このプロトコルは、ヒト甲状腺腫瘍形成の異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを、マイクロRNAベースの阻害剤治療を試験するプラットフォームとして説明する。このアプローチは、非コードRNAの機能と新しい治療標的としての可能性を研究するのに理想的です。
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この記事について
サマリー
要約
マイクロRNA(miRNA)は、mRNAを不安定化させ、標的mRNAの翻訳を阻害する能力を通じて遺伝子発現の重要な調節剤です。増え続ける研究により、miRNAはがん診断や予後の潜在的なバイオマーカーとして、また治療目標として、がんの評価と治療に余分な次元を追加しました。甲状腺癌の文脈では、腫瘍形成は重要な遺伝子の突然変異からだけでなく、多くのmiRNAの過剰発現からも生じる。従って、甲状腺遺伝子発現制御におけるmiRNAの役割は、がんにおける重要なメカニズムとして進化しつつある。本明細書では、ヒト腫瘍異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを用いて甲状腺癌における治療モダリティとしてのmiRNA阻害剤送達の効果を調べるプロトコルを提示する。GFPとルシフェラーゼを発現する安定した甲状腺腫瘍細胞を工学した後、細胞をヌードマウスに注入して腫瘍を発症させ、その後に生物発光を行うことができる。miRNAのインインインイン阻害は、腫瘍増殖を減少させ、miRNA遺伝子標的をアップカビギュレートすることができる。この方法は、新しい治療標的を同定することに加えて、生体内で決定されたmiRNAの重要性を評価するために使用することができる。
概要
甲状腺癌は内分泌悪性腫瘍であり、一般的には良好な結果1を有する。それにもかかわらず、一部の患者は治療不可能な疾患の積極的な形態を開発し、分子塩基は十分に理解されていない2.
miRNAは、多くの組織で遺伝子発現を調節する22ヌクレオチド長い非コードRNAであり、典型的には標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(3'UTR)に結合することにより、mRNAの分解または翻訳抑圧を引き起こす。3,4.これらの分子が増殖シグナル伝達、移動、侵入および転移を調節し、アポトーシスに対する耐性を提供することができるので、マイクロRNA発現の調節が癌の特徴であることを示す証拠が増えている。5,6.近年、多くの研究では、がんの診断や予後の潜在的なバイオマーカーとしてmiRNAを同定し、治療目標7と同様に、がんの評価と治療に新たな次元を提供しています。
miRNAは、ヒト甲状腺新生物8、9、10、11、12の主要な
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プロトコル
動物実験は、欧州共同体法(86/609/EEC)およびスペイン法(R.D. 1201/2005)に準拠して行われ、コンセホ・スーペリア・デ・インスティガシオネス・シエンティフィカス(CSIC、スペイン)の倫理委員会の承認を得ました。
1. 細胞のフランク接種と腫瘍内アンタゴミア治療
- 細胞製剤
- Cal62ヒト甲状腺癌細胞株(KRASG12Rおよびp53A161D変異)を技術し、GFPおよびルシフェラーゼ(CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP)を構成的に発現するトランスジェニック構造を過剰発現させる。抗生物質耐性またはフローサイトメトリーでGFP陽性細胞をソートすることにより、トランスジェニック細胞を選択します。
- ペニシリン、ストレプトマイシンおよび10%の胎児ウシ血清(FBS)を37°Cおよび5%CO2で補充したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)で細胞を増殖させる。
- リン酸緩衝生理食生(PBS)の50μLで1 x 106細胞を4°Cで中断します。
- マウスの側面への細胞接種
- 同じ量の地下膜マトリックスで細胞を混合します。例えば、PBSの50 μLに1 x 10<....
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結果
我々は、2つの異なるマウスモデルを用して、miRNAの中和が腫瘍増殖を抑制できるかどうかを決定した。従って、ヒト腫瘍甲状腺Cal62-luc細胞を皮下にヌードマウスの側面に注入し、キセノグラフモデルを生成した。2週間後、腫瘍が確立され、キャリパーで測定することができた。その時点で、マウスをmiR-146b阻害剤または適切な対照で腫瘍内に注入し、さらに2週間腫瘍体積を続けた(図1A)。図1Bに示すように、miR-146b阻害剤(抗146b)(n=8)を注入した腫瘍の増殖は、陰性対照群(n=4)または生理食ずしも(図示せず)に対して有意に抑制された。miRNAは、複数の標的mRNAを調節する遺伝子調節の重要な特徴です。従って、腫瘍抑制遺伝子の重要な調節因子である。このプロトコルは、これらの遺伝子の腫瘍内発現レベルの分析を可能にし、これはmiRNA阻害剤による治療後に試験することができる。さらに、いくつかの増殖マーカーのレベルも研究することができ、対照処置腫瘍よりもアンタゴミア治療腫瘍における増殖細胞核抗原(PCNA)の低発.......
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ディスカッション
本論文では、腫瘍の開始と進行におけるその役割と甲状腺癌の治療標的としての可能性をよりよく理解するために、miRNAの生体内機能を研究する方法について述べた。ここで説明する腫瘍異種移植片モデルは、その生物発光シグナルによって追跡することができる細胞の使用に基づいており、治療の影響下で生体内の腫瘍増殖の測定を可能にする。また、現在初期段階にある甲状腺がんに対するmiRNAベースの治療法の使用について述べた。
まず、甲状腺腫瘍細胞を免疫不全マウスの側面に注入した皮下異種移植片モデルを用いた治療標的としてのmiRNAの実現可能性を試験した。その後、腫瘍内にアンタゴミアを注入した。このモデルは、ヒト癌細胞における生体内の特定のmiRNAまたはオンコミアーの有意性をテストするために、いくつかの癌タイプに使用することができる。この技術の利点は、最小限の動物の苦しみで、実行し、また迅速に比較的簡単であることです。しかし、この技術の大きな欠点は、細胞が皮下に注入され、起源の器官に注入されないため、人間の状態を密接に模倣しないことです。この限界を克服するために、我々は、マウスの甲状腺に生物発光甲状腺腫.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
私たちは、ラケル・アロチャ・リースコがマウスの治療とケアを支援してくれたことに感謝しています。私たちは、J.ブランコ博士(カタロニアのアドバンスケミストリーCSIC研究所)とE.マト博士(インスティトゥート・デ・レセルカ・デ・ラ・サンタ・クルー・イ・サンパウ)バルセロナ(スペイン)に、それぞれCMV-Firefly luc-IRES-EGFPとCal62-Luc細胞を贈りてくださったことに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo 送達試薬: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivoイメージングソフトウェア:IVIS-Lumina II イメージングシステム | キャリパーライフサイエンス | ||
| ネガティブコントロール:mirVana miRNA Inhibitor, ネガティブコントロール #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB:1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB:1/1,000 |
| XenoLight D-ルシフェリン - K+ 塩生物発光基質 | PerkinElmer | 122799 | PBS で希釈 |
参考文献
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al.
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再版と許可
