Summary
Dit protocol beschrijft xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen van menselijke schildklier tumorvorming als een platform voor het testen van microRNA-gebaseerde remmer behandelingen. Deze aanpak is ideaal voor het bestuderen van de functie van niet-coderende Rna's en hun potentieel als nieuwe therapeutische doelen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie door hun vermogen om mRNA te destabiliseren en de vertaling van doelwit Mrna's te remmen. Een toenemend aantal studies heeft miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, en ook als therapeutische doelen, waardoor een extra dimensie wordt toegevoegd aan de evaluatie en behandeling van kanker. In de context van schildklierkanker leidt tumorigenese niet alleen tot mutaties in belangrijke genen, maar ook uit de overexpressie van vele Mirna's. Dienovereenkomstig evolueert de rol van miRNAs in de controle van de schildklier genexpressie als een belangrijk mechanisme in kanker. Hierin presenteren we een protocol om de effecten van de levering van Mirna-remmers te onderzoeken als een therapeutische modaliteit bij schildklierkanker met behulp van humane tumor xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen. Na engineering stabiele schildklier tumorele cellen die GFP en Luciferase uitdrukken, cellen worden geïnjecteerd in naakt muizen om tumoren te ontwikkelen, die kan worden gevolgd door bioluminescentie. De in vivo remming van een miRNA kan tumorgroei en upregulate miRNA gentargets verminderen. Deze methode kan worden gebruikt om het belang van een bepaald miRNA in vivo te beoordelen, naast het identificeren van nieuwe therapeutische doelen.
Introduction
Schildklierkanker is een endocriene maligniteit met een toenemende incidentie, hoewel het in algemene termen een goed resultaat heeft1. Niettemin ontwikkelen sommige patiënten agressieve vormen van de ziekte die onbehandelbaar zijn en de moleculaire basen slecht worden begrepen2.
miRNAs zijn 22-nucleotide lange niet-Codeer Rna's die de genexpressie in veel weefsels reguleren, meestal door de binding van het basis koppel aan de 3 ' untranslational Region (3 ' UTR) van de target Messenger Rna's (Mrna's), waardoor mRNA-degradatie of translationele onderdrukking wordt geactiveerd 3 , 4. er is toenemend bewijs dat aantoont dat de deregulering van de microRNA-uitdrukking een kenmerk is van kanker, aangezien deze moleculen proliferatieve signalering, migratie, invasie en metastase moduleren en resistentie kunnen bieden tegen apoptosis 5,6. In de afgelopen jaren hebben veel studies miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor kankerdiagnose en prognose, evenals therapeutische doelstellingen7, die een nieuwe dimensie bieden aan de evaluatie en behandeling van kanker.
miRNAs heeft een centrale plaats in humane moleculaire oncologie als belangrijkste drijfnetten voor menselijke schildklier tumoren8,9, 10,11,12. Onder de miRNAs up-gereguleerd, is miR-146b sterk overuitgedrukt in papillaire schildkliercarcinoom (PTC) tumoren en bleek de celproliferatie significant te verhogen en geassocieerd te worden met agressiviteit en Dismal prognose6, 12 , 13 , 14 , 15. Bovendien regelt miR-146b verschillende schildklier genen die betrokken zijn bij differentiatie12, en ook belangrijke tumor SUPPRESSOR genen zoals PTEN16 en DICER117. Ondanks hun belang in de Kankerbiologie, miRNA gebaseerde kankertherapie is nog in zijn vroege stadia, en zeer weinig studies hebben aangepakt schildklierkanker-de meest frequente van de endocriene tumoren18. Hier beschrijven we een protocol met behulp van twee verschillende Muismodellen met mens-afgeleide tumoren, waarin de toediening van een synthetische miRNA-remmer (antagomiR) die specifiek een cellulaire miRNA remt kan tumorgroei blokkeren. We eerst gebruikt een gemeenschappelijk xenotransplantaatmodellen is model, en de lokale intratumor administratie van een antagomir verminderde tumorgroei gemeten als een afname van de tumor bioluminescentie16. Omdat de oprichting van robuuste Muismodellen die de menselijke tumorprogressie nabootsen essentieel is om unieke therapeutische benaderingen te ontwikkelen, is orthotopic implantatie van primaire menselijke tumoren een waardevoller platform voor klinische validering van nieuwe geneesmiddelen dan subcutane implantatie modellen. Om het therapeutische potentieel van de antagomiR beter te kunnen beoordelen, gebruikten we dus een orthotopic muismodel met systemische toevoer in de bloedstroom, waarbij dezelfde resultaten werden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het Europese Gemeenschapsrecht (86/609/EEG) en de Spaanse wet (R.D. 1201/2005), met goedkeuring van de ethische commissie van de Consejo Superior de onderzoekt Aciones Científicas (CSIC, Spanje).
1. flank inoculatie van cellen en intratumoral antagomiR behandeling
- Voorbereiding van de cel
- Ingenieur een Cal62 menselijke schildklierkanker cellijn (krasG12R en p53A161D mutaties) om een transgene constructie te overdrukken die constitutief de uitdrukking GFP en plaats (CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP). Selecteer de transgene cellen door antibioticaresistentie of door het sorteren van de GFP-positieve cellen met Flow cytometrie.
- Kweek de cellen in het gemodificeerde Adelaar's medium (DMEM), aangevuld met penicillaire, streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO2.
- Onderbreek 1 x 106 cellen in 50 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °c.
- Celinenting in de flanken van muizen
- Meng de cellen met dezelfde hoeveelheid kelder membraan matrix. Voeg bijvoorbeeld 1 x 106 cellen in 50 μL PBS toe aan 50 μL van de kelder membraan matrix (Zie tabel met materialen) en meng zachtjes.
Opmerking: - Injecteer 100 μL van het monster (cellen in PBS + kelder membraan matrix) subcutaan in de linker flank van 6-weekse-oude immunodeficiënte BALB/c nu/nu muizen met behulp van een 1 ml Insulinespuit met een 27g 1/2 ' ' (0,4 x13 mm) naald.
- Meng de cellen met dezelfde hoeveelheid kelder membraan matrix. Voeg bijvoorbeeld 1 x 106 cellen in 50 μL PBS toe aan 50 μL van de kelder membraan matrix (Zie tabel met materialen) en meng zachtjes.
- Intratumoral antagomiR behandeling.
- Onderbreek de antagomiR (Zie tabel van de materialen) of de negatieve controle in 500 ΜL RNase-vrij gedestilleerd water.
- Bereid vóór de injectie 2 nmol van de antagomiR of de controle samen met een in vivo afleverings reagens (Zie tabel van de materialen) voor elke injectie.
- Meng eerst de antagomiR-oplossing (Zie tabel met materialen) en de complexatiebuffer (zie tabel met materialen) in een verhouding van1:1. Voeg bijvoorbeeld 80 μL miRNA-remmer oplossing (16 nmol) toe aan 80 μL complexvormende buffer (opgenomen in de in vivo leveringreagenskit, Zie tabel met materialen).
- Breng het in vivo lever reagens op kamertemperatuur. Voeg 160 μL toe aan een buis van 1,5 mL en voeg onmiddellijk 160 μL verdunde antagomiR oplossing toe. Retourneer het resterende reagens tot-20 °C. Bewaar het reagens indien nodig gedurende maximaal één week na ontdooien bij 4 °C.
- Vortex onmiddellijk (10 s) om te zorgen voor de complexering van de in vivo lever reagens-antagomiR.
- Inbroed de in vivo afgifte reagens-antagomiR mengsel gedurende 30 min bij 50 °C. Centrifugeer de buis kort om het monster te herstellen.
- Verdun de complexe 6-voudige door toevoeging van 1360 μL PBS pH 7,4 en meng goed.
- Ga verder met in vivo levering van het reagens-antagomiR complex (8 muizen/aandoening), of bewaar het complex bij 4 °C gedurende maximaal één week voorafgaand aan de injectie. Injecteer 200 μL intratumorally in elke tumor (2 nmol van antagomiR).
Opmerking: het volume en de hoeveelheid van de antagomiR is onafhankelijk van het tumor volume.
- Voer de behandeling 3 keer per week uit (maandag, woensdag en vrijdag) gedurende 2 weken.
- Analyse van tumorgroei
- Injecteer 50 μL van een 40 mg/mL oplossing van D-Luciferin substraat (Zie tabel van de materialen) subcutaan op elk tijdstip met een 1 ml spuit met een 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm) naald.
- Bij 8 min na de injectie, anesthetiseren de muizen met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof. Evalueer het niveau van anesthesie door pedaal reflex (stevige teen pinch) en pas verdoving levering zo nodig om chirurgische vliegtuig te handhaven.
- Breng oogheelkundige zalf aan beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Beeld het bioluminescente signaal met in vivo imaging software (Zie tabel van de materialen).
Opmerking: remklauwen kunnen ook worden gebruikt om het tumor volume en de tumorgroei te meten. - Nadat de Bioluminescentie signalen zijn verkregen, analyseert u de tumorele groei die beide behandelingen vergelijkt en bepaalt u de significantie met behulp van een t-toets. Voor het analyseren van de afwijking binnen de groep gebruikt u de SEM.
- Injecteer 50 μL van een 40 mg/mL oplossing van D-Luciferin substraat (Zie tabel van de materialen) subcutaan op elk tijdstip met een 1 ml spuit met een 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm) naald.
- Tumor excisie
- Zeven dagen na het einde van de behandeling met antagomiR, offeren de muizen, accijnzen de tumor en extract eiwit en/of RNA voor toekomstige analyse. Als alternatief, sectie de tumoren en Fix ze voor immunohistochemie.
2. schildklier orthotopic inoculatie van cellen en systemische antagomiR behandeling
- Voorbereiding van de cel
- Ingenieur een Cal62 menselijke schildklierkanker cellijn te overdrukken een transgene constructie die constitutief spreekt GFP en Luciferase. Selecteer de transgene cellen door antibioticaresistentie of door het sorteren van de GFP-positieve cellen met Flow cytometrie.
- Deze cellen groeien in DMEM aangevuld met antibiotica (penicillaire en streptomycine) en 10% FBS bij 37 °C en 5% CO2.
- 1 x 105 cellen in 5 μL PBS opschorten.
- Celinenting in de schildklier van muizen
- Injecteer 100 μL analgeticum (buprenorfine) en 100 μL antibioticum (cefalosporin) subcutaan in de 7-weekse-oude BALB/c nu/nu muizen. Desinfecteer de injectieplaats met alcohol.
- Injecteer 5 μL van de celoplossing in de schildklier van de muizen.
- Anesthetiseer de muis met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof en plaats het onder een stereomicroscoop in een steriele stroom kast. Evalueer het niveau van anesthesie door pedaal reflex (stevige teen pinch) en pas verdoving levering zo nodig om chirurgische vliegtuig te handhaven.
- Breng oogheelkundige zalf aan beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Desinfecteer voor elke muis de nek met iodopovidon en maak een incisie van ongeveer 2 cm in de huid met een schaar. Eenmaal geopend, bloot de nek door het verplaatsen van de speekselklieren.
- Dissect de spieren van de riem met behulp van dissectie Tang en/of schaar om de luchtpijp en de schildklier bloot. Injecteer met een spuit van 10 μL microliter 5 μL van de celoplossing in de juiste schildklier lobule, gelegen aan de zijkant van het cricoïde kraakbeen.
- Herpositioneer de speekselklieren en hecht de incisie met zijde met behulp van gevlochten, gecoate, niet-absorbabele hechtingen.
- Voeg iodopovidone toe aan het wondgebied en plaats de muis op een thermische deken terwijl het herstelt van de anesthesie.
- De volgende dag na de operatie, injecteren subcutaan analgetische (buprenorfine) en voeg 3 mL vloeibare ibuprofen (40 mg/mL) in 250 mL van het drinkwater voor 1 week.
- Systemische antagomiR behandeling
Opmerking: Voer deze stap uit 2-3 weken na de injectie van de cel, wanneer het bioluminescente signaal detecteerbaar is.- De antagomiR of de negatieve controle in gedestilleerd RNase-vrij water opschorten.
- Bereid vóór de injectie 7 nmol van de antagomiR of de controle samen met het in vivo lever reagens voor elke injectie.
- Voor de antagomiR en de in vivo levering reagens oplossing voorbereiding Zie stap 1,3 maar voeg 7 nmol van de miRNA-remmer per muis toe.
- Dien de oplossing intraveneus toe door een retroorbitale injectie van de veneuze sinus van de muis. Gebruik Isofluraan om anesthesie te induceren.
Opmerking: Evalueer het niveau van anesthesie met pedaal reflex (stevige teen pinch). - Behandel de muizen 3 keer per week (maandag, woensdag en vrijdag) gedurende 2 weken.
- Analyse van tumorgroei
- Bepaal het tumor bioluminescente signaal tweemaal per week om de tumorgroei te berekenen.
- Injecteer 50 μL van een 40 mg/mL oplossing van D-Luciferin substraat op elk tijdstip via subcutane injectie.
- Na 8 minuten na de injectie anesthetiseren de muizen met behulp van 3% Isofluraan vermengd met zuurstof en beeld het bioluminescente signaal met in vivo imaging software.
- Nadat de Bioluminescentie signalen zijn verkregen, analyseert u de tumorele groei die beide behandelingen vergelijkt en bepaalt u de significantie met behulp van een t-toets. Voor het analyseren van de afwijking binnen de groep gebruikt u de SEM.
- Bepaal het tumor bioluminescente signaal tweemaal per week om de tumorgroei te berekenen.
- Tumor excisie
- Zeven dagen na afloop van de antagomiR behandelingsperiode, offeren de muizen, accijnzen de tumor en extract eiwit en/of RNA voor toekomstige analyse. Als alternatief, sectie de tumoren en Fix ze voor immunohistochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten twee verschillende muizen modellen om te bepalen of de neutralisatie van een miRNA de tumorgroei kon onderdrukken. Dienovereenkomstig werden humane tumor schildklier Cal62-Luc cellen subcutaan geïnjecteerd in de flanken van naakte muizen om een xenograaf model te genereren. Na twee weken, tumoren werden vastgesteld en kon worden gemeten met remklauwen. Op dat moment werden muizen intratumoreel geïnjecteerd met de miR-146b-remmer, of een geschikte controle, en het tumor volume werd gevolgd voor nog eens twee weken (Figuur 1a). Zoals weergegeven in Figuur 1b, de groei van tumoren intratumorally geïnjecteerd met de miR-146b-remmer (anti-146b) (n = 8) werd aanzienlijk onderdrukt met betrekking tot de negatieve controlegroep (n = 4) of de fysiologische zout controlegroep (niet weergegeven). miRNAs zijn een belangrijk kenmerk van genregulatie, omdat ze verschillende doel-Mrna's reguleren. Dienovereenkomstig zijn oncomiRs belangrijke regulatoren van tumor suppressor genen. Dit protocol maakt de analyse mogelijk van de intratumoral expressieniveaus van deze genen, die kunnen worden getest na behandeling met de miRNA-remmer. Bovendien, de niveaus van sommige proliferatie markers kunnen ook worden bestudeerd, geïllustreerd door de lagere uitdrukking van prolifererende cel nucleair antigeen (PCNA) in antagomiR-behandelde tumoren dan in controle-behandelde tumoren (Figuur 2). Ook kan het herstel van de miRNA-targets worden bestudeerd door de analyse van door tumor geëxtraheerd RNA of eiwitten, zoals geïllustreerd door de hogere uitdrukking van PTEN in de antagomiR (anti-146b) behandelde tumoren (Figuur 2). Gezamenlijk blijkt uit deze gegevens dat de invivo remming van een miRNA effectief is en therapeutisch kan worden uitgebuit voor de behandeling van schildklierkanker.
Om het therapeutische potentieel van een miRNA-remmer beter te kunnen beoordelen en het muismodel te verbeteren, hebben we een orthothematisch model gegenereerd, waarin humane tumor schildklier Cal62-Luc-cellen direct in de juiste schildklier kwal van naakte muizen werden opgenomen. Na 3 weken werden de schildklier tumoren vastgesteld, zoals aangetoond door bioluminescentie signalen in de nek van de muizen en door de bruto weefsel analyse en immunohistochemie, met hematoxyline en eosine en GFP kleuring van cellen, respectiviely. Zoals weergegeven in Figuur 3, de epitheliale cellen rond de colloïde demonstreren de schildklier follikel architectuur van de muis. GFP-positieve cellen afgewisseld met de follikels, ondubbelzinnig aantonen dat menselijke Cal62 cellen zijn correct geïnjecteerd en prolifereren binnen de muis schildklier. Zodra de tumoren werden gevormd, we geïnjecteerd 13 muizen intraveneus met de miR-146b-remmer (n = 8) of een geschikte controle (n = 5), en tumor volume werd gevolgd voor nog eens twee weken (figuur 4a). We constateerden dat de tumorgroei significant daalde in de systemische antagomiR-behandelde groep (figuur 4b). Met name de uitdrukking van de nieuw beschreven miR-146b-target DICER1 in de primaire tumor werd verhoogd na de behandeling met anti-miR-146b (Figuur 5). Deze gegevens tonen aan dat de remming van de endogene Mirna expressie en daarom de restauratie van de doel genen kan worden gebruikt als een therapie in schildklierkanker16,17.
Figuur 1. De miR-146b-remmer belemmert de menselijke groei van de schildklier tumor. Cal62-Luciferase dat cellen (Cal62-Luc) uitdrukt, werd subcutaan geïnjecteerd. Nadat xenotransplantaten waren vastgesteld, werd een synthetische miR-remmer (anti-146b) (n = 8) of een negatieve controle (n = 4) intratumorally toegediend. (A) tijdlijn. (B) links: de afbeelding toont het eindpunt bioluminescente signaal van de behandelde tumoren afgebeeld met in vivo imaging software. Rechts: de grafiek toont de toename van de tumor straling op de aangegeven tijden in xenotransplantaten vanaf de aanvang van de behandeling met de Mirna-remmer (donkergrijs) of de negatieve controle (grijs). (C) representatie van de eindpunt glans verhoging van de behandelde tumoren. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. * p < 0,05; * * p < 0,01. Figuur aangepast van Ramírez-Moya et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. PCNA eiwit expressie afneemt en PTEN eiwit expressie toeneemt in miR-146b-remmer-behandelde tumoren. Eiwit uit de tumoren behandeld met controle of een miR-146b remmer werd verkregen voor westerse blotting met antilichamen tegen PCNA of PTEN. Figuur aangepast van Ramírez-Moya et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Intratumoral muis schildklier follikels in het orthotopic model. Kleuring met hematoxyline en eosine (bovenste paneel) en of een antilichaam tegen GFP (onderste paneel) van de orthotopic muizen tumoren 28 dagen na de inoculatie met Cal62-Luc GFP-positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. De miR-146b-remmer belemmert de menselijke groei van de schildklier tumor. Cal62-Luciferase uitdrukken cellen (Cal62-Luc) werden geïnjecteerd in de schildklier van de muizen. Na de tumoren werden vastgesteld (3 weken), een synthetische miRNA-remmer (anti-146b) (n = 8) of een negatieve controle (n = 5) systemisch werd toegediend. (A) tijdlijn. (B) links: de afbeelding toont het eindpunt bioluminescente signaal van de behandelde tumoren afgebeeld met in vivo imaging software. Rechts: de grafiek toont de toename van de tumor straling op de aangegeven tijdstippen vanaf de aanvang van de behandeling met de miRNA-remmer (blauw) of de negatieve controle (groen). (C) representatie van de eindpunt glans verhoging van de behandelde tumoren. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. * p < 0,05. Figuur aangepast van Ramírez-Moya et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. DICER1 eiwit expressie toeneemt in miR-146b-remmer-behandelde tumoren. Immunohistochemie met een DICER1-antilichaam in de orthotopic tumoren na behandeling met miR-146b-inhbitor of controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van de in vivo functie van een miRNA om beter te begrijpen zijn rol in tumor initiatie en progressie, en zijn potentieel als een therapeutisch doelwit in schildklierkanker. De tumor xenotransplantaatmodellen is modellen hier beschreven zijn gebaseerd op het gebruik van cellen die kunnen worden gevolgd door hun bioluminescentie signaal, waardoor de meting van tumorgroei in vivo onder invloed van een behandeling. Daarnaast beschrijven we het gebruik van een miRNA-gebaseerde behandeling voor schildklierkanker, die zich momenteel in de vroege stadia bevindt.
We testten eerst de haalbaarheid van een Mirna als een therapeutisch doelwit met behulp van een subcutaan xenotransplantaatmodellen is-model, waarbij schildklier tumorcellen werden geïnjecteerd in de flanken van immunodeficiënte muizen. Vervolgens hebben we de antagomiR intratumoraal geïnjecteerd. Dit model kan worden gebruikt voor verschillende soorten kanker om de significantie van specifieke miRNAs of oncomiRs in vivo in menselijke kankercellen te testen. Voordelen van deze techniek zijn dat het relatief eenvoudig is om te presteren en ook snel, met minimaal dierenleed. Een groot nadeel van de techniek is echter dat het de menselijke aandoening niet nauwkeurig nabootsen, omdat de cellen subcutaan worden geïnjecteerd en niet in het orgaan van oorsprong. Om deze beperking te overwinnen, gebruikten we een robuuster model door chirurgische orthotopic implantatie van bioluminescente schildklier tumorcellen in de schildklier van de muizen te voeren. Hoewel deze techniek is ingewikkelder en tijdrovend, het maakt het mogelijk de studie van de tumorgroei in haar "inheemse" omgeving, de schildklier. Een sterkte van deze methode is dat het toelaat de studie van tumor Cell verspreiding als metastase, meestal in de longen, die kan worden geëvalueerd met in vivo imaging software. Een andere kracht is dat de systemische afgifte van de antagomiR een potentiële menselijke behandeling nabootst en de analyse van de schildklier respons mogelijk maakt. Bovendien heeft de systemische injectie van de antagomiR geen nadelige effecten op de dieren veroorzaakt, aangezien parameters zoals serumglucose spiegels of lever morfologie niet werden gewijzigd17.
Er zijn een paar kritische stappen. In het orthotopic muismodel moet de injectie van de tumorele cellen nauwkeurig worden uitgevoerd in de schildklier en niet in het naburige weefsel. Daarom is het noodzakelijk om te demonstreren met immunohistochemie dat de schildklier architectuur wordt gehandhaafd en dat de geïnjecteerde cellen de schildklier hebben geïnfiltreerd en niet aanwezig zijn met de klier. Bovendien, voor zowel xenotransplantaatmodellen is en orthotopic modellen, de grootte van de tumoren in de verschillende groepen van dieren moet vergelijkbaar zijn aan het begin van de behandeling om te volgen een vergelijkbaar groeipatroon in alle gevallen. Ten slotte is het belangrijk om aan te tonen dat de uitdrukking van de doelstellingen stroomafwaarts van de microRNA (in ons geval miR-146b) wordt gewijzigd na behandeling met antagomiR
Als mogelijke toekomstige toepassing van dit model kunnen patiëntencellen worden geïnjecteerd in muismodellen om te analyseren hoe de remming van een miRNA de tumorgroei van een specifieke patiënt kan beïnvloeden, een nuttige aanpak voor precisie en gepersonaliseerde geneeskunde op basis van miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Raquel Arocha Riesco dankbaar voor haar hulp bij de behandeling en verzorging van muizen. Wij danken Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) en Dr. E. Mato (Institut de reserca de l'Hospital de La Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanje) voor het feest cadeaus van respectievelijk de cellen CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP en Cal62-Luc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R.
- Lin, S., Gregory, R. I.
- Hammond, S. M.
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , In press (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
