Summary
Este protocolo describe los modelos de xenoinjerto y ratón ortotópico de la tumorigenesis tiroidea humana como una plataforma para probar los tratamientos inhibidores basados en microARN. Este enfoque es ideal para estudiar la función de los ARN no codificantes y su potencial como nuevas dianas terapéuticas.
Abstract
Los MicroRNAs (miRNAs) son reguladores importantes de la expresión génica a través de su capacidad para desestabilizar el ARNm e inhibir la traducción de arNM objetivo. Un número cada vez mayor de estudios han identificado los miRNAs como biomarcadores potenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, y también como dianas terapéuticas, añadiendo una dimensión adicional a la evaluación y el tratamiento del cáncer. En el contexto del cáncer de tiroides, la tumorigenesis se debe no sólo a mutaciones en genes importantes, sino también a la sobreexpresión de muchos miRNAs. En consecuencia, el papel de los miRNA en el control de la expresión del gen tiroideo está evolucionando como un mecanismo importante en el cáncer. En este documento, presentamos un protocolo para examinar los efectos de la administración de inhibidores de miRNA como una modalidad terapéutica en el cáncer de tiroides utilizando xenoinjerto tumoral humano y modelos de ratón ortotópico. Después de diseñar células tumorales tiroideas estables que expresan GFP y luciferasa, las células se inyectan en ratones desnudos para desarrollar tumores, que pueden ser seguidos por bioluminiscencia. La inhibición in vivo de un miRNA puede reducir el crecimiento tumoral y regular las metas del gen del miRNA. Este método se puede utilizar para evaluar la importancia de un miRNA in vivo determinado, además de identificar nuevas dianas terapéuticas.
Introduction
El cáncer de tiroides es una neoplasia maligna endocrina con una incidencia creciente, aunque en términos generales tiene un buen resultado1. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan formas agresivas de la enfermedad que son intratables y las bases moleculares no se entienden mal2.
Los miRNAs son ARN no codificantes de 22 nucleótidos que regulan la expresión génica en muchos tejidos, normalmente por unión de pares de bases a la región no traslacional de 3' (3'UTR) de ARN mensajeros objetivo (RNRa), desencadenando la degradación del ARNm o la represión traslacional 3 , 4. Cada vez hay más pruebas que demuestran que la desregulación de la expresión de microARN es un sello distintivo del cáncer, ya que estas moléculas modulan la señalización proliferativa, la migración, la invasión y la metástasis, y pueden proporcionar resistencia a la apoptosis 5,6. En los últimos años, muchos estudios han identificado los miRNAs como biomarcadorespotenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, así como las dianas terapéuticas 7, proporcionando una nueva dimensión a la evaluación y el tratamiento del cáncer.
los miRNAs han tomado el centro del escenario en oncología molecular humana como factores clave de las neoplasias tiroideas humanas8,9,10,11,12. Entre los miRNAs regulados, miR-146b está altamente sobreexpresado en tumores de carcinoma tiroideo papilar (PTC) y se demostró que aumenta significativamente la proliferación celular, y se asocia con agresividad y pronóstico sombrío6, 12 , 13 , 14 , 15. Además, miR-146b regula varios genes tiroideos implicados en la diferenciación12,y también importantes genes supresores de tumores como PTEN16 y DICER117. A pesar de su importancia en la biología del cáncer, la terapia oncológica basada en miRNA todavía está en sus primeras etapas, y muy pocos estudios han abordado el cáncer de tiroides - el más frecuente de los tumores endocrinos18. Aquí describimos un protocolo utilizando dos modelos de ratón diferentes con tumores derivados del ser humano, en el que la administración de un inhibidor de miRNA sintético (antagomiR) que inhibe específicamente un miRNA celular puede bloquear el crecimiento tumoral. Primero utilizamos un modelo de xenoinjerto común, y la administración intratumoral local de un crecimiento tumoral disminuido de antagomiR medido como una reducción en la bioluminiscencia tumoral16. Debido a que el establecimiento de modelos de ratón robustos que imitan la progresión tumoral humana es esencial para desarrollar enfoques terapéuticos únicos, la implantación ortotópica de tumores humanos primarios es una plataforma más valiosa para la validación clínica de nuevos fármacos que modelos de implantación subcutánea. Así, con el fin de evaluar mejor el potencial terapéutico del antagomiR, utilizamos un modelo de ratón ortotópico con parto sistémico en el torrente sanguíneo, obteniendo los mismos resultados.
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Protocol
La experimentación con animales se llevó a cabo en cumplimiento de la Ley de la Comunidad Europea (86/609/CEE) y la ley española (R.D. 1201/2005), con la aprobación del Comité de ética del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, España).
1. Inoculación de flanco de células y tratamiento de antagomiR intratumoral
- Preparación celular
- Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humana Cal62 (mutaciones KRASG12R y p53A161D) para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Seleccione las células transgénicas por resistencia a antibióticos o clasificando las células gFP positivas con citometría de flujo.
- Cultivar las células en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con penicilina, estreptomicina y 10% suerobovino fetal (FBS) a 37 oC y 5% CO 2.
- Suspenda 1 x 106 células en 50 salinas tamponadas de fosfato (PBS) a 4 oC.
- Inoculación celular en los flancos de los ratones
- Mezclar las células con la misma cantidad de matriz de membrana del sótano. Por ejemplo, agregue 1 x 106 células en 50 l de PBS a 50 l de matriz de membrana de sótano (ver Tabla de materiales)y mezcle suavemente.
Nota: - Inyectar 100 l de la muestra (células en PBS + matriz de membrana de sótano) por vía subcutánea en el flanco izquierdo de los ratones INMUNOdeficientes de 6 semanas de EDAD de BALB/c nu/nu utilizando una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
- Mezclar las células con la misma cantidad de matriz de membrana del sótano. Por ejemplo, agregue 1 x 106 células en 50 l de PBS a 50 l de matriz de membrana de sótano (ver Tabla de materiales)y mezcle suavemente.
- Tratamiento de antagomiR intratumoral.
- Suspenda el antagomiR (ver Tabla de Materiales)o el control negativo en 500 l de agua destilada libre de RNase.
- Antes de la inyección, prepare 2 nmol del antagomiR o el control junto con un reactivo de administración in vivo (ver Tabla de Materiales)para cada inyección.
- Primero mezcle la solución de antagomiR (ver Tabla de Materiales)y el búfer de complejidad (ver Tabla de Materiales)en una proporción 1:1. Por ejemplo, añada 80 ml de solución inhibidora de miRNA (16 nmol) a 80 l de tampón de complejidad (incluido en el kit de reactivos de entrega in vivo, véase Tabla de materiales).
- Lleve el reactivo de entrega in vivo a temperatura ambiente. Añadir 160 l a un tubo de 1,5 ml e inmediatamente añadir 160 ml de solución de antagomiR diluida. Devolver el reactivo restante a -20 oC. Si es necesario, guarde el reactivo a 4oC hasta una semana después de la descongelación.
- Vórtice inmediatamente (10 s) para asegurar la complejidad del reactivo-antagomiR de la entrega in vivo.
- Incubar la mezcla reactivo-antagomiR de entrega in vivo durante 30 min a 50oC. Centrifugar brevemente el tubo para recuperar la muestra.
- Diluir el complejo 6 veces añadiendo 1360 sl de pH DE PBS 7.4 y mezclar bien.
- Proceda con la entrega in vivo del complejo reactivo-antagomiR (8 ratones/condición), o almacene el complejo a 4 oC hasta una semana antes de la inyección. Inyectar 200 ml intratumoralmente en cada tumor (2 nmol de antagomiR).
NOTA: El volumen y la cantidad del antagomiR son independientes del volumen del tumor.
- Realizar el tratamiento 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas.
- Análisis del crecimiento tumoral
- Inyectar por vía subcutánea 50 ml de una solución de 40 mg/ml de sustrato de D-luciferina (ver Tabla de materiales)por vía subcutánea en cada punto de tiempo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- A 8 minutos después de la inyección, anestesiar a los ratones usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno. Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del pies firme) y ajustar el parto anestésico según corresponda para mantener el plano quirúrgico.
- Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación.
- Imagen de la señal bioluminiscente con el software de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Los calibradores también se pueden utilizar para medir el volumen del tumor y el crecimiento del tumor. - Una vez obtenidas las señales de bioluminiscencia, analice el crecimiento tumoral comparando ambos tratamientos y determine la importancia mediante una prueba t. Para analizar la varianza dentro del grupo, utilice el SEM.
- Inyectar por vía subcutánea 50 ml de una solución de 40 mg/ml de sustrato de D-luciferina (ver Tabla de materiales)por vía subcutánea en cada punto de tiempo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- Escisión tumoral
- Siete días después del final del tratamiento de antagomiR, sacrificar a los ratones, extirpar el tumor y extraer proteínas y/o ARN para análisis futuros. Alternativamente, seccione los tumores y arréglalos para la inmunohistoquímica.
2. Inoculación ortotópica tiroidea de células y tratamiento de antagomiR sistémico
- Preparación celular
- Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humana Cal62 para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa. Seleccione las células transgénicas por resistencia a antibióticos o clasificando las células gFP positivas con citometría de flujo.
- Cultivar estas células en DMEM suplementadas con antibióticos (penicilina y estreptomicina) y 10%FBS a 37oC y 5% CO 2.
- Suspenda 1 x 105 células en 5 sL de PBS.
- Inoculación celular en la glándula tiroides de ratones
- Inyectar 100 ml de analgésico (buprenorfina) y 100 l de antibiótico (cefalosporina) por vía subcutánea en ratones BALB/c nu/nu de 7 semanas de edad. Desinfectar el lugar de inyección con alcohol.
- Inyectar 5 ml de la solución celular en la glándula tiroides de los ratones.
- Anestetizar el ratón usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno y colocarlo bajo un estereomicroscopio en un gabinete de flujo estéril. Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del pies firme) y ajustar el parto anestésico según corresponda para mantener el plano quirúrgico.
- Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación.
- Para cada ratón, desinfectar el cuello con yodopovidona y hacer una incisión de aproximadamente 2 cm en la piel con tijeras. Una vez abierto, exponer el cuello desplazando las glándulas salivales.
- Disecciona los músculos de la correa usando fórceps de disección y/o tijeras para exponer la tráquea y la glándula tiroides. Usando una jeringa de microlitro de 10 l inyectar 5 l de la solución celular en el lóbulo tiroideo derecho, situado en el lado del cartílago cricoide.
- Vuelva a colocar las glándulas salivales y suturar la incisión con seda utilizando suturas trenzadas, recubiertas y no absorbibles.
- Agregue iodopovidona a la zona de la herida y coloque el ratón sobre una manta térmica mientras se recupera de la anestesia.
- Al día siguiente después de la cirugía, inyectar por vía subcutánea analgésico (buprenorfina) y añadir 3 ml de ibuprofeno líquido (40 mg/ml) en 250 ml de agua potable durante 1 semana.
- AntagomiR sistémico tratamiento
NOTA: Realice este paso 2-3 semanas después de la inyección celular, cuando la señal bioluminiscente sea detectable.- Suspenda el antagomiR o el control negativo en agua destilada libre de RNase.
- Antes de la inyección, prepare 7 nmol del antagomiR o el control junto con el reactivo de administración in vivo para cada inyección.
- Para el antagomiR y la preparación de la solución de reactivo de administración in vivo, consulte el paso 1.3, pero agregue 7 nmol del inhibidor de miRNA por ratón.
- Administrar la solución por vía intravenosa mediante inyección retro-orbital del seno venoso del ratón. Use isoflurano para inducir anestesia.
NOTA: Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del dedo del pecho firme). - Tratar a los ratones 3 veces a la semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas.
- Análisis del crecimiento tumoral
- Determinar la señal bioluminiscente del tumor dos veces por semana para calcular el crecimiento del tumor.
- Inyectar 50 ml de una solución de 40 mg/ml de sustrato de D-luciferina en cada punto de tiempo mediante inyección subcutánea.
- A 8 minutos después de la inyección, anestesia a los ratones usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno e imagen de la señal bioluminiscente con el software de imagen in vivo.
- Una vez obtenidas las señales de bioluminiscencia, analice el crecimiento tumoral comparando ambos tratamientos y determine la importancia mediante una prueba t. Para analizar la varianza dentro del grupo, utilice el SEM.
- Determinar la señal bioluminiscente del tumor dos veces por semana para calcular el crecimiento del tumor.
- Escisión tumoral
- Siete días después del final del período de tratamiento de antagomiR, sacrificar los ratones, extirpar el tumor y extraer proteínas y/o ARN para análisis futuros. Alternativamente, seccione los tumores y arréglalos para la inmunohistoquímica.
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Representative Results
Usamos dos modelos de ratones diferentes para determinar si la neutralización de un miRNA podría suprimir el crecimiento tumoral. En consecuencia, las células de tiroides de tumores humanos Cal62-luc se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos para generar un modelo de xenógrafo. Después de dos semanas, se establecieron tumores que se podían medir con pinzas. En ese momento, los ratones se inyectaron por vía intratumoral con el inhibidor del miR-146b, o un control adecuado, y se siguió el volumen tumoral durante otras dos semanas (Figura1A). Como se muestra en la Figura 1B, el crecimiento de tumores inyectados intratumoralmente con el inhibidor de miR-146b (anti-146b) (n-8) se suprimió significativamente con respecto al grupo de control negativo (n-4) o al grupo de control salino (no se muestra). los miRNAs son una característica importante de la regulación genética, ya que regulan varios ARNM objetivo. En consecuencia, los oncomiRs son reguladores importantes de los genes supresores de tumores. Este protocolo permite el análisis de los niveles de expresión intratumoral de estos genes, que se pueden probar después del tratamiento con el inhibidor del miRNA. Además, también se pueden estudiar los niveles de algunos marcadores de proliferación, ilustrados por la menor expresión de antígeno nuclear celular proliferante (PCNA) en tumores tratados con antagomiR que en tumores tratados con control (Figura2). También la recuperación de los objetivos de miRNA se puede estudiar mediante el análisis de ARN o proteína extraído stumoral, como lo ilustra la mayor expresión de PTEN en los tumores tratados como antagomiR(anti-146b) (Figura2). Colectivamente, estos datos revelan que la inhibición in vivo de un miRNA es eficaz y puede ser explotado terapéuticamente para el tratamiento del cáncer de tiroides.
Para evaluar mejor el potencial terapéutico de un inhibidor de miRNA y mejorar el modelo de ratón, generamos un modelo ortotópico, en el que las células tiroideas tumorales humanas Cal62-luc se sembraron directamente en el lóbulo tiroideo derecho de los ratones desnudos. Después de 3 semanas, se establecieron los tumores tiroideos, como lo demuestran las señales de bioluminiscencia en el cuello de los ratones y por el análisis de tejido bruto y la inmunohistoquímica, con hematoxilina y eosina y tinción de GFP de las células, respetuosamente. Como se muestra en la Figura3, las células epiteliales que rodean el coloide demuestran la arquitectura del folículo tiroideo desde el ratón. Células positivas de GFP intercaladas con los folículos, demostrando inequívocamente que las células humanas de Cal62 se han inyectado correctamente y proliferan dentro de la tiroides del ratón. Una vez formados los tumores, inyectamos 13 ratones por vía intravenosa con el inhibidor de miR-146b (n-8) o un control adecuado (n-5), y se siguió el volumen del tumor durante otras dos semanas (Figura4A). Encontramos que el crecimiento del tumor se redujo significativamente en el grupo sistémico tratado con antagomiR (Figura4B). En particular, la expresión del recién descrito MIR-146b-target DICER1 en el tumor primario se incrementó después del tratamiento anti-miR-146b (Figura5). Estos datos demuestran que la inhibición de la expresión de miRNA endógena y por lo tanto la restauración de sus genes diana podría ser utilizado como una terapia en el cáncer de tiroides16,17.
Figura 1. El inhibidor de miR-146b afecta el crecimiento establecido del tumor tiroideo humano. Las células de expresión de Cal62-luciferase (Cal62-luc) se inyectaron por vía subcutánea. Una vez establecidos los xenoinjertos, se administró por vía intratumoral un inhibidor sintético de la miR (anti-146b) (n-8) o un control negativo (n-4). (A) Línea de tiempo. (B) Izquierda: La imagen muestra la señal bioluminiscente del punto final de los tumores tratados con el software de imágenes in vivo. Derecha: El gráfico muestra el aumento de la luminosidad tumoral en los momentos indicados en xenoinjertos desde el inicio del tratamiento con el inhibidor del miRNA (gris oscuro) o el control negativo (gris). (C) Representación del aumento del resplandor final de los tumores tratados. Los valores representan la media de SEM. *p < 0,05; **p <0.01. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La expresión de proteína PCNA disminuye y la expresión de proteína PTEN aumenta en los tumores tratados con inhibidores de miR-146b. Se obtuvo proteína de los tumores tratados con inhibidor de control o miR-146b para la hincha occidental con anticuerpos contra PCNA o PTEN. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Folículos tiroideos intratumorales de ratón en el modelo ortotópico. Manchado con hematoxilina y eosina (panel superior) y o un anticuerpo a GFP (panel inferior) de los tumores de ratones ortotópicos 28 días después de la inoculación con células positivas de GFP Cal62-luc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El inhibidor de miR-146b afecta el crecimiento establecido del tumor tiroideo humano. Las células expresións de Cal62-luciferase (Cal62-luc) se inyectaron en la glándula tiroides de los ratones. Después de que se establecieron los tumores (3 semanas), se administró sistémicamente un inhibidor sintético del miRNA (anti-146b) (n-8) o un control negativo (n-5). (A) Línea de tiempo. (B) Izquierda: La imagen muestra la señal bioluminiscente del punto final de los tumores tratados con el software de imágenes in vivo. Derecha: El gráfico muestra el aumento de la luminosidad del tumor en los momentos indicados desde el inicio del tratamiento con el inhibidor del miRNA (azul) o el control negativo (verde). (C) Representación del aumento del resplandor final de los tumores tratados. Los valores representan la media de SEM. *p < 0,05. Figura adaptada de Ramírez-Moya et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La expresión de la proteína DICER1 aumenta en los tumores tratados con inhibidores de miR-146b. Inmunohistoquímica con anticuerpo DICER1 en los tumores ortotópicos después del tratamiento con miR-146b-inhbitor o control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un método para estudiar la función in vivo de un miRNA con el fin de entender mejor su papel en la iniciación y progresión del tumor, y su potencial como diana terapéutica en el cáncer de tiroides. Los modelos de xenoinjerto tumoral aquí descritos se basan en el uso de células que pueden ser rastreadas por su señal de bioluminiscencia, permitiendo la medición del crecimiento tumoral in vivo bajo la influencia de un tratamiento. Además, describimos el uso de un tratamiento basado en miRNA para el cáncer de tiroides, que actualmente se encuentra en las primeras etapas.
Primero probamos la viabilidad de un miRNA como diana terapéutica utilizando un modelo de xenoinjerto subcutáneo, en el que se inyectaron células tumorales tiroideas en los flancos de ratones inmunodeficientes. Luego inyectamos por vía intratumoral el antagomiR. Este modelo se puede utilizar para varios tipos de cáncer para probar la importancia de miRNAs específicos o oncomiRs in vivo en las células cancerosas humanas. Las ventajas de esta técnica son que es relativamente fácil de realizar y también rápida, con un sufrimiento animal mínimo. Una desventaja importante de la técnica, sin embargo, es que no imita de cerca la condición humana porque las células se inyectan por vía subcutánea y no en el órgano de origen. Para superar esta limitación, utilizamos un modelo más robusto mediante la realización de la implantación ortotópica quirúrgica de células tumorales tiroideas bioluminiscentes en la tiroides de los ratones. Aunque esta técnica es más complicada y consume mucho tiempo, permite el estudio del crecimiento tumoral en su entorno "nativo", la tiroides. Una fortaleza de este método es que permite el estudio de la diseminación de células tumorales como metástasis, generalmente en los pulmones, que se puede evaluar con software de imágenes in vivo. Otra fortaleza es que la administración sistémica del antagomiR imita un tratamiento humano potencial y permite el análisis de la respuesta tiroidea. Además, la inyección sistémica del antagomiR no causó efectos adversos en los animales, ya que parámetros como los niveles séricos de glucosa o morfología hepática no se modificaron17.
Hay algunos pasos críticos. En el modelo de ratón ortotópico, la inyección de las células tumorales debe realizarse con precisión en la glándula tiroides y no en el tejido vecino. Por lo tanto, es necesario demostrar con inmunohistoquímica que la arquitectura tiroidea se mantiene y que las células inyectadas se han infiltrado en la tiroides y no están presentes con la glándula. Además, tanto para los modelos de xenoinjerto como ortotópico, el tamaño de los tumores en los diferentes grupos de animales debe ser similar al comienzo del tratamiento para seguir un patrón de crecimiento similar en todos los casos. Por último, es importante demostrar que la expresión de los objetivos aguas abajo del microARN (en nuestro caso miR-146b) se altera después del tratamiento con antagomiR
Como posible aplicación futura de este modelo, las células del paciente podrían ser inyectadas en modelos de ratón con el fin de analizar cómo la inhibición de un miRNA podría afectar el crecimiento tumoral de un paciente específico, un enfoque útil para la precisión y la medicina personalizada basada en miRNAs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Raquel Arocha Riesco por su ayuda en el tratamiento y cuidado de ratones. Agradecemos al Dr. J. Blanco (Instituto Catalán de Química Avanzada-CSIC) y al Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (España) por regalar las células CMV-Firefly luc- IRES-EGFP y Cal62-Luc, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
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