Summary
Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica através de sua capacidade de destabilizar o mRNA e inibir a tradução de mRNAs alvo. Um número cada vez maior de estudos identificou miRNAs como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer, e também como alvos terapêuticos, acrescentando uma dimensão extra à avaliação e tratamento do câncer. No contexto do cancro de tiróide, os resultados do tumorigênese não somente das mutações em genes importantes, mas igualmente da superexpressão de muitos miRNAs. Assim, o papel do miRNAs no controle da expressão gênica da tireoide está evoluindo como um importante mecanismo de câncer. Nisto, nós apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da entrega do Mirna-inibidor como uma modalidade terapêutica no cancro de tiróide usando o xenograft humano do tumor e os modelos transplantação orthotopic do do rato. Após a engenharia de células tumorais estáveis da tireóide expressando GFP e luciferase, as células são injetadas em camundongos nus para desenvolver tumores, que podem ser seguidos por bioluminescência. A inibição in vivo de um miRNA pode reduzir o crescimento do tumor e upregulate alvos do gene de miRNA. Este método pode ser utilizado para avaliar a importância de um determinado miRNA in vivo, além de identificar novos alvos terapêuticos.
Introduction
O câncer de tireóide é uma malignidade endócrina com uma incidência crescente, embora, em termos gerais, tenha um bom desfecho1. No entanto, alguns pacientes desenvolvem formas agressivas da doença que são intratáveis e as bases moleculares são pouco compreendidas2.
miRNAs são 22-nucleotídeo-longo não-codificando RNAs que regulam a expressão de gene em muitos tecidos, tipicamente pela ligação do par-base à 3 ' região untranslational (3 ' UTR) do mensageiro do alvo RNAs (mRNAs), provocando a degradação do mRNA ou a repressão translacional 3. º , 4. There está aumentando a evidência que demonstra que a desregulamentação da expressão de microRNA é uma indicação do cancro, porque estas moléculas modulam a sinalização proliferativa, a migração, a invasão e a metástase, e podem fornecer a resistência ao apoptose 5,6. Nos últimos anos, muitos estudos identificaram miRNAs como potenciais biomarcadores para diagnóstico de câncer e prognóstico, bem como alvos terapêuticos7, proporcionando uma nova dimensão à avaliação e tratamento do câncer.
miRNAs tomaram o estágio Center na Oncologia molecular humana como os excitadores chaves de neoplasma humanos8,9,10,11,12datiróide. Entre os miRNAs acima-regulados, miR-146B é altamente overexpressado em tumores Papillary do carcinoma do tiróide (PTC) e foi mostrado para aumentar significativamente a proliferação de pilha, e para ser associado com a agressividade e o prognóstico sombrio6, 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. Além disso, miR-146B regula vários genes da tireóide envolvidos na diferenciação12, e também importantes genes supressores de tumor, como PTEN16 e DICER117. Apesar de sua importância na biologia do câncer, a terapia oncológica baseada em miRNA ainda está em seus estágios iniciais, e muito poucos estudos abordaram o câncer de tireóide-o mais frequente dos tumores endócrinos18. Aqui nós descrevemos um protocolo usando dois modelos diferentes do rato com os tumores humano-derivados, em que a administração de um miRNA-inibidor sintético (antagomiR) que inibe especificamente um miRNA celular pode obstruir o crescimento do tumor. Nós usamos primeiramente um modelo comum do xenograft, e a administração local do intratumorais de um antagomir diminuiu o crescimento do tumor medido como uma redução no bioluminescência16do tumor. Porque o estabelecimento de modelos robustos do rato que imita a progressão humana do tumor é essencial desenvolver aproximações terapêuticas originais, a implantação transplantação orthotopic do de tumores humanos preliminares é uma plataforma mais valiosa para a validação clínica de drogas novas do que modelos de implante subcutâneo. Assim, a fim de melhor avaliar o potencial terapêutico do antagomiR, utilizou-se um modelo de camundongo ortotópico com parto sistêmico na corrente sanguínea, obtendo os mesmos resultados.
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Protocol
A experimentação animal foi realizada em conformidade com o direito da Comunidade Europeia (86/609/CEE) e a lei espanhola (1201/2005), com aprovação do Comité de ética do Consejo superior de Investigaciones científicas (CSIC, Espanha).
1. inoculação do flanco de células e tratamento antagomiR intratumoral
- Preparação de células
- Engenheiro de uma linha de células de câncer de tireóide humano Cal62 (KrasG12R e p53A161D mutações) para sobre-expressão uma construção transgênica que constitutivamente expressa GFP e luciferase (CMV-Firefly Luc-ires-EGFP). Selecione as células transgênicas por resistência a antibióticos ou classificando as células GFP-positivas com citometria de fluxo.
- Cultivar as células no meio de Eagle ' s modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com penicilina, estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO2.
- Suspender 1 x 106 células em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° c.
- Inoculação de células nos flancos de camundongos
- Misture as células com a mesma quantidade de matriz de membrana basal. Por exemplo, adicione 1 x 106 células em 50 ΜL de PBS a 50 μL de matriz de membrana basal (ver tabela de materiais) e misture suavemente.
Nota: - Injete 100 μL da amostra (células em PBS + matriz de membrana basal) subcutaneamente no flanco esquerdo de camundongos BALB/c nu/nu de 6 semanas de idade, utilizando uma seringa de 1 ml de insulina com uma agulha de 27G 1/2 ' ' (0,4 x13 mm).
- Misture as células com a mesma quantidade de matriz de membrana basal. Por exemplo, adicione 1 x 106 células em 50 ΜL de PBS a 50 μL de matriz de membrana basal (ver tabela de materiais) e misture suavemente.
- Tratamento com antagomiR intratumoral.
- Suspender o antagomiR (ver tabela de materiais) ou o controlo negativo em 500 μL de água destilada sem RNase.
- Antes da injecção, prepare 2 nmol do antagomiR ou o controlo juntamente com um reagente de entrega in vivo (ver tabela de materiais) para cada injeção.
- Primeiro misture a solução antagomiR (ver tabela de materiais) e o tampão de complexação (ver tabela de materiais) numa proporção de 1:1. Por exemplo, adicionar 80 μL de solução de inibidor de miRNA (16 nmol) a 80 μL de tampão de complexação (incluído no kit de reagente de entrega in vivo, ver tabela de materiais).
- Traga o reagente de entrega in vivo para a temperatura ambiente. Adicione 160 μL a um tubo de 1,5 mL e adicione imediatamente 160 μL de solução de antagomiR diluída. Retorne o reagente restante a-20 ° c. Se necessário, guarde o reagente a 4 ° c durante até uma semana após a descongelar.
- Vortex imediatamente (10 s) para garantir a complexação do reagente de entrega in vivo-antagomiR.
- Incubar a mistura de reagente-antagomiR de entrega in vivo durante 30 min a 50 ° c. Centrifugue o tubo brevemente para recuperar a amostra.
- Diluir o complexo de 6 vezes, adicionando 1360 μL de PBS pH 7,4 e misture bem.
- Proceder com a entrega in vivo do complexo reagente-antagomiR (8 camundongos/condição), ou armazenar o complexo a 4 ° c por até uma semana antes da injecção. Injete 200 μL de intratumoralmente em cada tumor (2 nmol de antagomiR).
Nota: o volume e a quantidade do antagomiR são independentes do volume tumoral.
- Realize o tratamento 3 vezes por semana (segunda, quarta e sexta) durante 2 semanas.
- Análise do crescimento tumoral
- Injete 50 μL de uma solução de 40 mg/mL de substrato de D-luciferina (ver tabela de materiais) por via subcutânea em cada ponto de tempo com uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm).
- A 8 min após a injeção, anestesiam os camundongos usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio. Avalie o nível de anestesia por reflexo de pedal (pinça firme do dedo do pé) e ajuste o parto anestésico conforme apropriado para manter o plano cirúrgico.
- Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desseccation.
- Imagem do sinal bioluminescente com software de imagem in vivo (ver tabela de materiais).
Nota: os calipers podem igualmente ser usados para medir o volume do tumor e o crescimento do tumor. - Uma vez obtidos os sinais de bioluminescência, analisar o crescimento tumoral comparando os dois tratamentos e determinar a significância por meio de um teste t. Para analisar a variância dentro do grupo, use o SEM.
- Injete 50 μL de uma solução de 40 mg/mL de substrato de D-luciferina (ver tabela de materiais) por via subcutânea em cada ponto de tempo com uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm).
- Excisão tumoral
- Sete dias após o término do tratamento com antagomiR, sacrificam os camundongos, exprimem o tumor e extraem proteínas e/ou RNA para análise futura. Alternativamente, seção os tumores e corrigi-los para immunohistochemistry.
2. inoculação ortotópica tireoidiana de células e tratamento sistêmico de antagomiR
- Preparação de células
- Engenheiro de uma linha celular de câncer de tireóide Cal62 humano para sobre-expressão uma construção transgênica que constitutivamente expressa GFP e luciferase. Selecione as células transgênicas por resistência a antibióticos ou classificando as células GFP-positivas com citometria de fluxo.
- Cultivar estas células em DMEM suplementados com antibióticos (penicilina e estreptomicina) e 10% FBS a 37 ° c e 5% CO2.
- Suspender 1 x 105 células em 5 ΜL de PBS.
- Inoculação celular na glândula tireóide de camundongos
- Injete 100 μL de analgésico (buprenorfina) e 100 μL de antibiótico (cefalosporina) por via subcutânea em camundongos BALB/c nu/nu de 7 semanas de idade. Desinfete o local da injecção com álcool.
- Injete 5 μL da solução celular na glândula tireóide dos camundongos.
- Anestesiar o rato usando isoflurano 3% misturado com oxigênio e colocá-lo um estereomicroscópio em um armário de fluxo estéril. Avalie o nível de anestesia por reflexo de pedal (pinça firme do dedo do pé) e ajuste o parto anestésico conforme apropriado para manter o plano cirúrgico.
- Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desseccation.
- Para cada rato, desinfete o pescoço com iodopovidona e faça uma incisão aproximada de 2 cm na pele com uma tesoura. Uma vez aberto, expor o pescoço, deslocando as glândulas salivares.
- Dissecar os músculos da cinta usando o fórceps e/ou a tesoura da dissecção para expor a traquéia e a glândula de tiróide. A utilização de uma seringa de microlitro de 10 μL injecta 5 μL da solução celular no lóbulo direito da tiroide, localizado no lado da cartilagem cricóide.
- Reposicione as glândulas salivares e sutura a incisão com seda usando suturas trançadas, revestidas, não absorvíveis.
- Adicione iodopovidona à área da ferida e coloque o mouse sobre um cobertor térmico enquanto ele se recupera da anestesia.
- No dia seguinte após a cirurgia, injete o analgésico subcutaneamente (buprenorfina) e adicione 3 mL de ibuprofeno líquido (40 mg/mL) em 250 mL da água potável durante 1 semana.
- AntagomiR sistémico tratamento
Nota: execute esta etapa 2-3 semanas após a injeção da pilha, quando o sinal bioluminescente é detectável.- Suspenda o antagomiR ou o controle negativo na água destilada RNase-livre.
- Antes da injecção, prepare 7 nmol do antagomiR ou o controlo juntamente com o reagente de entrega in vivo para cada injeção.
- Para o antagomiR e a preparação da solução de reagente de entrega in vivo, consulte a etapa 1,3, mas adicione 7 nmol do inibidor de miRNA por mouse.
- Administrar a solução por via intravenosa por injeção retro-orbital do seio venoso do rato. Use isoflurano para induzir anestesia.
Nota: avaliar o nível de anestesia por pedal Reflex (firme Toe pinch). - Trate os ratos 3 vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira) durante 2 semanas.
- Análise do crescimento tumoral
- Determine o sinal bioluminescente do tumor duas vezes por semana para calcular o crescimento do tumor.
- Injetar 50 μL de uma solução de 40 mg/mL de substrato de D-luciferina em cada ponto de tempo através de injeção subcutânea.
- A 8 min após a injeção, anestesiam os camundongos usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio e imagem o sinal bioluminescente com o software de imagem in vivo.
- Uma vez obtidos os sinais de bioluminescência, analisar o crescimento tumoral comparando os dois tratamentos e determinar a significância por meio de um teste t. Para analisar a variância dentro do grupo, use o SEM.
- Determine o sinal bioluminescente do tumor duas vezes por semana para calcular o crescimento do tumor.
- Excisão tumoral
- Sete dias após o término do período de tratamento de antagomiR, sacrificam os camundongos, exprimem o tumor e extraem proteínas e/ou RNA para análise futura. Alternativamente, seção os tumores e corrigi-los para immunohistochemistry.
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Representative Results
Nós usamos dois modelos diferentes dos ratos para determinar se a neutralização de um miRNA poderia suprimir o crescimento do tumor. Conformemente, as pilhas humanas do tiróide Cal62-Luc do tumor foram injetadas por via subcutânea nos flancos de ratos nus para gerar um modelo do xenograph. Após duas semanas, os tumores foram estabelecidos e poderiam ser medidos com calipers. Nesse momento, os camundongos foram injetados intratumoralmente com o inibidor do miR-146B, ou um controle adequado, e o volume tumoral foi seguido por mais duas semanas (Figura 1a). Como mostrado na Figura 1b, o crescimento de tumores intratumoralmente injetados com o inibidor miR-146B (anti-146B) (n = 8) foi significativamente suprimido em relação ao grupo controle negativo (n = 4) ou ao grupo controle salino (não mostrado). os miRNAs são uma característica importante da regulação gênica, pois regulam vários mRNAs alvo. Consequentemente, os oncomiRs são reguladores importantes de genes supressores de tumor. Este protocolo permite a análise dos níveis de expressão intratumoral desses genes, que podem ser testados após o tratamento com o inibidor de miRNA. Além disso, os níveis de alguns marcadores de proliferação também podem ser estudados, ilustrados pela menor expressão do antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) em tumores tratados com antagomiR do que nos tumores tratados com controle (Figura 2). Além disso, a recuperação dos alvos de miRNA pode ser estudada através da análise do RNA ou da proteína extraída do tumor, como ilustrado pela maior expressão de PTEN nos tumores tratados com antagomiR (anti-146B) (Figura 2). Coletivamente, esses dados revelam que a inibição in vivo de um miRNA é eficaz e pode ser explorada terapeuticamente para o tratamento do câncer de tireóide.
Para avaliar melhor o potencial terapêutico de um inibidor de Mirna e melhorar o modelo do rato, nós geramos um modelo transplantação orthotopic do, em que as pilhas humanas do tiróide Cal62-Luc do tumor foram semeadas diretamente no lóbulo direito do tiróide de ratos nus. Após 3 semanas, os tumores de tireóide foram estabelecidos, como demonstrado pelos sinais de bioluminescência no pescoço dos camundongos e pela análise de tecido bruto e imuno-histoquímica, com hematoxilina e eosina e coloração GFP de células, respeitosamente. Como mostrado na Figura 3, as células epiteliais que cercam o coloide demonstram a arquitetura do folículo tireoidiano do mouse. Células GFP-positivas intercaladas com os folículos, demonstrando inequivocamente que as células Cal62 humanas foram injetados corretamente e proliferam dentro da tireoide do camundongo. Uma vez formados os tumores, injetamos 13 camundongos intravenosamente com o inibidor miR-146B (n = 8) ou um controle adequado (n = 5), e o volume tumoral foi seguido por mais duas semanas (figura 4a). Verificou-se que o crescimento tumoral foi significativamente diminuído no grupo sistêmico tratado com antagomiR (Figura 4B). Notavelmente, a expressão do recém-descrito miR-146B-Target DICER1 no tumor primário foi aumentada após o tratamento anti-miR-146B (Figura 5). Esses dados demonstram que a inibição da expressão de Mirna endógena e, portanto, a restauração de seus genes-alvo poderia ser usada como terapia no câncer de tireoide16,17.
Figura 1. O miR-146B-inibidor prejudica o crescimento humano estabelecido do tumor do tiróide. As pilhas expressando de Cal62-luciferase (Cal62-Luc) foram injetadas subcutaneously. Após a administração de xenoenxertos, foi administrado intratumoralmente um inibidor sintético da miR (anti-146B) (n = 8) ou um controle negativo (n = 4). (A) Timeline. (B) esquerda: a imagem mostra o sinal bioluminescente do ponto final dos tumores tratados imaged com o software in vivo da imagem latente. Direita: o gráfico mostra aumento de radiância tumoral nos tempos indicados em xenoenxertos do início do tratamento com o inibidor de miRNA (cinza escuro) ou o controle negativo (cinza). (C) respresentação do aumento do Radiance do valor-limite dos tumores tratados. Os valores representam média ± SEM. * p < 0, 5; * * p < 0,01. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A expressão da proteína de PCNA diminui e a expressão da proteína de PTEN aumenta em tumores miR-146B-tratados inibidor. A proteína dos tumores tratados com o controle ou o inibidor de miR-146B foi obtida para a mancha ocidental com os anticorpos a PCNA ou a PTEN. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Folículos do tiróide do rato de intratumoral no modelo transplantação orthotopic do. Coloração com hematoxilina e eosina (painel superior) e ou um anticorpo para GFP (painel inferior) dos tumores de camundongos ortotópicos 28 dias após a inoculação com células positivas para GFP-Cal62-Luc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O miR-146B-inibidor prejudica o crescimento humano estabelecido do tumor do tiróide. As pilhas expressando de Cal62-luciferase (Cal62-Luc) foram injetadas na glândula de tiróide dos ratos. Depois que os tumores foram estabelecidos (3 semanas), um inibidor sintético de miRNA (anti-146B) (n = 8) ou um controle negativo (n = 5) foi administrado sistemàtica. (A) Timeline. (B) esquerda: a imagem mostra o sinal bioluminescente do ponto final dos tumores tratados imaged com o software in vivo da imagem latente. Direita: o gráfico mostra aumento de radiância tumoral nos horários indicados do início do tratamento com o inibidor de miRNA (azul) ou o controle negativo (verde). (C) respresentação do aumento do Radiance do valor-limite dos tumores tratados. Os valores representam média ± SEM. * p < 0, 5. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.17. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A expressão da proteína DICER1 aumenta em tumores miR-146B-tratados com inibidores. Immunohistochemistry com um anticorpo DICER1 nos tumores transplantação orthotopic do após o tratamento com miR-146B-inhbitor ou controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um método para estudar a função in vivo de um miRNA a fim compreender melhor seu papel na iniciação e na progressão do tumor, e em seu potencial como um alvo terapêutico no cancro de tiróide. Os modelos do xenograft do tumor descritos aqui são baseados no uso das pilhas que podem ser controladas por seu sinal do bioluminescência, permitindo a medida do crescimento do tumor in vivo a influência de um tratamento. Além disso, descrevemos o uso de um tratamento baseado em miRNA para o câncer de tireóide, que está atualmente nos estágios iniciais.
Nós testamos primeiramente a praticabilidade de um miRNA como um alvo terapêutico usando um modelo subcutaneous do xenograft, em que as pilhas do tumor do tiróide foram injetadas nos flancos de ratos immunodeficientes. Em seguida, injetamos intratumoralmente o antagomiR. Este modelo pode ser usado para vários tipos de câncer para testar o significado de miRNAs específicos ou oncomiRs in vivo em células cancerosas humanas. As vantagens desta técnica são que é relativamente simples executar e igualmente rápido, com sofrimento animal mínimo. Uma desvantagem principal da técnica, entretanto, é que não imitam pròxima a condição humana porque as pilhas são injetadas por via subcutânea e não no órgão--origem. Para superar essa limitação, utilizou-se um modelo mais robusto realizando a implantação ortotópica cirúrgica de células tumorais de tireoide bioluminescentes na tireoide dos camundongos. Embora esta técnica seja mais complicada e demorada, permite o estudo do crescimento tumoral em seu ambiente "nativo", a tireoide. Uma força deste método é que permite o estudo da disseminação tumoral da pilha como a metástase, geralmente nos pulmões, que podem ser avaliados com o software in vivo da imagem latente. Uma outra força é que a entrega sistemática do antagomiR imita um tratamento humano potencial e permite a análise da resposta do tiróide. Além disso, a injeção sistêmica do antagomiR não ocasionou efeitos adversos nos animais, pois parâmetros como níveis séricos de glicose ou morfologia hepática não foram alterados17.
Há algumas etapas críticas. No modelo do rato transplantação orthotopic do, a injeção das pilhas tumorais deve exatamente ser executada na glândula de tiróide e não no tecido vizinho. Assim, é necessário demonstrar com immunohistochemistry que a arquitetura do tiróide é mantida e que as pilhas injetadas infiltraram o tiróide e não estão atuais para fora com a glândula. Além disso, para os modelos de Xenoenxerto e ortotópico, o tamanho dos tumores nos diferentes grupos de animais deve ser semelhante no início do tratamento, a fim de seguir um padrão de crescimento semelhante em todos os casos. Por fim, é importante demonstrar que a expressão dos alvos a jusante do microRNA (no nosso caso miR-146B) é alterada após o tratamento com antagomiR
Como uma possível aplicação futura deste modelo, as células do paciente poderiam ser injetadas em modelos de mouse para analisar como a inibição de um miRNA poderia afetar o crescimento tumoral de um paciente específico, uma abordagem útil para precisão e medicina personalizada com base em miRNAs.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Raquel arocha Riesco por sua assistência com o tratamento e cuidado de camundongos. Agradecemos ao Dr. J. Blanco (Instituto Catalonian de química antecipada-CSIC) e ao Dr. e. mato (Institut de Reserca de l' Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Espanha) por gifting as células CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP e Cal62-Luc, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
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