Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59322
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Summary

Bu protokol, insan tiroid tümörigenezinin ksenogreft ve ortotopik fare modellerini mikroRNA tabanlı inhibitör tedavileri test etmek için bir platform olarak tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, kodlamayan RNA'ların işlevini ve yeni tedavi hedefleri olarak potansiyellerini incelemek için idealdir.

Abstract

MikroRNA'lar (miRNA'lar), mRNA'ların dengesini bozabilme ve hedef mRNA'ların çevirisini inhibe etme yetenekleri sayesinde gen ekspresyonunun önemli düzenleyicileridir. Çalışmaların giderek artan sayıda kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçleri olarak miRNA'lar tespit etmiş, ve aynı zamanda terapötik hedefler olarak, kanser değerlendirme ve tedavi için ekstra bir boyut ekleyerek. Tiroid kanseri bağlamında, tümörigenez sadece önemli genlerdeki mutasyonlardan değil, aynı zamanda birçok miRNA'nın aşırı ekspresyonundan da kaynaklanmaktadır. Buna göre, tiroid gen ekspresyonunun kontrolünde miRNA'ların rolü kanserde önemli bir mekanizma olarak gelişmektedir. Burada insan tümörü ksenogreft ve ortotopik fare modellerini kullanarak tiroid kanserinde tedavi yöntemi olarak miRNA inhibitörü doğumunun etkilerini incelemek için bir protokol saklıyız. GFP ve luciferase ifade kararlı tiroid tümörhücreleri mühendislik sonra, hücreler tümörler geliştirmek için çıplak fareler içine enjekte edilir, biyolüminesans takip edilebilir. Bir miRNA in vivo inhibisyonu tümör büyümesini azaltabilir ve miRNA gen hedeflerini yükseltebilir. Bu yöntem, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine ek olarak, in vivo kararlı bir miRNA önemini değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

Tiroid kanseri artan bir insidansı ile bir endokrin malignite, genel olarak iyi bir sonuç olmasına rağmen1. Bununla birlikte, bazı hastalarda tedavi edilemez ve moleküler bazlar kötü anlaşılmaktadır hastalığın agresif formları geliştirmek2.

miRNA'lar, genellikle hedef haberci RNA'ların (mRNA'lar) 3' çevirisiz bölgesine (3'UTR) bağlanarak, mRNA bozulmasını veya çevirisel baskıyı tetikleyen, birçok dokuda gen ekspresyonunu düzenleyen 22 nükleotid-uzun kodlamayan RNA'lardır. 3.2.2 , 4. MikroRNA ekspresyonunun deregülasyonunun kanserin bir özelliği olduğunu gösteren kanıtlar artmaktadır, çünkü bu moleküller çoğalan sinyalizasyon, göç, invazyon ve metastazı modüle eder ve apoptoza karşı direnç sağlayabilir. 5,6. Son yıllarda, birçok çalışma kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçler olarak miRNA'lar tespit etmiş yanı sıra terapötik hedefler7, kanser değerlendirme ve tedavisi için yeni bir boyut sağlayan.

miRNA'lar insan moleküler onkolojisinde insan tiroid neoplazmlarınınanahtaritici leri olarak 8,9,10,11,12olarak merkeze alınmıştır. MiRNA'lar arasında yukarı düzenlenmiş, miR-146b papiller tiroid karsinomu (PTC) tümörlerinde aşırı ifade edilir ve hücre proliferasyonlarını önemli ölçüde artırmış ve agresiflik ve kasvetli prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir6, 12.000.0 , 13.000 , 14.000 , 15. Ayrıca, miR-146b farklılaşma dahil çeşitli tiroid genleri düzenler12, ve ayrıca Önemli tümör baskılayıcı genler Gibi PTEN16 ve DICER117. Kanser biyolojisi önemine rağmen, miRNA tabanlı kanser tedavisi hala erken aşamalarında, ve çok az çalışma tiroid kanseri ele var - endokrin tümörlerin en sık18. Burada insan kaynaklı tümörler ile iki farklı fare modelleri kullanarak bir protokol tarif, hangi sentetik bir miRNA inhibitörü uygulanması (antagomiR) özellikle bir hücresel miRNA tümör büyümesini engelleyebilir. İlk olarak ortak bir ksenogreft modeli kullandık ve antagomir'in lokal intratümör uygulaması tümör biyolüminesansında azalma olarak ölçülen tümör büyümesini azalttı16. İnsan tümörü ilerlemesini taklit eden sağlam fare modellerinin oluşturulması benzersiz terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gerekli olduğundan, primer insan tümörlerinin ortotopik implantasyonu yeni ilaçların klinik doğrulaması için daha değerli bir platformdur. deri altı implantasyon modelleri. Böylece, antagomir terapötik potansiyelini daha iyi değerlendirmek için, aynı sonuçları elde, kan dolaşımında sistemik doğum ile bir ortotopik fare modeli kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, İspanya) Etik Komitesi'nin onayı ile Avrupa Topluluğu Kanunu (86/609/EEC) ve İspanyol yasalarına (R.D. 1201/2005) uygun olarak hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir.

1. Hücrelerin böğürtlen aşısı ve intratümöral antagomiR tedavisi

  1. Hücre hazırlama
    1. Mühendis bir Cal62 insan tiroid kanseri hücre hattı (KRASG12R ve p53A161D mutasyonlar) oluşturan GFP ve luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP) ifade eden bir transgenik yapı aşırı ifade etmek için. Transgenik hücreleri antibiyotik direnci ile veya akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri sıralayarak seçin.
    2. Penisilin, streptomisin ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle' s orta (DMEM) hücreleri 37 °C ve% 5 CO2büyümek.
    3. 4 °C'de 50 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 x 106 hücreyi askıya alın.
  2. Farelerin yanlarına hücre aşısı
    1. Bazal membran matris aynı miktarda hücreleri karıştırın. Örneğin, 50 μL PBS'lik 1 x 106 hücreyi 50 μL'lik bazal membran matrisine ekleyin (Bkz. MalzemeTablosu) ve hafifçe karıştırın.
      Not:
    2. 27G 1/2'' (0.4x13 mm) iğneile 1 mL insülin şırınga kullanarak 6 haftalık immünoeksik BALB/c nu/nu farelerin sol kanadına numunenin 100 μL'sini (PBS + bazal membran matrisindeki hücreler) deri altına enjekte edin.
  3. İntratümöral antagomiR tedavisi.
    1. AntagomiR'i (bkz. MalzemelerTablosu) veya 500 μL RNase içermeyen distile sudaki negatif kontrolü askıya alın.
    2. Enjeksiyondan önce, her enjeksiyon için bir in vivo doğum reaktifi (Bkz. MalzemelerTablosu) ile birlikte antagomiR veya kontrol2 nmol hazırlayın.
      1. Önce antagomiR çözeltisini (Bkz. MalzemelerTablosu) ve karmaşıklık tamponunu (Malzeme Tablosu'nabakınız) 1:1 oranında karıştırın. Örneğin, 80 μL miRNA inhibitörü çözeltisi (16 nmol) ila 80 μL karmaşıklık tamponu ekleyin (in vivo teslimat reaktif kitine dahil edilmiştir, bkz. MalzemeTablosu).
      2. In vivo teslimat reaktifini oda sıcaklığına getirin. 1,5 mL'lik bir tüpe 160 μL ekleyin ve hemen 160 μL seyreltilmiş antagomiR çözeltisi ekleyin. Kalan reaktifi -20 °C'ye döndürün. Gerekirse reaktifi 4 °C'de bir hafta kadar eritmeden sonra saklayın.
      3. Girdap hemen (10 s) in vivo teslimat reaktif-antagomiR karmaşıklığını sağlamak için.
      4. In vivo delivery reagent-antagomiR karışımını 50 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. Numuneyi kurtarmak için tüpü kısa bir süre santrifüj edin.
      5. 1360 μL PBS pH 7.4 ekleyerek kompleksi 6 kat seyreltin ve iyice karıştırın.
      6. Reaktif-antagomiR kompleksinin (8 fare/durum) in vivo teslimine devam edin veya kompleksi enjeksiyondan bir hafta öncesine kadar 4 °C'de saklayın. Her tümöre 200 μL intratümöral enjekte edin (2 nmol antagomiR).
        NOT: Antagomir'in hacmi ve miktarı tümör hacminden bağımsızdır.
    3. 2 hafta boyunca her hafta (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) 3 kez tedavi gerçekleştirin.
  4. Tümör büyümesinin analizi
    1. D-luciferin substratının 40 mg/mL çözeltisinin 50 μL'sini enjekte edin (bkz. MalzemeTablosu) her zaman noktasında 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) iğneile 1 mL şırınga ile subkutan olarak.
      1. 8 dk enjeksiyon sonrası, oksijen ile karışık% 3 isofluran kullanarak fareler anestezi. Anestezi düzeyini pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile değerlendirin ve anestezik doğumu cerrahi düzlemi korumak için uygun şekilde ayarlayın.
      2. Kurutmayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
    2. In vivo görüntüleme yazılımı ile biyolüminesans sinyali görüntüleyin (bkz.
      NOT: Kaliperler de tümör hacmi ve tümör büyümesini ölçmek için kullanılabilir.
    3. Biyolüminesans sinyalleri alındıktan sonra, her iki tedaviyi karşılaştırarak tümöral büyümeyi analiz edin ve t-testi ile önemini belirleyin. Grup içi varyansını analiz etmek için SEM'yi kullanın.
  5. Tümör eksizyonu
    1. AntagomiR tedavisinin bitiminden yedi gün sonra, fareleri kurban edin, tümörü çıkarın ve ileride analiz için protein ve/veya RNA alın. Alternatif olarak, bölüm tümörler ve immünohistokimya için onları düzeltmek.

2. Hücrelerin tiroid ortotopik aşısı ve sistemik antagomiR tedavisi

  1. Hücre hazırlama
    1. GFP ve luciferase'i oluşturan transgenik yapıyı aşırı eksprese etmek için Cal62 insan tiroid kanseri hücre hattı tasarla. Transgenik hücreleri antibiyotik direnci ile veya akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri sıralayarak seçin.
    2. Antibiyotikler (penisilin ve streptomisin) ve 37 °C'de %10 FBS ve %5 CO2ile desteklenen DMEM'de bu hücreleri yetiştirin.
    3. PBS'nin 5 μL'sinde 1 x 105 hücreyi askıya alın.
  2. Farelerin tiroid bezine hücre aşısı
    1. 7 haftalık BALB/c nu/nu farelere 100 μL analjezik (buprenorfin) ve 100 μL antibiyotik (sefalosporin) deri altına enjekte edin. Enjeksiyon bölgesini alkolle dezenfekte edin.
    2. Hücre çözeltisinin 5 μL'sini farelerin tiroid bezine enjekte edin.
      1. Oksijen ile karışık% 3 izofluran kullanarak fare anestezi ve steril bir akış kabine bir stereomikroskop altında yerleştirin.  Anestezi düzeyini pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile değerlendirin ve anestezik doğumu cerrahi düzlemi korumak için uygun şekilde ayarlayın.
      2. Kurutmayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
      3. Her fare için, iodopovison ile boyun dezenfekte ve makas ile deride yaklaşık 2 cm bir kesi yapmak. Açıldıktan sonra tükürük bezlerini yerinden ederek boynu ortaya çıkar.
      4. Trakea ve tiroid bezini ortaya çıkarmak için diseksiyon forceps ve / veya makas kullanarak kayış kasları diseksiyon. 10 μL mikrolitre şırınga kullanarak, hücre çözeltisinin 5 μL'ini sağ tiroid lobule enjekte edin, krikoid kıkırdağın yanında yer alır.
      5. Tükürük bezlerini yeniden konumlandırın ve kesiyi örgülü, kaplamalı, emilemez dikişler kullanarak ipekle süsler.
      6. Yara bölgesine iyodopovion ekleyin ve anestezi den kurtarır iken bir termik battaniye üzerine fare yerleştirin.
    3. Ertesi gün ameliyat sonrası, subkutan analjezik enjekte (buprenorfin) ve 1 hafta boyunca içme suyu 250 mL içine sıvı ibuprofen (40 mg / mL) 3 mL ekleyin.
  3. Sistemik antagomiR tedavi
    NOT: Biyolüminesans sinyali tespit edildiğinde, hücre enjeksiyonundan 2-3 hafta sonra bu adımı atın.
    1. Distile RNase içermeyen suda antagomiR'i veya negatif kontrolü askıya alın.
    2. Enjeksiyondan önce, her enjeksiyon için in vivo doğum reaktifi ile birlikte antagomiR veya kontrol 7 nmol hazırlayın.
      1. AntagomiR ve in vivo delivery reaktif çözüm hazırlığı için adım 1.3'e bakın, ancak fare başına miRNA inhibitöründen 7 nmol ekleyin.
    3. Farenin venöz sinüs retro-orbital enjeksiyon ile intravenöz çözüm uygulayın. Anestezi yi teşvik etmek için isoflurane kullanın.
      NOT: Anestezi düzeyini pedal refleksi (sert ayak ucutu) ile değerlendirin.
    4. Fareleri haftada 3 kez (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) 2 hafta boyunca tedavi edin.
  4. Tümör büyümesinin analizi
    1. Tümör büyümesini hesaplamak için haftada iki kez tümör biyolüminesans sinyalini belirleyin.
      1. Deri altı enjeksiyon yoluyla her zaman noktasına D-luciferin substrat40 mg/mL çözeltisi 50 μL enjekte edin.
      2. 8 dk enjeksiyon sonrası, oksijen ile karışık% 3 izofluran kullanarak fareler anestezi ve in vivo görüntüleme yazılımı ile biyolüminesans sinyali görüntü.
    2. Biyolüminesans sinyalleri alındıktan sonra, her iki tedaviyi karşılaştırarak tümöral büyümeyi analiz edin ve t-testi ile önemini belirleyin. Grup içi varyansını analiz etmek için SEM'yi kullanın.
  5. Tümör eksizyonu
    1. AntagomiR tedavi süresinin bitiminden yedi gün sonra, fareleri kurban edin, tümörü çıkarın ve ileride analiz için protein ve/veya RNA alın. Alternatif olarak, bölüm tümörler ve immünohistokimya için onları düzeltmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir miRNA'nın nötralizasyonunun tümör büyümesini baskılayıp baskılameyeceğini belirlemek için iki farklı fare modeli kullandık. Buna göre, insan tümör tiroid Cal62-luc hücreleri subkutan bir ksekograf modeli oluşturmak için çıplak farelerin yanlarına enjekte edildi. İki hafta sonra tümörler oluşturuldu ve kaliperlerle ölçüldü. Bu noktada, farelere miR-146b inhibitörü veya uygun bir kontrol ile intratümöral enjekte edildi ve tümör hacmi iki hafta daha takip edildi (Şekil1A). Şekil1B'de gösterildiği gibi miR-146b inhibitörü (anti-146b) (n=8) ile enjekte edilen tümörlerin büyümesi negatif kontrol grubuna (n=4) veya tuzlu kontrol grubuna (gösterilmemiştir) göre anlamlı olarak bastırıldı. miRNA'lar gen regülasyonunun önemli bir özelliğidir, çünkü çeşitli hedef mRNA'ları düzenlerler. Buna göre, oncomiRs tümör baskılayıcı genlerin önemli düzenleyicileridir. Bu protokol, miRNA inhibitörü ile tedaviden sonra test edilebilen bu genlerin intratümöral ekspresyon düzeylerinin analizine olanak sağlar. Buna ek olarak, bazı proliferasyon belirteçlerinin düzeyleri de incelenebilir, prolifer hücre nükleer antijeninin alt ekspresyonu ile gösterilmiştir (PCNA) antagomir-tedavi edilen tümörlerde kontrol-tedavi edilen tümörlere göre (Şekil2). Ayrıca miRNA-hedeflerin kurtarma tümör çıkarılan RNA veya protein analizi ile incelenebilir, antagomiR PTEN yüksek ekspresyonu ile gösterildiği gibi (anti-146b) tedavi edilen tümörler (Şekil2). Topluca, bu veriler bir miRNA in vivo inhibisyonu etkili olduğunu ve tiroid kanseri tedavisi için terapötik olarak istismar edilebilir ortaya koymaktadır.

MiRNA inhibitörü terapötik potansiyelini daha iyi değerlendirmek ve fare modelini geliştirmek için, insan tümörü tiroid Cal62-luc hücrelerinin doğrudan çıplak farelerin sağ tiroid lobuna tohumlandığı bir ortotopik model oluşturduk. 3 hafta sonra, tiroid tümörleri kuruldu, farelerin boynunda biyolüminesans sinyalleri ile gösterildiği gibi ve brüt doku analizi ve immünohistokimya, hematoksilin ve eozin ve Hücrelerin GFP boyama, saygı ile. Şekil3'te gösterildiği gibi, kolloidi çevreleyen epitel hücreleri fareden tiroid folikül mimarisini göstermektedir. GFP-pozitif hücreler foliküller ile serpiştirilmiş, açıkça insan Cal62 hücreleri doğru enjekte edilmiş ve fare tiroid içinde çoğalır gösteren. Tümörler oluştuktan sonra 13 fareye intravenöz olarak miR-146b inhibitörü (n=8) veya uygun bir kontrol (n=5) enjekte ettik ve tümör hacmi iki hafta daha takip edildi (Şekil4A). Sistemik antagomir ile tedavi edilen grupta tümör büyümesinin anlamlı olarak azaldığı saptadık (Şekil4B). Özellikle primer tümörde yeni tanımlanan miR-146b-target DICER1'in ekspresyonu anti-miR-146b tedavisinden sonra artmıştır (Şekil5). Bu veriler endojen miRNA ekspresyonunun inhibisyonu ve bu nedenle hedef genlerin restorasyontiroid kanserinde bir tedavi olarak kullanılabilir olduğunu göstermektedir16,17.

Figure 1
Şekil 1. MiR-146b-inhibitörü kurulan insan tiroid tümörü büyümesini bozar. Cal62-luciferase ifade hücreleri (Cal62-luc) deri altına enjekte edildi. Ksenogreftler kurulduktan sonra intratümöral olarak sentetik miR inhibitörü (anti-146b) (n=8) veya negatif kontrol (n=4) uygulandı. (A) Zaman çizelgesi. (B) Sol: Görüntü, in vivo görüntüleme yazılımı ile görüntülenerek tedavi edilen tümörlerin son nokta biyolüminesans sinyalini gösterir. Sağ: Grafik miRNA inhibitörü (koyu gri) veya negatif kontrol (gri) ile tedavi başlangıcından itibaren ksenogreftlerde belirtilen zamanlarda tümör parlaklığı artış gösterir. (C) Tedavi edilen tümörlerin uç noktası parlaklığı artışının gösterimi. Değerler ortalama ± SEM. *p < 0.05; **p <0.01. Şekil Ramírez-Moya ve ark.16uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. MIR-146b inhibitörü ile tedavi edilen tümörlerde PCNA protein ekspresyonu azalır ve PTEN protein ekspresyonu artar. Kontrol veya miR-146b inhibitörü ile tedavi edilen tümörlerden pcna veya PTEN antikorları ile batı lekeleme için protein elde edildi. Şekil Ramírez-Moya ve ark.16uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Ortotopik modelde intratümöral fare tiroid folikülleri. Cal62-luc GFP-pozitif hücrelerle aşılamadan 28 gün sonra ortotopik fare tümörlerinin hematoksilin ve eozin (üst panel) ve gfp (alt panel) antikor ile boyanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. MiR-146b-inhibitörü kurulan insan tiroid tümörü büyümesini bozar. Cal62-luciferase ifade hücreleri (Cal62-luc) farelerin tiroid bezi enjekte edildi. Tümörler kurulduktan sonra (3 hafta) sentetik miRNA inhibitörü (anti-146b) (n=8) veya negatif kontrol (n=5) sistemik olarak uygulandı. (A) Zaman çizelgesi. (B) Sol: Görüntü, in vivo görüntüleme yazılımı ile görüntülenerek tedavi edilen tümörlerin son nokta biyolüminesans sinyalini gösterir. Sağ: Grafik miRNA inhibitörü (mavi) veya negatif kontrol (yeşil) ile tedavi başlangıcından itibaren belirtilen zamanlarda tümör parlaklık artışı gösterir. (C) Tedavi edilen tümörlerin uç noktası parlaklığı artışının gösterimi. Değerler ortalama ± SEM. *p < 0.05'i temsil ediyor. Şekil Ramírez-Moya ve ark.17uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. MIR-146b inhibitörü ile tedavi edilen tümörlerde DICER1 protein ekspresyonu artar. MiR-146b-inhbitor veya kontrol ile tedavi sonrası ortotopik tümörlerde DICER1 antikorile immünohistokimya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, tümör inisiyasyonu ve ilerlemesindeki rolünü ve tiroid kanserinde tedavi edici bir hedef olarak potansiyelini daha iyi anlamak için miRNA'nın in vivo fonksiyonunu incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan tümör ksenogreft modelleri, biyolüminesans sinyali ile izlenebilen hücrelerin kullanımına dayanmaktadır ve bir tedavinin etkisi altında in vivo'da tümör büyümesinin ölçülebilir. Buna ek olarak, tiroid kanseri için miRNA tabanlı bir tedavi kullanımını açıklamak, şu anda erken aşamalarında.

İlk olarak tiroid tümör hücrelerinin immünoeksik farelerin yanlarına enjekte edildiği deri altı ksenogreft modeli kullanılarak bir miRNA'nın fizibilitesini terapötik hedef olarak test ettik. Daha sonra intratümöral antagomiR enjekte etti. Bu model insan kanser hücrelerinde vivo belirli miRNA veya oncomiRs önemini test etmek için çeşitli kanser türleri için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajları nispeten gerçekleştirmek için basit ve aynı zamanda hızlı, minimal hayvan acı ile olmasıdır. Ancak tekniğin en büyük dezavantajı, hücrelerin menşe organına değil deri altı enjekte edildiği için insan durumunu yakından taklit etmemesidir. Bu sınırlamayı aşmak için, biyolüminesans tiroid tümör hücrelerinin farelerin tiroidine cerrahi ortotopik implantasyonu yaparak daha sağlam bir model kullandık. Bu teknik daha karmaşık ve zaman alıcı olmasına rağmen, onun "yerli" ortamda tümör büyüme çalışma sağlar, tiroid. Bu yöntemin bir gücü metastaz olarak tümöral hücre yayılması çalışma izin olmasıdır, genellikle akciğerlerde, in vivo görüntüleme yazılımı ile değerlendirilebilir. Başka bir güç antagomiR sistemik doğum potansiyel bir insan tedavi taklit ve tiroid yanıtı analizi için izin verir. Ayrıca, antagomiR sistemik enjeksiyon u, serum glukoz düzeyleri veya karaciğer morfolojisi gibi parametreler17değiştirilmeden hayvanlar üzerinde olumsuz etkilere neden olmadı.

Birkaç kritik adım vardır. Ortotopik fare modelinde tümörhücrelerinin enjeksiyonu komşu dokularda değil, tiroid bezinde tam olarak yapılmalıdır. Bu nedenle, tiroid mimarisinin korunup enjekte edilen hücrelerin tiroide sızdığını ve bezi ile birlikte bulunmadığını immünhistokimya ile göstermek gerekir. Buna ek olarak, hem ksenogreft hem de ortotopik modellerde, farklı hayvan gruplarındaki tümörlerin büyüklüğü, her olguda benzer bir büyüme paterni izleyebilmek için tedavinin başlangıcında benzer olmalıdır. Son olarak, mikroRNA'nın (bizim durumumuzda miR-146b) aşağı doğru olan hedeflerin ekspresyonunun antagomiR tedavisinden sonra değiştirildiğini göstermek önemlidir.

Bu modelin gelecekteki olası bir uygulaması olarak, hasta hücreleri fare modellerine enjekte edilebilmek için miRNA'nın inhibisyonunun belirli bir hastanın tümör büyümesini nasıl etkileyebileceğini analiz etmek için, hassas ve kişiselleştirilmiş tıp için yararlı bir yaklaşım miRNA'lar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Raquel Arocha Riesco'ya farelerin tedavisi ve bakımındaki yardımları için minnettarız. Biz Dr J. Blanco (Katalonya Enstitüsü Advance Chemistry-CSIC için) ve Dr E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barselona (İspanya) cmv-Firefly luc- IRES-EGFP ve Cal62-Luc hücreleri, sırasıyla hediye için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor Thermo Fisher 4464088 In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration Corning #354248
DICER antibody Abcam ab14601 IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent Thermo Fisher IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 Thermo Fisher 4464077 In Vivo Ready
PCNA antibody Abcam ab92552 WB: 1/2,000
PTEN antibody Santa Cruz sc-7974 WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122799 Diluted in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
  3. Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
  4. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  5. Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
  6. Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
  7. Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
  8. Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
  9. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
  10. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
  11. Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
  12. Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
  13. Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
  14. Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
  15. Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
  16. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
  17. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , In press (2019).
  18. Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).

Tags

Kanser Araştırma Sayı 150 miRNA inhibitörü tiroid tümör büyümesi fare modelleri miRNA tabanlı tedavi miR-146b tiroid kanseri
Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L.,… More

Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Acuña-Ruiz, A., Zaballos, M. A., Santisteban, P. In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59322, doi:10.3791/59322 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter