Summary
הפריה חוץ גופית היא טכניקה בשימוש נפוץ עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל לשמור על אוכלוסיות מעבדה לייצר עוברים מסונכרנים עבור יישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם טכניקה זו עבור אוכלוסיות שונות של הדגים טטרה מקסיקני, Astyanaxמקסיקני.
Abstract
הטבעת התחתית Astyanax מתגלה כאורגניזם מודל למגוון שדות מחקר במדעי הביולוגיה. חלק מן ההצלחה האחרונה של מינים זה של דגים teleost היא שהיא בעלת מערת הפרעות ואוכלוסיות מגורים הנהר. זה מאפשר את המיפוי הגנטי של תכונות תורשתיות שתוקנו במהלך הסתגלות לסביבות שונות של אוכלוסיות אלה. בעוד המין הזה יכול להיות מתוחזק ומתרבה במעבדה, הוא מאתגר הן להשיג עוברים במהלך היום וליצור עוברים היברידית בין זנים. הפריה חוץ גופית (IVF) נעשה שימוש עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל שונים בהצלחה ומתרבים בעלי חיים במעבדה. בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד, על ידי הערכת מחזורי הטבעת למחזורי אור שונים יחד עם שינויים בטמפרטורת המים, אנו יכולים להעביר מחזורי רבייה לתקופה שנבחרה ביום. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לזהות דגים הורים מתאימים, לאסוף גמטות בריאים מן הזכרים והנקבות, ולייצר צאצאים קיימא באמצעות IVF. הדבר מאפשר הליכים קשורים כגון הזרקה של מבנים גנטיים או ניתוח התפתחותי שיתרחשו בשעות העבודה הרגילות. יתר על כן, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור כלאיים בין אוכלוסיות מערה משטח הקרקע, ובכך לאפשר את המחקר של הבסיס הגנטי של עיבודים פנוטימית לסביבות שונות.
Introduction
בשנים האחרונות הפכה Astyanax מקסיפי-הטבעת לאורגניזם מודל בתחומים שונים כגון ביולוגיה התפתחותית, ביולוגיה אבולוציונית, ביולוגיה התנהגותית ופיזיולוגיה1,2,3,4 . ייחודו של מערכת זו נובע ממין זה שיש לו מספר מורורפולסוגים שמותאמים לסביבות שונות מאוד. מגורים הקרקע מורפולאות חיים בנהרות שם יש מגוון ביולוגי גבוה והרבה מקורות מזון עבור הדג. לעומת זאת, המערה מורערת מהמינים של מקסיפי-הטבעת, החיים במערות שבהן המגוון הביולוגי, מקורות המזון והחמצן מופחת באופן דרסטי1. מכפיש שונים מדגי השטח במגוון פנוטיפים כגון העדר עיניים ופיגמנטציה, עמידות לאינסולין ויכולת לאגור שומן2,3,4. עם זאת, דגי שטח ומכפיש עדיין שייכים לאותו מינים והם, ולכן, הפרעות.
עבור שני המורפולונים, מערכת תנאים הוגדרה כדי לאפשר תחזוקה שוטפת ורביה בתנאי מעבדה5,6. עם זאת, שינויים גנטיים, מחקרים התפתחותיים עובריים נכונה, ויצירת כלאיים הם עדיין מאתגרת מכמה סיבות. A. מקסיפי בעיקר שרצים בשעות הלילה וזה לא נוח לניסויים הבאים על שלבים עובריים מוקדם כגון הזרקה של מבנים גנטיים או ניטור של תהליכים התפתחותיים מוקדם עובריים. בנוסף, הדור של משטח ההיברידים המערה הוא מאתגר באמצעות השפעה טבעית, מאז מערת מורפולסוגים יש קצב מעגלי שונה7 כי בסופו של דבר משפיע על הייצור של בעלות קיימא. מוצלח, עדיין פולשנית, הליכים IVF תוארו עבור מינים astyanax אחרים, שם הייצור תא רבייה והתנהגות הבהורית היה מוכן באמצעות זריקות הורמונליים8,9. פחות פולשנית הליכי IVF (כלומר, השגת גמטות מתוך השאיפה ידנית ללא הזרקה של ההכנות ההורמונלית) תוארו אך לא לשקול את ההבדלים במחזור ההשמה בין מערה ומשטח המורפולטים של מקסיאנוס . שישה מטרים
דגים אחרים מודל אורגניזמים, כמו דג zebrafish, יכול בקלות להיות מהונדסים גנטית ולמד ברמה עובריים כי המכשולים הצהיר לעיל כבר נפתרה בהצלחה. יישום של טכניקות רבייה סטנדרטיות, הפריה חוץ גופית, והקפאת הזרע כל דחפו את הדגים קדימה והתחזק את השימוש של המודל במדעי הביולוגיה10. לכן, הארכת טכניקות אלה ל -מקסיפי-טבעת תחזק אותה עוד יותר כמערכת מודל.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור IVF שיסייע להפוך את מקסינוס נגיש יותר. אנו נציג הגדרת הרבייה המאפשרת העברת מחזורי אור של הדג משעות היום ללילה, כך שניתן להשיג באותה תקופה בשעות היום ללא הזרקה של ההכנות ההורמונלית. לאחר מכן אנו מספקים תיאור מפורט של כיצד להשיג את הטוב ומילט המשמש IVF. שיטה זו תאפשר את ייצור העוברים במהלך שעות העבודה הרגיל ולהפוך יישומים במורד הזרם יותר ריאלי לעומת שימוש בעוברים מתוך הליכה טבעית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מכון סטורס למחקר רפואי.
1. מניפולציה במחזור האור
- הגדר מיכלי דגים בתוך אטום, הגנה מלאה (הקלה), זרימה דרך מערכת החקלאות המכילה שורות מרובות של טנקים (איור 1).
הערה: מערכת הזרימה כפי שמוצג באיור 1 משתמשת במים מערכת כדי לרוקן את הפסולת דרך צינור המעמד האחורי של כל טנק זורם לתוך sump הריקון לתוך ניקוז הסניטריים. בניסוי זה, שימש שיעור החלפת מים של גלון אחד (ארה ב) לשעה באמצעות פולט טפטוף. - שמרו על הטמפרטורה של כל טנק עם אלמנט חימום עצמאי המשמש לשינוי ידני של הטמפרטורה במהלך תהליך הטרמה.
- הגדר שורות בודדות בדרך להפעלת photoperiods נפרדים בכל אחד מהם. התקן דלתות בכל שורה שניתן לסגור כדי למנוע מהאור להיכנס או לברוח.
הערה: הבקר האוטומטי יכול לאפשר מניפולציה של כל photoperiods עם ההפרעה הקטנה ביותר לדג. - לצייד את ארון התקשורת עם אור העבודה אדום וילונות האפלה עבור גישה במהלך שעות חשוכות.
2. התאמת photoperiod ולקרקע דגים עבור אוסף תא רבייה
- הסר את הדג הרצוי (איור 2 א) מארונות מערכות כלליים ומקום בארונות תקשורת כדי לאפשר התאמה של photoperiod 14 ימים לפני הטרמה.
הערה: זה מאפשר לדגים להאקזה לסביבה חדשה. - שמור את הדג ב 22.8 ° צ' (73 ° פ') במהלך תקופה זו באמצעות מערכת חימום מים מותקן. הphotoperiod הרגילה היא מהשעה 6:00 עד 8:00 בבוקר, ושמונה בערב עד 6:00 בלילה. עבור מתלה מחזור האור, הזמן את photoperiod ל-10 בערב עד 12:00 בצהריים ובשעה 12:00 עד 22:00 כהה על-ידי התאמת שעון העצר הכוחות את האור בתוך המדף.
הערה: גברים ונקבות נמצאים באותו טנק כדי לאפשר התנהגויות הקרקע טבעי להתרחש. בעוד שהשומה עשויה להתרחש במיכל, ניתן עדיין להשתמש בדגים בהפריה חוץ-גופית מאז שחרור המשחק בשלבים11. - ברגע שהדג מאותחל, התחל לקרקע את בעלי החיים להש2.3.15 כמתואר בצעדים ה ל2.3.5.
הערה: הליך זה לוקח שישה ימים בסך הכל. במהלך הזמן הזה, לשנות את הטמפרטורה לראש הייצור הטוב באמצעות מערכת חימום מים מותקן. באמצעות מחממי מים 50W (ראה טבלת חומרים), להגדיר את החימום ישירות לטמפרטורה (קנה המידה על החימום הוא בפרנהייט) נתון בפרוטוקול בכל שלב. בהתאם לגודל המיכל וקצב הזרימה של המים, הזמן של כוונון הטמפרטורה עשוי להיות שונה. בניסוי זה, הטמפ ' הותאמה בצהרי היום וטמפרטורת הטמפרטורה השתלטו על 18 השעות הבאות.- ביום 1, העלו את הטמפרטורה מ-22.8 ° צ' (73 ° פ') עד 24.4 ° צ' (76 ° פ').
- ביום השני, הרימו את הטמפרטורה מ-24.4 ° צ' (76 ° פ') עד 26.1 ° צ' (79 ° פ').
- ביום 3 ו-4, שמרו על הטמפרטורה ב-26.1 ° צ' (79 ° פ'). דגים יהיה מוכן להשריץ במהלך היום ו IVF ניתן לבצע.
הערה: בהתאם לדגים הבודדים, הנקבות יכולות להשריץ ביום 3 ו/או יום 4. אנו ממליצים לנסות להשיג באופן מרובה ביום 3 ו/או יום 4 בהתאם להצלחת הקולקציה. - ביום 5, הנמך את הטמפרטורה מ-26.1 ° צ' (79 ° פ') עד 24.4 ° צ' (76 ° פ').
- ביום 6, הנמך את הטמפרטורה מ-24.4 ° צ' (76 ° פ') עד 22.8 ° צ' (73 ° פ').
הערה: ספק פער של 7 ימים לפני חזרה על מחזור טמפרטורה זה. מומלץ להמשיך לשמור את הדג photoperiod כי זה יפחית את הזמן הכולל הדרוש על ידי הדג כדי להתאים את זה מחזור אור העביר.
3. אוסף מגיים לנשים
- התחילו בהכנסת מגבונים לחים בתוך מכסה צלחת פטרי וסוגרים את המנה כדי ליצור תא מחולל לחות ומונעים מהייבוש להתייבש במהלך תהליך האיסוף.
- הבא בחר נקבה עבור אוסף. Gravid דגים עם גדול, בטנם בולטות סביר להניח להיות הבחירה הטובה ביותר עבור הליך זה (איור 2a).
הערה: כדי להבדיל בין זכרים לנקבות של מבוגרים A. מקסיפי-טבעת, שימש שיטת כדור הכותנה12. - לשתק אישה באמצעות מים מצוננים ולמקם אותה בתנוחת הגמישות במחזיק בעלי חיים ספוגים. עשה זאת על ידי הצבת הדג ב 4 מי מערכת הצלזיוס עבור לפחות 30 s או עד הדג הוא מנוע (כלומר, אובדן של תנועת הגיל, לראות רוס ורוס13 לפרטים).
הערה: עבוד במהירות ונסה להימנע מהתחממות הדג עד שההליך יושלם. זה עשוי לכלול מעת לעת לטבול את קצות האצבעות לתוך מים קרים או להציע הרדמה משלימה. שיטות הרדמה אחרות (למשל, MS-22213) ניתן להשתמש גם כן. תחת ההנחיות IACUC של המכון הסטורים למחקר רפואי, אוסף ידני של הנובה נחשב הליך לא פולשני, אשר אינו דורש הרדמה מלאה (למשל, באמצעות MS-222). - ברגע שהוא ממוקם, למחוק את הצד הגחוני של הדג עם ניגוב רקמות עדין כמו מגע עם המים יגרום הטובה להפעיל.
- החזיקו את הנקבה בין האגודל לאצבע המורה. בעדינות לסחוט את הצדדים לרוחב של חלל קולומאית לכיוון הפתיחה אורואיברי תוך הגלגול האצבעות מעט. לאסוף את המתבטאת באמצעות מרית חד פעמית.
- העבירו את הרובה לצלחת פטרי.
הערה: מספר מצמדים של הנובה עשויים להיות משולבים באותה מנה אם אין צורך בנתוני הורות ספציפיים. הטובה ביותר ניתן לאחסן ב 24 ° צ' והם הטובים ביותר כאשר משתמשים עבור IVF בתוך 30-60 דקות לאחר האיסוף. - לאחר איסוף, בעדינות להחזיר את הדג למיכל התאוששות מלא במים מערכת.
הערה: מניחים את הדג בחזרה לתוך מיכל הקבינט הכהה לאיסוף בעתיד בזמן הצורך.
4. אוסף מגיים לגברים
- בחר זכר לגבייה.
הערה: אין סימנים גלויים לעין של איכות המשחק הגברי. עם זאת, דגים צריכים להיראות בריאים במראה לפני השימוש בהליך זה. כדי להבדיל בין זכרים לנקבות של מבוגר A. מקסיפי, שיטת כדור הכותנה שימש12. - לשתק גבר באמצעות מים מצוננים ולמקם אותו בתנוחת הגמישות במחזיק בעלי חיים ספוגים. באמצעות הצבת הדג ב -4 מעלות צלזיוס לפחות 30 שניות או עד שהדג מנוע (כלומר, אובדן תנועת הזימים, ראה רוס ורוס13 לפרטים).
הערה: עבוד במהירות ונסה להימנע מהתחממות הדג עד שההליך יושלם. זה עשוי לכלול מעת לעת לטבול את קצות האצבעות לתוך מים קרים או להציע הרדמה משלימה. שיטות הרדמה אחרות (למשל, MS-22213) ניתן להשתמש גם כאן. תחת ההנחיות IACUC של המכון הסטורים למחקר רפואי, אוסף ידני של זרע נחשב הליך לא פולשני, אשר אינו דורש הרדמה מלאה (למשל, באמצעות MS-222). - למחוק את הצד הגחוני של הדג עם ניגוב רקמות עדין כמו מגע עם מים יפעיל את מילט.
- מניחים בעדינות את סופה של צינורית קפילר בפתח האורואיברי.
- לסלק את מילט על ידי הפעלת לחץ עדין על צידי הדג עם האגודל והאצבע. . נעים לכיוון הפתח האורואיברי
- לאסוף את מילט בסוף צינורית קפילר. שאיבה עדינה עשויה להיות הכרחית על ידי שימוש בצינור האספירין. להימנע צואה כי יכול להיות מגורש עם מילט.
- לחלק את מילט לתוך שפופרת הצנטריפוגה ריק 1.5 mL ולדלל עם כפול נפח של מאריך הזרע E400 (ראה טבלת חומרים). . המשיכו לאכול
הערה: מילט ממספר זכרים עשוי להיות ממאגר יחד אם אין צורך בנתוני הורות ספציפיים. שלב זה יכול לשמש כדי להאריך את זמן העבודה של מילט במשך כמה שעות, אבל זה לא נדרש להפריה מיידית. - לאחר איסוף, בעדינות להחזיר את הדג למיכל התאוששות מלא במים מערכת.
הערה: במקום דגים בחזרה לתוך מיכל הקבינט כהה עבור איסוף זרע עתידי בעת הצורך.
5. הפריה חוץ גופית
- השימוש בפיפטה חדש לכל מניה, מערבבים את הזרע על ידי ליטוף ו/או הקשה בצד של הצינור לפני המפרה כמו זרע בילט יכול להתיישב בפתרון E400 לאורך זמן.
- לוותר על הפתרון של מילט או. מילט לתוך הנובה שנאסף טרי
- הוסיפו במהירות 1 מ ל של מי מערכת למצמד כדי להפעיל את הזרע ואת הביצים להפריה. הימנע מערבוב או הימנעות תוכן המנה ולאפשר 2 דקות להפריה להתרחש.
הערה: ערבוב והתערבבות מפחית במידה ניכרת את שיעורי הדישון, ולכן יש להימנע מהם14. - הוסף מדיה העובר E2 כדי למלא את המנה 2/3rd מלא.
הערה: בהתאם להליך הבא, העוברים יכולים לשמש מיד (למשל, להזרקה של מבנים גנטיים כמתואר לפני15) או עוברים ניתן לשלב ב E2 העובר מדיה ב 23 ° צ' עד שהם מגיעים 5 dpf. בשלב זה העברת עוברים למערכת הדיור הראשי באמצעות מערכת המים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס בעיקר על פרוטוקול6שפורסם בעבר. עם זאת, מאז A. מקסיפי הטבעת מולידה בשעות הלילה, עיצבנו מתלה דיור לגידול דגים שיכול לשנות את photoperiod עצמאית של שעות העבודה (איור 1). מחזור האור של הדג משתנה בתוך מערכת מידגה מלאה ומוקפת בזרימה, המכילה שלוש שורות של טנקים (איור 1). כל טנק מכיל אלמנט חימום עצמאי המשמש להגברת הטמפרטורה ידנית במהלך תהליך הטרמה. מדפים בודדים ניתן לשים על photoperiods נפרד ניתן לסגור כדי למנוע אור להיכנס או לברוח. כל photoperiods יכול להיות מניפולציות באמצעות בקר אוטומטי ממוקם בצד של מדף מחזור האור. לקבלת גישה בשעות החשוכות, ארון התקשורת מצויד בתאורת עבודה אדומה ובווילונות האפלה. A. מקסיפי הטבעת מולידה לאחר גידול בטמפרטורה מ 23-26 ° c עם תוספת של 1.5 ° c ליום16. כדי להשיג את זה בארונות הכהים שלנו, השתמשנו מחממי אקווריום הצוללת בכל טנק (איור 1).
הגורם העיקרי עבור הליך IVF מוצלח ב -a. מקסיפי-טבעת היא האיכות של הברובה הנאסף. Gravid, דג נקבה עם בטנם גדול, בולטות נוטים ביותר לשחרר את הטוב ביותר, אשר מופיעים ברור ואפילו במראה (איור 2a-d). הוספת מילט שנאסף לתוצאות כאלה בתהליך הפיתוח של עוברים מופרות בדרך כלל בתוך 20-30 דקות (איור 2e). עוברים מופרות קיימא יהפכו מעט לשקופים יותר לפני הכניסה לשלב התאים האחד של המחזור ההתפתחותי, והיא תיראה בלתי אחידה ואטומה יותר (איור 2e). העוברים הנובעים מוחזקים בצלחות פטרי בשנת E2 מדיה העובר בזירקון, ומודלים ב -23 ° c ב14/10 מחזור אור/כהה. העוברים מועברים לאחר מכן למערכת הדיור הראשית העיקרית ב 5 ימים הפריה לגידול.
כדי להדגים את החשיבות של הטכניקה, אנו מראים כיצד הפנוטיפים של כלאיים עבור תכונות ספציפיות כגון גודל העין הגוף פיגמנטציה יכול לעזור בפענוח הבסיס הגנטי שלהם. משפיש בבירור שונים מן המשטח דגים בגודל העין שלהם פיגמנטציה הגוף. כדי להבין את הבסיס הגנטי של תכונות אלה, חצינו את פני השטח ו מכפיש (F0) ושנוצר היברידי F1 ואוכלוסיות F2 באמצעות IVF להתבונן וריאציה גמישות פנוטיפית המתקבל (איור 3). גודל העיניים קטן יותר בדור F1 המציין שנוכחות העיניים היא תכונה דומיננטית חלקית (איור 3). ב-מערת פני השטח F2 כלאיים, אנו משיגים מגוון רחב של מידות עיניים, המציין כי יש מספר המקום השולט בגודל העין ב מקסיפי הטבעת, מה שהופך אותו תכונה כמותית (איור 3). דוגמה נוספת היא פיגמנטציה. התבוננות היברידית F1 של פני השטח מכפיש, ניתן להסיק כי פיגמנטציה הגוף היא תכונה דומיננטית כמו הדג הם פיגמנט מלא (איור 3). בדור F2, הווריאציה בגוף הפיגמנטציה מצביעה שוב לקראת תכונה כמותית. שילוב של נתונים פנוטיפים עם הנתונים ברצף יכול לחשוף הבסיס הגנטי האחראי על פנוטיפים אלה. אלה אוכלוסיות F2 הם משאב טוב להבנת הבסיס הגנטי של תכונות שונות ואוכלוסיות כאלה שימשו בעבר ללמוד אלה תכונות17,18,19. טכניקה סטנדרטית IVF יכול מאוד לייעל את הדור של כלאיים, המאפשר מיפוי גנטי של הבית שליטה בתכונות כאלה ולעזור לנו להבין איך פנוטיפים מסוימים הם חוסר יתרון בבתי גידול מסוימים ומסתגלת אחרים.
איור 1 : עיצוב ארונות למשמרת יום/לילה מחזורים של . מקסיפי-טבעת (א) הכיוונון הכללי של מערכת מתלה זו מאפשר מניפולציה photoperiod, מתן הדמיה של זמן לילה בשעות היום כאשר דלתות סגורות, אורות המדף כבויים. (ב) הטרמה הדג לעירור ההבשלה הטובה מושגת באמצעות מחממי הצוללת (ראו טבלת חומרים) המותקנים במיכלים בודדים שניתן להתאימו בנפרד (חיצים אדומים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : דוגמאות של נשים מתאימות לאוסף הטוב והמחשה ייצוגית של בנובה קיימא ובלתי קיימא. (א) gravid, דג נשי עם בטנם גדול, בולטות מתאימים יותר עבור אוסף הטובה ידני מאשר (ב) נקבות עם בטן בצורת יעיל. (ג) בר קיימא (כלומר, הפקת עוברים קיימא כאשר מופרות) ניתן לזהות על ידי המראה הברור שלהם, אפילו, בעוד בנובה קיימא (כלומר, לא מייצרים עוברים קיימא כאשר מופרות), כפי שמוצג (ד), יש מעונן, מחוספס מראה. (ה) לאחר הפריה מוצלחת, עוברים קיימא להיות שקופים יותר להיכנס לשלב אחד התא בעוד המופרית (חיצים אדומים) יהיה לאט להירקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ניתוח גנטי של גודל העין והגוף פיגמנטציה תכונות. רבייה מראה תמונות של הורים (F0) דג השטח (למעלה משמאל) ו מכפיש (למעלה מימין), F1 היברידיות (שורה שנייה) ו כלאיים F2. הדג F1 יש גודל העין ביניים הם פיגמנט באופן מלא בעוד הדגים F2 להראות וריאציה רחבה בשתי תכונות מורפולוגית: גודל העין פיגמנטציה. ניתן לגשת לכל הנתונים המקוריים שבבסיס איור זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד IVF היא שיטה סטנדרטית עבור אורגניזמים רבים מודל שונים כגון zebrafish, פרוטוקולים קיימים עבור מקסיפי הטבעת לא לקחת בחשבון כי זן זה מולידה באופן טבעי בשעות הלילה6. בהתחשב בעובדה כי דגי מערות ומשטח שונים באופן דרסטי למדי במקצבים שלהם, מחזור ההבשלה של הנובה שונה גם בין מערת ומשטח מורפולונים. בעוד הטמפרטורות ההיערכות והשעות עבור פני השטח A. מקסיפי לומדים היטב12, מקפיש יכול להיות שונה בהתנהגות שלהם מחזור התבגרות. שיטות קונבנציונליות של ייצור היברידי הם ולכן מאוד מאתגרת ולא בטוח בשל אובדן של קצב מעגלי במערה מורדית של A. מקסיאנוס7, אשר תוצאות שונה השאיפה של דגים אלה. על ידי העברת photoperiod, אנחנו יכולים לספק זמן היברידית מסוימים השעה מבלי להסתמך על אירועים נדירים ההשמה הטבעי בין שני מורפולגיה. שמירה על המערה ועל פני דגים נפרדים גם מונע משטח אגרסיבי morphs מפני השפעה שלילית על הרבייה.
חלק מהמגבלות קיימות בשיטה זו, כגון וריאציות באיכות הטובה. זיהוי של נקבה (פני השטח או מערות) עם בוגרת היא לא טריוויאלי ודורש תצפיות זהירות של התנהגות הדג. באופן כללי, הנקבות gravid מוכן הבטנם יש גדול יותר יהיה מברשת שוב ושוב נגד משטח הטנק התחתון או מלכודת אוסף העובר20.
הבחנו שאיכות הזרע עקבית לאורך כל היום/מחזור הלילה. הצעד הקריטי של IVF מוצלח (מוצלח במונחים של הפקת עוברים מופרות) הוא השגת איכות טובה, בר קיימא. לכן, חשוב מאוד לאסוף את הנובה מן הדגים העומדים להשריץ באופן טבעי (איור 2a). ברגע שהנובה נאספים, ניתן לצפות בהם תחת מיקרוסקופ לניתוח כדי לבחון את האיכות. האוסף של הנובה קיימא במהלך הלילה, עם זאת, הוא לא נוח ומאתגר עבור החוקר. הכיוונון שאנו מציגים כאן מאפשר הסטה של מחזור ההבשלה של הנובה, כך IVF ניתן להשתמש כדי ליצור עוברים מסונכרנים עבור יישום במורד במהלך שעות עבודה רגיל.
עם התקדמות הקריוגנית של מילט (למשל, כפי שהוא מתואר דג זברה21), IVF יהפוך כלי רב עוצמה לקראת הקמת ושמירה על קווים גנטיים עבור מערכת המודל המתעוררים a. מקסיפי-טבעת. בשילוב עם שיטות עבור שינוי גנטי15 ו-מבוסס על מורגוולסטינו מבוססי17, הליכים אלה יספקו את פלטפורמת מתודולוגי לחקור את הבסיס הגנטי וההתפתחותי של עיבודים שונים בתי גידול בתוך מקסיפי-טבעת.
לסיכום, הפרוטוקול המוצג כאן יאפשר הפקה של עוברים מסונכרנים של A. מקסיאנוס עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כגון הזרקה של מבנים גנטיים או לימוד מוקדם embryological פנוטיפים. הכוח העיקרי של הפרוטוקול הוא שזה מאפשר ייצור יעיל של משטח מערת היברידיות שניתן להשתמש כדי גנטית למפות פנוההבדלים בין דגי שטח ו מערות דרך QTL (תכונה כמותית) ניתוח. שצולמו יחד, קבלת בנובה קיימא במהלך היום עבור IVF היא טכניקה רבת עוצמה כי יהיה מועיל עבור מגוון רחב של מחקרים עתידיים בתחומים שונים של מדעים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לפיליפ נוגורה וקימברלי באנד על תמיכתם בהפקת וידאו. המחברים גם רוצים להכיר בצוות השלם של מכון הסטודרים לגידול בעלי חיים. עבודה זו תמכה במימון מוסדי ל-DPB ו-NR. ע"נ נתמך על ידי קרן אדוארד מלנקס ו JDRF. RP היה נתמך על ידי מענק מתוך הגרמני Forschsgeמייסמייסםהירכתיים (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
