Summary
このプロトコルは、ヒト甲状腺腫瘍形成の異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを、マイクロRNAベースの阻害剤治療を試験するプラットフォームとして説明する。このアプローチは、非コードRNAの機能と新しい治療標的としての可能性を研究するのに理想的です。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、mRNAを不安定化させ、標的mRNAの翻訳を阻害する能力を通じて遺伝子発現の重要な調節剤です。増え続ける研究により、miRNAはがん診断や予後の潜在的なバイオマーカーとして、また治療目標として、がんの評価と治療に余分な次元を追加しました。甲状腺癌の文脈では、腫瘍形成は重要な遺伝子の突然変異からだけでなく、多くのmiRNAの過剰発現からも生じる。従って、甲状腺遺伝子発現制御におけるmiRNAの役割は、がんにおける重要なメカニズムとして進化しつつある。本明細書では、ヒト腫瘍異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを用いて甲状腺癌における治療モダリティとしてのmiRNA阻害剤送達の効果を調べるプロトコルを提示する。GFPとルシフェラーゼを発現する安定した甲状腺腫瘍細胞を工学した後、細胞をヌードマウスに注入して腫瘍を発症させ、その後に生物発光を行うことができる。miRNAのインインインイン阻害は、腫瘍増殖を減少させ、miRNA遺伝子標的をアップカビギュレートすることができる。この方法は、新しい治療標的を同定することに加えて、生体内で決定されたmiRNAの重要性を評価するために使用することができる。
Introduction
甲状腺癌は内分泌悪性腫瘍であり、一般的には良好な結果1を有する。それにもかかわらず、一部の患者は治療不可能な疾患の積極的な形態を開発し、分子塩基は十分に理解されていない2.
miRNAは、多くの組織で遺伝子発現を調節する22ヌクレオチド長い非コードRNAであり、典型的には標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(3'UTR)に結合することにより、mRNAの分解または翻訳抑圧を引き起こす。3,4.これらの分子が増殖シグナル伝達、移動、侵入および転移を調節し、アポトーシスに対する耐性を提供することができるので、マイクロRNA発現の調節が癌の特徴であることを示す証拠が増えている。5,6.近年、多くの研究では、がんの診断や予後の潜在的なバイオマーカーとしてmiRNAを同定し、治療目標7と同様に、がんの評価と治療に新たな次元を提供しています。
miRNAは、ヒト甲状腺新生物8、9、10、11、12の主要な推進要因としてヒト分子腫瘍学の中心的な段階をとってきた。miRNAアップ規制の中で、miR-146bは乳頭甲状腺癌(PTC)腫瘍において非常に過剰発現され、細胞増殖を有意に増加させ、攻撃性および陰気な予後6と関連することが示された。12歳,13歳,14歳,15.さらに、miR-146bは、分化12に関与するいくつかの甲状腺遺伝子、ならびにPTEN16およびDICER117などの重要な腫瘍抑制遺伝子を調節する。がん生物学における重要性にもかかわらず、miRNAベースの癌治療はまだ初期段階にあり、甲状腺癌に対処した研究はほとんどありません - 内分泌腫瘍の中で最も頻繁に18。ここでは、ヒト由来腫瘍を有する2つの異なるマウスモデルを用いたプロトコルについて説明し、細胞miRNAを特異的に阻害する合成miRNA阻害剤(antagomiR)の投与が腫瘍増殖をブロックできる。我々は最初に共通の異種移植片モデルを用いて、そして、腫瘍生物発光の減少として測定された腫瘍増殖を減少させたアンタゴミRの局所的な腫瘍内投与16。ヒト腫瘍の進行を模倣する堅牢なマウスモデルの確立は、独自の治療アプローチを開発するために不可欠であるため、原発性ヒト腫瘍の局所移植は、新薬の臨床検証のためのより貴重なプラットフォームである。皮下注入モデル。したがって、antagomiRの治療可能性をより良く評価するために、血流中の全身送達を伴うオルトトピックマウスモデルを用いて、同じ結果を得た。
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Protocol
動物実験は、欧州共同体法(86/609/EEC)およびスペイン法(R.D. 1201/2005)に準拠して行われ、コンセホ・スーペリア・デ・インスティガシオネス・シエンティフィカス(CSIC、スペイン)の倫理委員会の承認を得ました。
1. 細胞のフランク接種と腫瘍内アンタゴミア治療
- 細胞製剤
- Cal62ヒト甲状腺癌細胞株(KRASG12Rおよびp53A161D変異)を技術し、GFPおよびルシフェラーゼ(CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP)を構成的に発現するトランスジェニック構造を過剰発現させる。抗生物質耐性またはフローサイトメトリーでGFP陽性細胞をソートすることにより、トランスジェニック細胞を選択します。
- ペニシリン、ストレプトマイシンおよび10%の胎児ウシ血清(FBS)を37°Cおよび5%CO2で補充したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)で細胞を増殖させる。
- リン酸緩衝生理食生(PBS)の50μLで1 x 106細胞を4°Cで中断します。
- マウスの側面への細胞接種
- 同じ量の地下膜マトリックスで細胞を混合します。例えば、PBSの50 μLに1 x 106細胞を50μLの地下膜マトリックス(材料の表を参照)に加え、穏やかに混合します。
メモ： - 27G 1/2'''(0.4x13 mm)針を用いた1mLインスリン注射器を用いて、サンプルの100μL(PBS+基体膜マトリックス中の細胞)を6週齢の免疫不欠性BALB/c nu/nuマウスの左脇腹に皮下に注入する。
- 同じ量の地下膜マトリックスで細胞を混合します。例えば、PBSの50 μLに1 x 106細胞を50μLの地下膜マトリックス(材料の表を参照)に加え、穏やかに混合します。
- 腫瘍内アンタゴミア治療。
- RNaseフリー蒸留水の500 μLでアンタゴミア(材料表を参照)または負の制御を中断します。
- 注射の前に、各注射のためのインビボ送達試薬と一緒にアンタゴミアまたはコントロールの2 nmolを調調します(材料の表を参照)。
- まず、antagomiR溶液(材料の表を参照)と複合バッファー(材料の表を参照)を1:1の比率で混合します。例えば、80 μLのmiRNA阻害剤溶液(16nmol)を80μLの複合バッファーに加えます(生体内送付試薬キットに含まれる、材料の表を参照)。
- インビボ送達試薬を室温に持ち込む。1.5 mLチューブに160 μLを加え、希釈したアンタゴミア溶液を直ちに160μL加えます。残りの試薬を-20 °Cに戻します。必要に応じて、試薬を解凍後1週間まで4°Cに保管してください。
- 渦は直ちに(10s)インビボ送達試薬-アンタゴミアの複雑化を確実にする。
- インビボ送達試薬-アンタゴミア混合物を50°Cで30分間インキュベートする。サンプルを回収するためにチューブを短時間遠心分離します。
- PBS pH 7.4の1360 μLを加えて複雑な6倍を希釈し、よく混ぜます。
- 試薬-antagomiR複合体(8マウス/条件)の生体内送達を進めるか、または注射の1週間前まで4°Cで複合体を保存する。各腫瘍に200 μLの腫瘍内注入(アンタゴミアの2nmol)を注入する。
注:アンタゴミアの体積および量は腫瘍容積から独立している。
- 毎週3回(月曜日、水曜日、金曜日)2週間治療を行う。
- 腫瘍増殖の分析
- D-ルシフェリン基板の40mg/mL溶液の50 μLを、27G 1/2''(0.4 mm x 13 mm)の針で1mLの注射器で各時間点で皮下に注入します。
- 8分の注射後、酸素と混合した3%のイソファルランを用いてマウスを麻酔する。ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)によって麻酔のレベルを評価し、外科面を維持するために適宜麻酔送達を調節する。
- 乾燥を防ぐために、両眼に眼科の塞ぎを適用します。
- 生体内イメージングソフトウェアで生物発光信号を画像化する(材料の表を参照)。
注:キャリパーは、腫瘍体積および腫瘍増殖を測定するためにも使用することができる。 - 生物発光シグナルが得られたら、両方の治療を比較する腫瘍増殖を分析し、t検定を用いて有意性を決定する。グループ内分散を分析するには、SEM を使用します。
- D-ルシフェリン基板の40mg/mL溶液の50 μLを、27G 1/2''(0.4 mm x 13 mm)の針で1mLの注射器で各時間点で皮下に注入します。
- 腫瘍切除
- アンタゴミア治療の終了後7日後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、タンパク質および/またはRNAを抽出して将来の分析を行う。あるいは、腫瘍を切り取り、免疫組織化学のためにそれらを修正する。
2. 細胞の甲状腺オルソトピック接種と全身性アンタゴミア治療
- 細胞製剤
- Cal62ヒト甲状腺癌細胞株を技術し、GFPとルシフェラーゼを構成的に発現するトランスジェニック構造を過剰発現させる。抗生物質耐性またはフローサイトメトリーでGFP陽性細胞をソートすることにより、トランスジェニック細胞を選択します。
- 抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)および10%FBSを37°Cおよび5%CO2で補充したDMEMでこれらの細胞を増殖させる。
- PBSの5 μLで1 x 105セルを中断します。
- マウスの甲状腺への細胞接種
- 鎮痛薬(ブプレノルフィン)の100 μLと100 μLの抗生物質(セファロスポリン)を皮下に7週齢のBALB/c nu/nuマウスに注入する。アルコールで注射部位を消毒する。
- マウスの甲状腺に細胞溶液の5 μLを注入する。
- 酸素と混合した3%のイソフルランを使用してマウスを麻酔し、無菌フローキャビネットに立体顕微鏡の下に置きます。 ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)によって麻酔のレベルを評価し、外科面を維持するために適宜麻酔送達を調節する。
- 乾燥を防ぐために、両眼に眼科の塞ぎを適用します。
- 各マウスのために、ヨードポビドンで首を消毒し、はさみで皮膚に約2cmの切開を行います。開いたら、唾液腺を置き換えることによって首を露出させる。
- 切除鉗子やはさみを使用してストラップの筋肉を解剖し、気管と甲状腺を露出させます。10 μLマイクロリットルの注射器を使用して、クリコイド軟骨の側面に位置する右甲状腺小葉に細胞溶液の5 μLを注入する。
- 唾液腺を再配置し、編組、コーティングされた、非吸収性の縫合糸を使用してシルクで切開部を縫合します。
- 創傷部にヨードポビドンを加え、麻酔から回復する間、マウスをサーミック毛布の上に置きます。
- 手術後の翌日、皮下鎮痛剤(ブプレノルフィン)を注入し、3mLの液体イブプロフェン(40mg/mL)を250mLの飲料水に1週間添加する。
- 全身性アンタゴミア治療
注:生物発光シグナルが検出可能な場合は、細胞注入後2~3週間後にこのステップを実行します。- 蒸留されたRNaseフリー水でアンタゴミアまたは負の制御を中断します。
- 注射の前に、各注射のためのインインインイン送達試薬と共にアンタゴミアまたはコントロールの7 nmolを調剤する。
- アンタゴミアおよびインインインインインインイン送達試薬溶液製剤については、ステップ1.3を参照してくださいが、マウス当たりmiRNA阻害剤の7nmolを添加する。
- マウスの静脈静脈静脈静脈静脈注射による溶液を静脈内投与する。麻酔を誘発するためにイソファランを使用する。
注:ペダル反射(しっかりしたつま先のピンチ)によって麻酔のレベルを評価します。 - マウスを週3回(月曜日、水曜日、金曜日)2週間治療する。
- 腫瘍増殖の分析
- 腫瘍の成長を計算するために、腫瘍生物発光シグナルを週2回決定する。
- 皮下注射を介して各時点でD-ルシフェリン基板の40mg/mL溶液の50 μLを注入する。
- 8分の注射後に、酸素と混合した3%のイソファランを用いてマウスを麻酔し、生体内イメージングソフトウェアで生物発光信号を画像化する。
- 生物発光シグナルが得られたら、両方の治療を比較する腫瘍増殖を分析し、t検定を用いて有意性を決定する。グループ内分散を分析するには、SEM を使用します。
- 腫瘍の成長を計算するために、腫瘍生物発光シグナルを週2回決定する。
- 腫瘍切除
- アンタゴミア治療期間の終了後7日後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、タンパク質および/またはRNAを抽出して将来の分析を行う。あるいは、腫瘍を切り取り、免疫組織化学のためにそれらを修正する。
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Representative Results
我々は、2つの異なるマウスモデルを用して、miRNAの中和が腫瘍増殖を抑制できるかどうかを決定した。従って、ヒト腫瘍甲状腺Cal62-luc細胞を皮下にヌードマウスの側面に注入し、キセノグラフモデルを生成した。2週間後、腫瘍が確立され、キャリパーで測定することができた。その時点で、マウスをmiR-146b阻害剤または適切な対照で腫瘍内に注入し、さらに2週間腫瘍体積を続けた(図1A)。図1Bに示すように、miR-146b阻害剤(抗146b)(n=8)を注入した腫瘍の増殖は、陰性対照群(n=4)または生理食ずしも(図示せず)に対して有意に抑制された。miRNAは、複数の標的mRNAを調節する遺伝子調節の重要な特徴です。従って、腫瘍抑制遺伝子の重要な調節因子である。このプロトコルは、これらの遺伝子の腫瘍内発現レベルの分析を可能にし、これはmiRNA阻害剤による治療後に試験することができる。さらに、いくつかの増殖マーカーのレベルも研究することができ、対照処置腫瘍よりもアンタゴミア治療腫瘍における増殖細胞核抗原(PCNA)の低発現によって示される(図2)。また、miRNA標的の回収は、腫瘍抽出されたRNAまたはタンパク質の分析を通じて、アンタゴミア(抗146b)治療腫瘍におけるPTENのより高い発現によって示されるように調べることができる(図2)。これらのデータは、miRNAの生体内阻害が有効であり、甲状腺癌治療のために治療的に利用されうる可能性があることをまとめて明らかにしている。
miRNA阻害剤の治療可能性をより良く評価し、マウスモデルを改善するために、ヒト腫瘍甲状腺Cal62-luc細胞をヌードマウスの右甲状腺ローブに直接播種した正所情報モデルを生成した。3週間後、甲状腺腫瘍が確立され、マウスの頸部の生物発光シグナルおよび総組織分析および免疫組織化学によって、ヘマトキシリンおよびエオシンおよびGFP染色による細胞の染色によって、尊重して確立された。図3に示すように、コロイドを取り囲む上皮細胞は、マウスから甲状腺卵胞構造を示す。GFP陽性細胞は卵胞に散在し、ヒトCal62細胞が正しく注入され、マウス甲状腺内で増殖していることを明確に示している。腫瘍が形成されると、miR-146b阻害剤(n=8)または適切な対照(n=5)で13匹のマウスを静脈内に注射し、さらに2週間腫瘍体積を続けた(図4A)。全身アンタゴミア処置群において腫瘍増殖が有意に減少したことがわかった(図4B)。特に、原発腫瘍における新たに記載されたmiR-146b標的DICER1の発現は、抗miR-146b治療後に増加した(図5)。これらのデータは、内因性miRNA発現の阻害およびしたがって、その標的遺伝子の回復が甲状腺癌16,17の治療として使用できることを示している。
図 1.miR-146b阻害剤は、確立されたヒト甲状腺腫瘍の増殖を損なう。Cal62-ルシフェラーゼ発現細胞(Cal62-luc)を皮下注射した。異種移植片が確立された後、合成miR阻害剤(抗146b)(n=8)または陰性対照(n=4)を腫瘍内に投与した。(A) タイムライン。(B) 左:画像は、生体内イメージングソフトウェアで画像化された処理された腫瘍のエンドポイント生物発光シグナルを示す。右:グラフは、miRNA阻害剤(濃い灰色)または陰性対照(灰色)による治療発症からの異種移植片の示された時間における腫瘍輝度の増加を示す。(C) 処置された腫瘍のエンドポイント輝度増加の表現。値は平均 ± SEM. *p < 0.05;**p <0.01.図はラミレス・モヤら16.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.PCNAタンパク質発現は減少し、PTENタンパク質発現はmiR-146b阻害剤処理腫瘍において増加する。コントロールまたはmiR-146b阻害剤で処理された腫瘍からのタンパク質は、PCNAまたはPTENに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングのために得られた。図はラミレス・モヤら16.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.腫瘍内マウス甲状腺卵胞の正頭蓋内モデルにおける。ヘマトキシリンおよびエオシン(上パネル)および、またはCal62-luc GFP陽性細胞を接種した28日後に腫瘍の正頭細胞のGFP(下パネル)に対する抗体を染色する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.miR-146b阻害剤は、確立されたヒト甲状腺腫瘍の増殖を損なう。Cal62-ルシフェラーゼ発現細胞(Cal62-luc)をマウスの甲状腺に注射した。腫瘍が確立された後(3週間)、合成miRNA阻害剤(抗146b)(n=8)または陰性対照(n=5)を全身的に投与した。(A) タイムライン。(B) 左:画像は、生体内イメージングソフトウェアで画像化された処理された腫瘍のエンドポイント生物発光シグナルを示す。右:グラフは、miRNA阻害剤(青)または陰性対照(緑色)による治療発症からの指示時間における腫瘍輝度増加を示す。(C) 処置された腫瘍のエンドポイント輝度増加の表現。値は平均 ± SEM. *p < 0.05 を表します。図はラミレス・モヤら17.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.DICER1タンパク質発現はmiR-146b阻害剤治療腫瘍において増加する。miR-146b-inhbitorまたはコントロールによる治療後のオルトトピック腫瘍におけるDICER1抗体を用いた免疫組織化学。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、腫瘍の開始と進行におけるその役割と甲状腺癌の治療標的としての可能性をよりよく理解するために、miRNAの生体内機能を研究する方法について述べた。ここで説明する腫瘍異種移植片モデルは、その生物発光シグナルによって追跡することができる細胞の使用に基づいており、治療の影響下で生体内の腫瘍増殖の測定を可能にする。また、現在初期段階にある甲状腺がんに対するmiRNAベースの治療法の使用について述べた。
まず、甲状腺腫瘍細胞を免疫不全マウスの側面に注入した皮下異種移植片モデルを用いた治療標的としてのmiRNAの実現可能性を試験した。その後、腫瘍内にアンタゴミアを注入した。このモデルは、ヒト癌細胞における生体内の特定のmiRNAまたはオンコミアーの有意性をテストするために、いくつかの癌タイプに使用することができる。この技術の利点は、最小限の動物の苦しみで、実行し、また迅速に比較的簡単であることです。しかし、この技術の大きな欠点は、細胞が皮下に注入され、起源の器官に注入されないため、人間の状態を密接に模倣しないことです。この限界を克服するために、我々は、マウスの甲状腺に生物発光甲状腺腫瘍細胞の外科的なオルトトピック移植を行うことによって、より堅牢なモデルを使用した。この技術は、より複雑で時間がかかりますが、それは、その「ネイティブ」環境、甲状腺における腫瘍の成長の研究を可能にします。この方法の強みは、生体内イメージングソフトウェアで評価することができる転移として腫瘍細胞の播種の研究を可能にすることです。もう一つの強みは、アンタゴミアの全身分娩が潜在的なヒト治療を模倣し、甲状腺応答の分析を可能にすることです。さらに、アンタゴミアの全身注射は動物に悪影響を及ぼさなかったが、血清グルコースレベルまたは肝臓形態などのパラメータは17に変更されなかった。
いくつかの重要な手順があります。正所性マウスモデルでは、腫瘍細胞の注射は、隣接する組織ではなく甲状腺で正確に行われるべきである。したがって、甲状腺のアーキテクチャが維持され、注入された細胞が甲状腺に浸潤し、腺に存在しないことを免疫組織化学で実証する必要があります。さらに、異種移植片および直述性モデルの両方について、動物の異なる群における腫瘍の大きさは、すべての場合において同様の成長パターンに従うために治療の開始時に類似する必要があります。最後に、抗加剤治療後にマイクロRNAの下流の標的の発現(我々の場合miR-146b)が変化することを実証することが重要である。
このモデルの将来の応用として、患者細胞をマウスモデルに注入して、miRNAの阻害が特定の患者の腫瘍増殖にどのように影響するかを分析するために、精密およびパーソナライズされた医療に対する有用なアプローチに基づくミルナ。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
私たちは、ラケル・アロチャ・リースコがマウスの治療とケアを支援してくれたことに感謝しています。私たちは、J.ブランコ博士(カタロニアのアドバンスケミストリーCSIC研究所)とE.マト博士(インスティトゥート・デ・レセルカ・デ・ラ・サンタ・クルー・イ・サンパウ)バルセロナ(スペイン)に、それぞれCMV-Firefly luc-IRES-EGFPとCal62-Luc細胞を贈りてくださったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
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