वितरण अभिकर्मक लाओ. एक 1.5-एमएल ट्यूब में 160 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और तुरंत पतला antagomiR समाधान के 160 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। शेष अभिकर्मक को -20 डिग्री सेल्सियस पर लौटाएँ। यदि आवश्यक हो, तो अभिकर्मक को थिंग के बाद एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      3. भंवर तुरंत (10 s) में विवो वितरण अभिकर्मक-antagomiR के जटिलीकरण सुनिश्चित करने के लिए.
      4. 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनवो डिलीवरी अभिकर्मक-एंटागोमिआर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। नमूने को पुनर्प्राप्त करने के लिए ट्यूब को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
      5. पीबीएस पीएच 7-4 के 1360 डिग्री सेल्सियस जोड़कर जटिल 6-फ़ोल्ड को पतला करें और अच्छी तरह मिला लें।
      6. एजेंट-antagomiR परिसर (8 चूहों/शर्त) के विवो वितरण में आगे बढ़ें, या इंजेक्शन से पहले एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर परिसर की दुकान करें। प्रत्येक ट्यूमर (2 एनमोल ऑफ एंटागोमीआर) में 200 डिग्री सेल्सियस अंतराट्यूमरकोज इंजेक्शन।
        नोट: मात्रा और antagomiR की मात्रा ट्यूमर मात्रा से स्वतंत्र है.
    3. 2 सप्ताह के लिए उपचार 3 बार (सोमवार, बुधवार और शुक्रवार) प्रदर्शन.
  4. ट्यूमर के विकास का विश्लेषण
    1. D-luciferin सब्सट्रेट के एक 40 mg/mL समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन (सामग्री की तालिकादेखें) एक 27G 1/2' (0.4 मिमी x 13 मिमी) सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज के साथ हर समय बिंदु पर subcutaneously.
      1. 8 मिनट के बाद इंजेक्शन पर, 3% isoflurane ऑक्सीजन के साथ मिश्रित का उपयोग कर चूहों anesthetize. पेडल पलटा (फर्म टू चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन और शल्य विमान को बनाए रखने के लिए उपयुक्त के रूप में संवेदनाहारी वितरण समायोजित करें।
      2. शुष्कता को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मलम लागू करें।
    2. विवो इमेजिंग सॉफ्टवेयर में के साथ bioluminescent संकेत छवि (सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: कैलिपर्स भी ट्यूमर की मात्रा और ट्यूमर के विकास को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै।
    3. एक बार bioluminescence संकेत प्राप्त कर रहे हैं, दोनों उपचार की तुलना ट्यूमर विकास का विश्लेषण और एक टी परीक्षण का उपयोग करके महत्व का निर्धारण. भीतर समूह प्रसरण का विश्लेषण करने के लिए SEM का उपयोग करें.
  5. ट्यूमर चीरा
    1. antagomiR उपचार के अंत के सात दिन बाद, चूहों बलिदान, ट्यूमर आबकारी और प्रोटीन निकालने और / वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर अनुभाग और उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ठीक करें।

2. कोशिकाओं के थायराइड ऑर्थोटोपिक टीका और प्रणालीगत एंटागोमिआर उपचार

  1. सेल की तैयारी
    1. एक Cal62 मानव थायराइड कैंसर सेल लाइन इंजीनियर एक transgenic निर्माण overexpress करने के लिए कि गठन GFP और luciferase व्यक्त करता है. एंटीबायोटिक प्रतिरोध द्वारा या प्रवाह साइटोमेट्री के साथ GFP सकारात्मक कोशिकाओं छँटाई द्वारा ट्रांसजेनिक कोशिकाओं का चयन करें।
    2. DMEM में इन कोशिकाओं को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक हो जाना (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 10% FBS पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2.
    3. पीबीएस के 5 डिग्री एल में 1 x 105 कोशिकाओं को निलंबित करें।
  2. चूहों की थायराइड ग्रंथि में सेल टीका
    1. एनाल्जेसिक (buprenorphine) और एंटीबायोटिक (सेफैलोस्पोरिन) के 100 डिग्री एल इंजेक्शन 7 सप्ताह पुराने BALB/c nu/ शराब के साथ इंजेक्शन साइट को संक्रमित करें।
    2. चूहों की थायराइड ग्रंथि में कोशिका समाधान के 5 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन।
      1. 3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को ऑक्सीजन के साथ मिश्रित करें और इसे एक बाँझ प्रवाह कैबिनेट में एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें।  पेडल पलटा (फर्म टू चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन और शल्य विमान को बनाए रखने के लिए उपयुक्त के रूप में संवेदनाहारी वितरण समायोजित करें।
      2. शुष्कता को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मलम लागू करें।
      3. प्रत्येक माउस के लिए, iodopovidone के साथ गर्दन कीटाणुरहित और कैंची के साथ त्वचा में लगभग 2 सेमी का एक चीरा बनाते हैं। एक बार खुला, लार ग्रंथियों विस्थापित द्वारा गर्दन का पर्दाफाश.
      4. श्वासनली और थायराइड ग्रंथि को बेनकाब करने के लिए विच्छेदन संदंश और/या कैंची का उपयोग करके पट्टा मांसपेशियों को अलग करें। एक 10 डिग्री माइक्रोलीटर सिरिंज का उपयोग सही थायराइड लोब्यूल में सेल समाधान के 5 डिग्री एल सुई, cricoid उपास्थि के पक्ष में स्थित.
      5. लार ग्रंथियों को पुन: स्थिति और चोटी, लेपित, गैर अवशोषित टांके का उपयोग कर रेशम के साथ चीरा सीवन।
      6. घाव क्षेत्र में iodopovidone जोड़ें और यह संज्ञाहरण से ठीक हो, जबकि एक thermic कंबल पर माउस जगह है.
    3. अगले दिन सर्जरी के बाद, subcutaneously एनाल्जेसिक (buprenorphine) सुई और 1 सप्ताह के लिए पीने के पानी के 250 एमएल में तरल ibuprofen (40 मिलीग्राम /
  3. प्रणालीगत एंटागोमीआर व्यवहार
    नोट: इस चरण को 2-3 सप्ताह सेल इंजेक्शन के बाद प्रदर्शन, जब bioluminescent संकेत पता लगाने योग्य है.
    1. आसुत RNase मुक्त पानी में antagomiR या नकारात्मक नियंत्रण निलंबित.
    2. इंजेक्शन से पहले, प्रत्येक इंजेक्शन के लिए इन विवो डिलीवरी अभिकर्मक के साथ antagomiR के 7 nmol या नियंत्रण तैयार करें।
      1. AntagomiR और in vivo डिलीवरी अभिकर्मक समाधान तैयारी के लिए चरण 1.3 देखें, लेकिन प्रति माउस miRNA-inhibitor के 7 nmol जोड़ें.
    3. माउस के शिरापरक साइनस के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन द्वारा अंतःशिरा समाधान को प्रशासित करें। संज्ञाहरण पैदा करने के लिए आइसोफ्लुरेन का प्रयोग करें।
      नोट: पेडल पलटा (फर्म टो चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन।
    4. 2 सप्ताह के लिए चूहों 3 बार एक सप्ताह (सोमवार, बुधवार और शुक्रवार) का इलाज करें।
  4. ट्यूमर के विकास का विश्लेषण
    1. ट्यूमर bioluminescent संकेत दो बार साप्ताहिक ट्यूमर विकास की गणना करने के लिए निर्धारित करते हैं।
      1. डी-ल्यूसिफेरिन सब्सट्रेट के 40 मिलीग्राम/एमएल समाधान का 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक समय बिंदु पर इंजेक्शन।
      2. 8 मिनट के बाद इंजेक्शन पर, 3% आइसोफ्लुरेन ऑक्सीजन के साथ मिश्रित और विवो इमेजिंग सॉफ्टवेयर में bioluminescent संकेत छवि का उपयोग कर चूहों anesthetize.
    2. एक बार bioluminescence संकेत प्राप्त कर रहे हैं, दोनों उपचार की तुलना ट्यूमर विकास का विश्लेषण और एक टी परीक्षण का उपयोग करके महत्व का निर्धारण. भीतर समूह प्रसरण का विश्लेषण करने के लिए SEM का उपयोग करें.
  5. ट्यूमर चीरा
    1. antagomiR उपचार अवधि के अंत के सात दिन बाद, चूहों बलिदान, ट्यूमर आबकारी और प्रोटीन निकालने और / वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर अनुभाग और उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ठीक करें।

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Representative Results

हम दो अलग चूहों मॉडल का इस्तेमाल किया निर्धारित करने के लिए कि क्या एक miRNA के तटस्थ ट्यूमर के विकास को दबा सकता है. तदनुसार, मानव ट्यूमर थायराइड Cal62-ल्यूक कोशिकाओं को एक जेनोग्राफ मॉडल उत्पन्न करने के लिए नग्न चूहों के पार्श्व में subcutaneously इंजेक्शन थे. दो सप्ताह के बाद, ट्यूमर स्थापित किए गए थे और कैलिपर्स के साथ मापा जा सकता है. उस समय, चूहों miR-146b-inhibitor, या एक उचित नियंत्रण के साथ intratumorally इंजेक्ट किया गया था, और ट्यूमर की मात्रा एक और दो सप्ताह के लिए पीछा किया गया था (चित्र 1A). जैसा कि चित्र 1खमें दिखाया गया है , मिR-146b-इनहिबिटर (एंटी-146b) (एन जेड 8) के साथ ट्यूमर के विकास को नकारात्मक नियंत्रण समूह (एन जेड 4) या नमकीन नियंत्रण समूह (नहीं दिखाया गया) के संबंध में काफी दबा दिया गया था। miRNAs जीन विनियमन का एक महत्वपूर्ण विशेषता है, के रूप में वे कई लक्ष्य mRNAs विनियमित. तदनुसार, oncomiRs ट्यूमर suppressor जीन के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं. इस प्रोटोकॉल इन जीनों के intratumoral अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जो miRNA अवरोध कनेर के साथ उपचार के बाद परीक्षण किया जा सकता है. इसके अलावा, कुछ प्रसार मार्करों के स्तर का भी अध्ययन किया जा सकता है, नियंत्रण उपचार ट्यूमर की तुलना में antagomiR इलाज ट्यूमर में कोशिका परमाणु प्रतिजन (PCNA) की कम अभिव्यक्ति द्वारा सचित्र (चित्र 2). इसके अलावा miRNA-लक्ष्यों की वसूली ट्यूमर-निष्कर्षित आरएनए या प्रोटीन के विश्लेषण के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है, के रूप में antagomiR में PTEN के उच्च अभिव्यक्ति द्वारा सचित्र (विरोधी-146b) इलाज ट्यूमर (चित्र 2). सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एक miRNA के vivo निषेध प्रभावी है और थायराइड कैंसर के इलाज के लिए चिकित्सकीय शोषण किया जा सकता है.

बेहतर एक miRNA-inhibitor की चिकित्सीय क्षमता का आकलन और माउस मॉडल में सुधार करने के लिए, हम एक orthotopic मॉडल उत्पन्न, जिसमें मानव ट्यूमर थायराइड Cal62-ल्यूक कोशिकाओं सीधे नग्न चूहों के सही थायराइड पालि में बीज थे. 3 सप्ताह के बाद, थायराइड ट्यूमर स्थापित किए गए थे, के रूप में चूहों की गर्दन में bioluminescence संकेतों द्वारा और सकल ऊतक विश्लेषण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्रदर्शन किया, hematoxylin और eosin और कोशिकाओं के GFP धुंधला के साथ, respectiviely. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, कोलॉइड के आस-पास की उपकला कोशिकाएं माउस से थायराइड कूप वास्तुकला को प्रदर्शित करती हैं। GFP सकारात्मक कोशिकाओं follicles के साथ interspersed, स्पष्ट रूप से प्रदर्शन है कि मानव Cal62 कोशिकाओं को सही ढंग से इंजेक्शन दिया गया है और माउस थायराइड के भीतर बढ़. एक बार ट्यूमर का गठन किया गया था, हम 13 चूहों अंतःशिरा miR-146b-inhibitor के साथ इंजेक्शन (n $8) या एक उचित नियंत्रण (n $5), और ट्यूमर की मात्रा एक और दो सप्ताह के लिए पीछा किया गया था (चित्र 4A). हमने पाया कि प्रणालीगत एंटागोमीआर-उपचारित समूह में ट्यूमर की वृद्धि में काफी कमी आई है (चित्र 4ख)। विशेष रूप से, प्राथमिक ट्यूमर में नव वर्णित miR-146b-लक्ष्य DICER1 की अभिव्यक्ति विरोधी miR-146b उपचार के बाद बढ़ा दिया गया था (चित्र 5). इन आंकड़ों से पता चलता है कि अंतर्जात मिरना अभिव्यक्ति का निषेध और इसलिए इसके लक्षित जीनों की बहाली का उपयोग थायरॉइड कैंसर16,17में चिकित्सा के रूप में किया जा सकता है .

Figure 1
चित्र 1. miR-146b-अवरोधक मानव थायराइड ट्यूमर विकास की स्थापना की ख़राब करता है। Cal62-luciferase व्यक्त कोशिकाओं (Cal62-luc) subcutaneously इंजेक्शन थे. xenografts स्थापित किए गए थे के बाद, एक सिंथेटिक miR-inhibitor (विरोधी-146b) (एन ]8) या एक नकारात्मक नियंत्रण (n ]4) intratumorally प्रशासित किया गया था। (एक) समयरेखा. (बी) बाएँ: छवि vivo इमेजिंग सॉफ्टवेयर में के साथ छवि इलाज ट्यूमर के समापन बिंदु bioluminescent संकेत से पता चलता है. सही: ग्राफ miRNA-इनहिबिटर (अंधेरे ग्रे) या नकारात्मक नियंत्रण (ग्रे) के साथ उपचार शुरुआत से xenografts में संकेत समय पर ट्यूमर चमक वृद्धि से पता चलता है। (ग) उपचारित ट्यूमर के अंतिम बिंदु विकिरण वृद्धि का प्रतिनिधित्व। मान मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं - SEM. *p और lt; 0.05; * *पी एंड एलटी;0.01. चित्रा राम-रीज़-मोया एट अल से अनुकूलित16| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. PCNA प्रोटीन अभिव्यक्ति कम हो जाती है और MiR-146b-inhibitor इलाज ट्यूमर में PTEN प्रोटीन अभिव्यक्ति बढ़ जाती है. नियंत्रण या miR-146b अवरोध करनेवाला के साथ इलाज ट्यूमर से प्रोटीन PCNA या PTEN करने के लिए एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता के लिए प्राप्त किया गया था. चित्रा राम-रीज़-मोया एट अल से अनुकूलित16| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. ऑर्थोटोपिक मॉडल में इंट्राट्यूमरल माउस थायराइड कूप। हेमेटोक्सीलिन और ईओसिन (ऊपरी पैनल) और या ऑर्थोटोपिक चूहों ट्यूमर के GFP (नीचे पैनल) के लिए एक एंटीबॉडी के साथ धुंधला 28 दिन Cal62-ल्यूक GFP सकारात्मक कोशिकाओं के साथ टीका के बाद. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. miR-146b-अवरोधक मानव थायराइड ट्यूमर विकास की स्थापना की ख़राब करता है। Cal62-luciferase व्यक्त कोशिकाओं (Cal62-luc) चूहों की थायराइड ग्रंथि में इंजेक्शन थे. ट्यूमर स्थापित करने के बाद (3 सप्ताह), एक सिंथेटिक miRNA-इनहिबिटर (विरोधी-146b) (एन ]8) या एक नकारात्मक नियंत्रण (एन जेड 5) व्यवस्थित प्रशासित किया गया था। (एक) समयरेखा. (बी) बाएँ: छवि vivo इमेजिंग सॉफ्टवेयर में के साथ छवि इलाज ट्यूमर के समापन बिंदु bioluminescent संकेत से पता चलता है. सही: ग्राफ miRNA-इनहिबिटर (नीला) या नकारात्मक नियंत्रण (हरा) के साथ उपचार शुरुआत से संकेत समय पर ट्यूमर चमक वृद्धि से पता चलता है। (ग) उपचारित ट्यूमर के अंतिम बिंदु विकिरण वृद्धि का प्रतिनिधित्व। मान मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं - SEM. *p और 0.05. चित्रा राम-रीज़-मोया एट अल17से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. DICER1 प्रोटीन अभिव्यक्ति miR-146b-अवरोधक इलाज ट्यूमर में बढ़ जाती है. miR-146b-inhbitor या नियंत्रण के साथ उपचार के बाद ऑर्थोटोपिक ट्यूमर में एक DICER1 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में अपनी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक miRNA के विवो समारोह में अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, और थायराइड कैंसर में एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में इसकी क्षमता। ट्यूमर xenograft मॉडल यहाँ वर्णित कोशिकाओं है कि उनके bioluminescence संकेत द्वारा ट्रैक किया जा सकता है के उपयोग पर आधारित हैं, एक उपचार के प्रभाव में विवो में ट्यूमर के विकास की माप की अनुमति. इसके अलावा, हम थायराइड कैंसर के लिए एक miRNA आधारित उपचार के उपयोग का वर्णन है, जो वर्तमान में प्रारंभिक चरण में है.

हम पहले एक subcutaneous xenograft मॉडल का उपयोग कर एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में एक miRNA की व्यवहार्यता का परीक्षण किया, जिसमें थायराइड ट्यूमर कोशिकाओं इम्यूनोडेफिएंट चूहों के flanks में इंजेक्ट किया गया. हम तो intratumorally antagomiR इंजेक्शन. इस मॉडल के कई प्रकार के कैंसर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशिष्ट miRNAs या मानव कैंसर कोशिकाओं में vivo में oncomiRs के महत्व का परीक्षण. इस तकनीक के लाभ कर रहे हैं कि यह अपेक्षाकृत करने के लिए सरल है और भी जल्दी, कम से कम पशु पीड़ा के साथ. तकनीक का एक प्रमुख नुकसान, तथापि, यह है कि यह बारीकी से मानव हालत की नकल नहीं करता है क्योंकि कोशिकाओं को subcutaneously इंजेक्शन और नहीं अंग के मूल में. इस सीमा को दूर करने के लिए, हम चूहों के थायराइड में bioluminescent थायराइड ट्यूमर कोशिकाओं के सर्जिकल ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण प्रदर्शन करके एक और अधिक मजबूत मॉडल का इस्तेमाल किया। हालांकि इस तकनीक और अधिक जटिल और समय लेने वाली है, यह अपने "देशी" वातावरण में ट्यूमर के विकास के अध्ययन की अनुमति देता है, थायराइड. इस विधि की एक ताकत यह है कि यह मेटास्टेसिस के रूप में ट्यूमर सेल प्रसार के अध्ययन की अनुमति देता है, आमतौर पर फेफड़ों में, जो विवो इमेजिंग सॉफ्टवेयर में मूल्यांकन किया जा सकता है। एक और ताकत यह है कि एंटागोमीआर की प्रणालीगत डिलीवरी एक संभावित मानव उपचार की नकल करती है और थायराइड प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटागोमीआर के प्रणालीगत इंजेक्शन से जानवरों पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ा, क्योंकि सीरम ग्लूकोज स्तर या यकृत आकारिकी जैसे पैरामीटर17में नहीं बदले गए थे।

वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में, ट्यूमर कोशिकाओं का इंजेक्शन थायराइड ग्रंथि में ठीक से किया जाना चाहिए और पड़ोसी ऊतक में नहीं। इस प्रकार, यह प्रतिरक्षा रसायन के साथ प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक है कि थायराइड वास्तुकला बनाए रखा है और इंजेक्शन कोशिकाओं थायराइड घुसपैठ की है और ग्रंथि के साथ बाहर मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, दोनों xenograft और orthotopic मॉडल के लिए, जानवरों के विभिन्न समूहों में ट्यूमर का आकार सभी मामलों में एक समान विकास पैटर्न का पालन करने के क्रम में उपचार की शुरुआत में समान होना चाहिए। अंत में, यह प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है कि microRNA के नीचे लक्ष्य की अभिव्यक्ति (हमारे मामले miR-146b में) antagomiR उपचार के बाद बदल रहे हैं

इस मॉडल के एक संभावित भविष्य के आवेदन के रूप में, रोगी कोशिकाओं माउस मॉडल में इंजेक्शन के लिए विश्लेषण कैसे एक miRNA के निषेध एक विशिष्ट रोगी के ट्यूमर के विकास को प्रभावित कर सकता है, सटीक और व्यक्तिगत दवा के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण पर आधारित मिर्नेस।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम चूहों के उपचार और देखभाल के साथ उसकी सहायता के लिए राकेल Arocha Riesco के आभारी हैं. हम क्रमशः CMV-Firefly luc-IRES-EGFP और Cal62-Luc कोशिकाओं को उपहार देने के लिए डॉ जे Blanco (केटालोनी इंस्टीट्यूट फॉर एडवांस केमिस्ट्री-सीएसआईसी) और डॉ ई. माटो (इंस्टीट्यूशन डे रेसरका डे एल'हॉस्पिटल डे ला सांता क्रेयू आई संत पाउ) बार्सिलोना (स्पेन) को उपहार देने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor Thermo Fisher 4464088 In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration Corning #354248
DICER antibody Abcam ab14601 IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent Thermo Fisher IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 Thermo Fisher 4464077 In Vivo Ready
PCNA antibody Abcam ab92552 WB: 1/2,000
PTEN antibody Santa Cruz sc-7974 WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122799 Diluted in PBS

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 miRNA अवरोध करनेवाला थायराइड ट्यूमर विकास माउस मॉडल miRNA आधारित उपचार miR-146b थायराइड कैंसर
चूहे में ट्यूमर की वृद्धि को कम करने के लिए MicroRNA के Vivo निषेध में
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Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Acuña-Ruiz, A., Zaballos, M. A., Santisteban, P. In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59322, doi:10.3791/59322 (2019).

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