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Bioengineering

Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Grupo de proteínas de receptor germinant en 'germinosomes' en la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis . Se describe un protocolo utilizando proteínas de super resolución microscopia y fluorescente reportera para visualizar germinosomes. El protocolo también identifica dominios de membrana interna de la espora que preferentemente se tiñen con el colorante de membrana FM4-64.

Abstract

El pequeño tamaño de las esporas y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, causar dificultades en sus análisis microscópicos mediante microscopía de epifluorescencia. Microscopía de iluminación estructurada tridimensional súper resolución (3D-SIM) es una herramienta prometedora para superar este obstáculo y revelar los detalles moleculares del proceso de germinación de las esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis). Aquí, describimos el uso de un SIMcheck modificado (ImageJ)-proceso de proyección de imagen 3D asistente y reportero fluorescente proteínas para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis , clusters de las proteínas de la germinación. También presentamos un procedimiento de proyección de imagen 3D-SIM (estándar) para FM4-64 tinción de membranas de esporas B. subtilis . Mediante el uso de estos procedimientos, obtuvo una resolución para la localización de germinosome y demostrar que > 80% de B. subtilis KGB80 esporas latentes obtenidas después de la esporulación en el medio mínimo definido de MOPS tienen uno o dos GerD-GFP y GerKB-mCherry focos. Focos brillantes fueron también observados en FM4-64 manchados imágenes de 3D-SIM de esporas sugiriendo que existen dominios de lípidos de membrana interna probablemente diferentes fluidez. Otros estudios que utilizan doble etiquetado procedimientos con tintes de membrana y germinosome proteínas de reportero para evaluar la localización y así obtener un panorama óptimo de la organización de proteínas de bacilo germinación en la membrana interna de la espora son posible.

Introduction

Esporas de orden Bacillales y Clostridiales son metabólicamente inactivos y extraordinariamente resistente a los regímenes de descontaminación áspero, pero a menos que germinan, no pueden causar efectos nocivos en los seres humanos1. En la germinación activada germinant nutrientes de esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis), el evento de iniciación es germinant Unión a los receptores germinant (GRs) situado en la membrana interna de la espora (IM). Posteriormente, el GRs transducen señales a la proteína de canal de SpoVA en el IM. Esto se traduce en el inicio del intercambio de esporas núcleo piridina-2, 6-dicarboxílico (ácido dipicolinic; DPA; comprende el 20% del peso seco de la base de espora) de agua a través del canal de SpoVA. Posteriormente, el lanzamiento DPA desencadena la activación de la hidrólisis del peptidoglicano de la corteza, y absorción de agua sigue2,3,4. Estos eventos conducen a esfuerzos mecánicos en las capas de la capa, su posterior ruptura, la aparición de la consecuencia y, finalmente, crecimiento vegetativo. Sin embargo, todavía lejos de se resuelven los detalles moleculares exactos del proceso de germinación.

Una cuestión importante sobre la germinación de esporas refiere a las propiedades biofísicas de los lípidos que rodean las proteínas de germinación IM así como las proteínas de canal de IM SpoVA. Esta bicapa de lipídica en gran parte inmóvil de IM es la barrera principal de la permeabilidad de muchas moléculas pequeñas, incluyendo conservantes químicos tóxicos, algunas de las cuales ejercen su acción en el núcleo de la espora o célula vegetativa citoplasma5,6. La bicapa lipídica IM es probable que en un estado de gel, aunque existe una fracción significativa de lípidos móviles en IM5. IM de la espora también tiene el potencial para una expansión significativa5. Así, aumenta la superficie de la IM 1.6-fold sobre germinación sin síntesis de membrana adicional y se acompaña de la pérdida de la membrana característica baja permeabilidad y lípidos inmovilidad5,6.

Mientras que los detalles moleculares de la activación de las proteínas de la germinación y organización de los lípidos de la IM en las esporas son atractivos temas de estudio, el pequeño tamaño de las esporas B. subtilis y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, plantean un desafío análisis microscópico. Griffiths et al. convincente evidencia de microscopio de epifluorescencia, utilizando reporteros fluorescentes fusionados a proteínas de la germinación, sugiere que en las esporas B. subtilis la proteína GerD organiza tres subunidades GR (A, B y C) de GerA, B y K GRs, en un cluster de7. Acuñó el término 'germinosome' para este grupo de proteínas de germinación y describe las estructuras como ~ 300 nm gran IM proteína focos8. Sobre la iniciación de la germinación de la espora, germinosome fluorescente focos en última instancia, cambian en mayor dispersar patrones fluorescentes, con > 75% de la población de esporas viendo este patrón en las esporas germinadas durante 1 h con L-valina8. Tenga en cuenta que el documento mencionado anteriormente usado promedio imágenes de docenas de imágenes fluorescentes consecutivos, para ganar potencia estadística y superar el obstáculo de baja señales fluorescentes observadas durante la proyección de imagen. Esta visualización de estas estructuras en esporas bacterianas estaba en el borde de lo que es técnicamente factible con herramientas microscópicas clásicas y ni una evaluación de la cantidad de focos en una sola espora ni su localización subcelular más detallada fue posible con este enfoque.

Aquí, demostramos que el uso de microscopía de iluminación estructurada (SIM) para obtener una visualización detallada y cuantificación de la germinosome(s) de las esporas de B. subtilis, así como de sus IM lípidos dominios9. El protocolo también contiene instrucciones para la esporulación, preparación de los portaobjetos y análisis de imagen por SIMcheck (v1.0, un plugin de imageJ) así como ImageJ10,11,12.

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Protocol

1. esporulación de B. subtillis (tiempo: 7 días antes de la observación microscópica)

  1. Día 1
    1. Raya un cultivo bacteriano en caldo de Luria-Bertani (LB) agar placa (1% triptona, extracto de levadura 0.5%, 1% NaCl, agar al 1%)13 e incubar durante una noche a 37 ° C para obtener las colonias individuales. Utilizar la cepa B. subtilis KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB mCherry gato, gerD-gfp kan) y su cepa parental de fondo PS4150 B. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) como se describe previamente7.
      Nota: El uso de esporas con el fondo de ΔcotEΔgerE es esencial en la visualización de la germinosome, con el fin de reducir al mínimo la autofluorescencia de la espora capa capas7.
    2. Esterilizar todos los medios, tubos, pipetas y otros materiales de la cultura para ser utilizados con los métodos adecuados.
  2. Día 2
    1. Inocular una colonia solo en 5 mL de medio LB temprano en la mañana e incubar el cultivo en agitación continua en un tubo de tapón de rosca en 200 rpm/min y 37 ° C hasta que el OD600 llegue a 0.3-0.4 (aproximadamente 7 h).
    2. Tomar 500 mL de medio de MOPS (pH 7,5) que contiene 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2por4, 0.01 m m FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, Tricina, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucosa-monohidrato de 4 mM y 10 mM de NH4Cl.
    3. Preparar en el tapón de rosca tubos 10-1- 10-7 diluciones seriadas de la cultura LB en 5 mL medio de MOPS cada e incubar los cultivos durante la noche bajo agitación constante a 200 rpm/min y 37 ° C.
      Nota: Las diluciones seriadas preparadas aquí pretenden obtener una dilución en la fase exponencial temprana en la mañana siguiente. Este paso y el siguiente paso están necesarios para permitir que las células a adaptarse al medio de crecimiento tampón MOPS.
  3. Día 3
    1. Seleccione una de las diluciones de MOPS con un OD600 de 0.3-0.4. Inocular 0,2 mL del cultivo a precalentado (37 ° C) 20 mL de medio de MOPS en un matraz cónico de 250 mL e incubar en agitación continua hasta que el OD600 llegue a 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inocular el medio de esporulación en base de MOPS (250 mL) con 1% (v/v) la cultura del paso 1.3.1 e incubar durante 3 días a 37 ° C en un matraz de litro cónico bajo agitación continua. Para FM4-64 tinción de esporas de PS4150, añadir 2 μg/mL FM4-64 la punta de prueba (véase Tabla de materiales) para la esporulación medio 1 o 2 h después de alcanzar el máximo valor de600 OD de crecimiento vegetativo (generalmente aproximadamente 2) y la cultura a posteriormente esporular mientras protege de la luz5.
  4. Día 7: Recolección de esporas
    1. Determinar el rendimiento de la esporulación (células vegetativas de esporas vs) utilizando microscopía de contraste de fase con 100 aumentos para distinguir las esporas brillante fase de células oscuras de fase y posiblemente no maduran las esporas. Se espera un rendimiento de 90% fase espora brillante.
    2. De la pelotilla de las esporas a 4.270 x g durante 15 min a 4 ° C en tubos de centrífuga fondo redondo. Lavar el precipitado de esporas 2 - 3 veces con 40 mL de agua ultra puro estéril del tipo 1 desmineralizada en tubos de centrífuga cónico de 50 mL (véase Tabla de materiales). La desaceleración en cada colada a 4.270 x g durante 15 min (4 ° C).
  5. Día 7: Purificación de esporas
    1. Purificación de la espora: suspender el sedimento de la espora en 750 μl del gradiente medio de 20% densidad no iónicos (véase tabla de materiales) y cargar en 800 μl de 50% no iónicos de densidad gradiente medio en tubos estériles de microcentrífuga. Centrifugar durante 60 min a 21.500 x g. El precipitado obtenido contiene las esporas libres. Suspender el sedimento de la espora en 200 μL de gradiente medio de 20% densidad no iónico y cargar en 1 mL de medio gradiente de densidad no iónicos de 50% en un tubo de microcentrífuga y centrifugar 15 min a 21.500 x g.
    2. Lavar la preparación final de la espora y el almacenamiento: el precipitado obtenido contiene las esporas latentes purificadas. Lavar el pellet de esporas 2 - 3 veces con 1,5 mL de estéril ultra pura tipo 1 de agua (véase Tabla de materiales) y la desaceleración entre a 9.560 x g durante 15 min a 4 ° C. Por último, suspender el sedimento en agua ultra pura estéril del tipo 1 a una final de OD600 de aproximadamente 30. Alícuotas de las esporas se pueden almacenar a-80 ° C durante 8 semanas14.

2. decapado

  1. Tratar PS4150 esporas con 0,1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% sodio dodecil sulfato (SDS) / 0.1 M dithiothreitol (DTT) a 70 ° C por 1 h. lavar las esporas 10 veces con esterilizada ultra pura tipo 1 agua15,16. Al hacerlo, cualquier había adsorbido prueba FM4-64 en la membrana externa de la espora y se quitarán las capas externas.

3. cubreobjetos y preparación de los portaobjetos11 (tiempo: 1 H antes de observación)

  1. Cubreobjetos de la limpia de alta precisión (véase tabla de materiales) con 1 M de HCl por 30 min en un baño suavemente. Lavar los cubreobjetos dos veces en agua ultra pura tipo 1 y almacenarlas en un 100% (vol/vol) EtOH. Dejarlos secar y verificar su claridad antes del uso. Limpieza previa de las diapositivas de cristal en el 70% EtOH. Dejarlos secar y verificar su claridad antes del uso.

4. muestreo microesferas fluorescentes o esporas en el marco Gene diapositiva10 (tiempo 15 Min)

  1. Caliente previamente las dos 70% EtOH limpia portaobjetos secos (véase tabla de materiales) al aire durante varios segundos en un bloque de calefacción de 70 ° C, gota 65 μL de esterilizado agarosa 2% en 70 ° C sobre un portaobjeto y coloque el otro portaobjetos de cristal en la parte superior a la b de agarosa ntre las diapositivas. El parche de agarosa se seque en aproximadamente 5 minutos.
  2. Corte el parche de agarosa en una sección de 1 x 1cm después de quitar uno de los portaobjetos de vidrio, agregar 0,4 μL de muestra (microesferas fluorescentes o esporas de ~ 108/ml) y transferir el remiendo sobre el cubreobjetos de alta precisión al colocar el cubreobjetos sobre el parche y deslizar.
  3. Fijar un Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 μL) en la diapositiva seca, sobre la cual se coloca el cubreobjetos cerrando todas las esquinas del marco, completando así la diapositiva para el uso en microscopía.

5. proyección de imagen de11,17(tiempo: 1 H)

  1. Capturar las imágenes de transmisión y de la fluorescencia de las esporas, así como una mezcla de rojo y amarillo-verde modificado carboxylate microesferas fluorescentes en un microscopio de iluminación estructurada (véase tabla de materiales) equipado con un 100 x (objetivo) aceite Apertura numérica = 1.49), un software de análisis de imagen y cámara de CCD (véase tabla de materiales). Generar todas las imágenes a temperatura ambiente sin la perturbación de la luz ambiente. Asegúrese de limpiar siempre el 100 x objetivo y el portaobjetos con el etanol del 75% antes de la proyección de imagen.
  2. Centran en microesferas fluorescentes de 100 nm (diámetro) y optimizar la función de extensión del punto (psf) ajustando el anillo de corrección en el objetivo de 100 x hasta una psf simétrico, minimizando así el desenfoque de la imagen. El psf es la respuesta del impulso o la respuesta de un sistema de proyección de imagen a un objeto de punto o punto de origen.
  3. Seleccione un campo de visión con microesferas fluorescentes ronda aproximadamente 10. Aplicar una rejilla foco ajuste para ambos 561 nm y longitudes de onda de excitación de nm 488 como la guía para el software de análisis de imagen.
  4. Se centran las esporas con la luz de la transmisión y captura de una imagen de luz de transmisión en el modo media 16 × con exposiciones de 200 ms para cada imagen.
  5. Captura de imágenes 3D-SIM fluorescente de las esporas con el modo de iluminación "3D-SIM", la configuración de la cámara a modo de lectura aumento de electrones multiplicando (EM) 10MHz a 14 bits y la ganancia de la EM en 175. Excitar la punta de prueba FM4-64 en esporas de PS4150 con luz de láser de 561 nm en el 20% energía del laser y un tiempo de iluminación de 400 ms.
  6. Excitar el mCherry GerKB y GerD-GFP en KGB80 esporas con, respectivamente, 561 nm de luz láser en energía del laser de 30% para 1 s y 488 nm láser luz 60% potencia del láser para valores de Z-Stack s. 3 son en la parte superior a inferior modo, 0.2 μm / paso, 7 pasos y 20 pasos para germinosome y Análisis de la IM, respectivamente.
    Nota: Estos parámetros de láser se aplicaron con el fin de asegurar un valor de brillo máximo de la ventana de histograma de alrededor 4.000.

6. reconstruir imágenes 3D-SIM de FM4-64 tinción de esporas de PS4150

  1. Realizar la reconstrucción del segmento N-SIM para el FM4-64 manchado datos crudos de las esporas de la PS4150. Haga clic en el botón Param para Reconstruir la hoja de ficha de pad N-SIM para abrir la ventana de reconstrucción de corte de SIM N.
  2. Configure los parámetros de reconstrucción en la ventana de Reconstrucción de Slice N-SIM . Para obtener imágenes perfectas reconstruidos, seguir la sugerencia de las instrucciones de SIM N y haga clic en los controles apropiados en la ventana de Reconstrucción de corte SIM N para establecer la Iluminación modulación de contraste (IMC) en Auto, alto Supresión de ruido de resolución (HRNS) a 1.00 y De supresión de desenfoque de enfoque (OFBS) a 0.05 como puntos de partida.
  3. Haga clic en el botón Reconstruir rebanada en la ventana N SIM Slice reconstrucción para reconstruir la imagen. Evaluar la calidad de las imágenes reconstruidas por las imágenes de la transformada rápida de Fourier (FFT) y puntuación de la reconstrucción, que después de reconstrucción12.
  4. Ajustar los HRNS de 0.10 a 5.00 y OFBS de 0,01 a 0,50 haciendo clic en los controles apropiados en la ventana de Reconstrucción de corte SIM N hasta obtener la mejor configuración de los parámetros es.
  5. Haga clic en el botón aplicar en la ventana N SIM Slice Reconstuction aplicar parámetros cambiantes. Haga clic en el botón cerrar para cerrar la ventana.
  6. Hacer un FM4-64 manchado PS4150 esporas imagen activa y haga clic en el botón Reconstruir rebanada en la hoja de ficha N SIM Pad para ejecutar la Reconstrucción de la rebanada. Guarda la imagen reconstruida.

7. Análisis de la imagen

  1. Convertir imágenes Pseudo-campo amplio de la germinosome de KGB80
    1. Convertir imágenes raw 3D-SIM de KGB80 Pseudo-Widefield imágenes mediante la activación con un clic izquierdo el plugin de ImageJ SIMcheck utilidad SI de datos Raw a Pseudo-Widefield12. Pseudo-campo amplio promedio de imágenes de datos SIM y monta, en comparación, una imagen equivalente a widefield convencional iluminación12. Para ImageJ se vea https://imagej.net/Welcome. Seleccione al azar ~ 25 esporas en cada imagen invertida de la transmisión para su posterior análisis de germinosome en las imágenes de campo amplio de Pseudo fluorescentes.
    2. Seleccione de las esporas de KGB80 total aproximadamente 350 (en este ejemplo, 346) en 14 campos de vista de dos diapositivas. El número de focos fluorescentes GerD-GFP y GerKB-mCherry en las esporas de KGB80 debe ser contado independientemente por dos investigadores. El investigador puede devolver a las imágenes raw 3D-SIM cuando en duda de la presencia de focos de germinosome fluorescente separada de las esporas.
    3. Evaluar las intensidades máximas de cada foco de GerD-GFP y GerKB-mCherry y la intensidad integrada de imagen 3D de cada espora KGB80 con ImageJ.
  2. Analizar imágenes Pseudo-campo amplio de la germinosome de KGB80
    1. Utilizar el valor de media intensidad integrada de 7 pilas como la intensidad de señal integrado de la espora KGB80. Determinar las intensidades de fondo por la tensión de fondo PS4150 con idéntica configuración de imagen. Consideran puntos fluorescentes en esporas de KGB80 individuales germinosome focos cuando son claramente distinguibles del fondo.
    2. Aplicar pruebas de ANOVA unidireccionales para determinación de significancia con el software de origen 9.0. teniendo en cuenta los valores de P < 0.05 como estadísticamente significativo. Uso de coeficiente de correlación de Spearman18 para evaluar la correlación de GerD-GFP y mCherry GerKB número de focos y las mediciones de la intensidad de señal integrado.

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Representative Results

El protocolo actual presenta un procedimiento proyección de imagen del microscopio de la SIM para esporas bacterianas. Los procedimientos de preparación de esporulación y diapositiva se llevaron a cabo como se muestra en la figura 1 antes de la proyección de imagen. Más tarde, se aplicaron los procedimientos de análisis y proyección de imagen de ambos para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas de germinación) y brillante espora (sonda lipofílico manchado IM) muestras como se muestra en el siguiente texto.

Localización de germinosomes de esporas B. subtilis

Niveles de GerD y GerKB se divulgan para ser 3.500 ~ y ~ 700 moléculas por espora, respectivamente, basados en análisis de Western blot de extractos de esporas en un medio de esporulación rico19. El gerD-gfp y gerKB-mCherry genes en la cepa de KGB80 están bajo el control de su promotor nativo. La baja abundancia relativa de proteínas de fusión llevó a una baja de la señal fluorescente durante la proyección de imagen, así que era difícil de reconstruir esas imágenes dim SIM por el algoritmo de reconstrucción de SIM. Sin embargo, el microscopio SIM todavía se aplicó para la adquisición de la imagen de germinosome, aunque las imágenes crudas del SIM fueron convertidas en imágenes Pseudo-Widefield por SIMcheck (plugin de ImageJ). Además, una proyección de imagen 3D de siete pila se implementó para obtener una mejor visión de este enfoque IM. Como se muestra en el panel izquierdo de la figura 2, dos focos de GerD-GFP aparecieron en pilas diferentes. El, en total, tres focos de GerD-GFP se indican por las flechas blancas en pila de Z3 compositivo de la columna. El panel de la derecha de la figura 2 muestra una espora con sólo un punto focal de GerD-PIB en la espora según lo evidenciado por la flecha blanca en pila de Z4 de la columna compuesta. En total, alrededor 40% y 50% de las esporas tenían dos o uno GerD-GFP y GerKB-mCherry racimo, respectivamente (tabla 1). Entre las 346 esporas examinadas, dos tenían 4 focos de GerD-GFP, y una espora incluso tenía 5 focos de GerD-GFP. Perceptiblemente, en nuestras manos, el número de focos de GerD-GFP y mCherry GerKB en la misma espora no era siempre los mismo18. Como el microscopio SIM no hay opción de contraste de fase, se utilizó microscopía de transmisión para la localización de la espora. Así, las esporas aparecen con un núcleo oscuro y denso rodeado de un halo brillante.

La intensidad de fluorescencia integrada de esporas KGB80 se midió mediante ImageJ. Esporas, que tenían 0, 4 o 5 focos no se incluyeron en el análisis estadístico debido a su baja frecuencia. Hubo una correlación positiva alta entre GerD-GFP y GerKB-mCherry integrado intensidades (coeficiente de correlación espeso del Spearman = 0.73). Mientras que la intensidad integrada de la proteína GFP de GerD fue diferente entre diferentes poblaciones (figura 3), la intensidad integrada de GerKB mCherry fue casi la misma en diferentes poblaciones (figura 3D). La intensidad de la fluorescencia máxima de focos GerD-GFP y GerKB-mCherry tendió a disminuir, cuando la espora tuvo focos múltiples (Figura 3A, B). La fluorescencia máxima de todos los puntos luminosos, considerados como focos de germinosome, fue superior a la máxima auto-fluorescencia de PS4150 esporas (las esporas de la cepa de fondo KGB80; Figura 3A Y , B).

Organización de la membrana interna

Como se mencionó en la introducción, las proteínas germinosome se encuentran en IM de la espora. Sin embargo, pocos detalles se conocen acerca de las propiedades biofísicas de esta membrana en gran parte inmóvil. Explorar más detalles, como organización local de la IM, promover la comprensión de la organización de las proteínas de la IM, en particular GRs y proteínas de canal. Las esporas B. subtilis tienen una estructura compuesta por múltiples capas concéntricas, y una sonda lipofílica no puede pasar fácilmente a través de estas múltiples capas para teñir el IM que rodea el núcleo de la espora. El paso de tales sondas más probable es que se ve obstaculizado por las capas de la capa rica en proteínas y quizás también la membrana externa20,21. Para superar este problema, el tinte lipofílico membrana FM4-64 se agregó a una cultura de PS4150 durante la esporulación. Al hacerlo, la membrana de la célula vegetativa PS4150 fue manchada por FM4-64, y así las membranas en forespores de esta cultura en la división de célula asimétrica esporulación y forespore posterior inmersión se tiñen bien5. En consecuencia, se pueden visualizar las membranas de la espora madura. Un estudio indicó que la mayoría si no todos el FM4-64 en el IM de esporas limpio5. Durante un período de aproximadamente 2 semanas de incubación y los tratamientos de purificación de esporas, los procedimientos de lavado aplicamos quitar cualquier FM4-64 de la membrana externa, este último con eficacia siendo eliminados tras el tratamiento decoating y amplios pasos de lavado 5. sin embargo, el procedimiento de desengomado no elimina FM4-64 del IM, ni tiene ningún efecto sobre los focos de germinosome5,6. Lo que nos excita es que más brillante FM4-64 puntos similares a focos de germinosome aparecieron en ambos intacto (Figura 4A, B) y decoated esporas (figura 4, D) de esporas PS4150. Estos puntos brillantes de FM4-64 podrían estar implicados en el agrupamiento de las proteínas germinosome en el IM.

Figure 1
Figura 1: Resumen de esporulación y diapositiva preparación. Un resumen mostrando los pasos iniciales necesarios antes de la proyección de imagen. Toda la información se da en el protocolo. Medio (A) el esquema del procedimiento de esporulación en MOPS mínimo definidos. Un PS4150 B. subtilis (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) o KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) solo Colonia fue cultivado en 5 mL de medio rico LB y adaptado en 5 mL y 20 mL de fregonas medio a su vez y finalmente esporulado en 250 mL de medio de fregonas. Una cultura de la fase exponencial temprana (OD600, 0.3-0.4) se utiliza en todas las culturas intermedias. FM4-64 (2 μg/mL) fue añadido al medio de esporulación PS4150 membrana esporas tinción 1 o 2 h después de alcanzar el valor máximo OD600 . (B) método de recolección de esporas de la cultura de esporulación de fregonas y purificar las esporas por centrifugación de gradiente de densidad. (C) procedimiento de estabilización de las esporas en cojín de agarosa 1% en una cámara de marco gene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representante de Pseudo-Widefield (PWF) 3D imágenes de GerD-GFP y GerKB-mCherry focos en imágenes raw de dos KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) inactiva esporas 3D-SIM se tomaron con excitación de dos canales (561nm, energía del laser 30%, laser de 1 s y 488nm, 60% de potencia, 3 s) con 7 pasos de arriba a abajo pilas de Z. Posteriormente, las crudas imágenes SIM fueron convertidas en imágenes 3D de Pseudo-campo amplio por el plugin de ImageJ SIMcheck. De izquierda a derecha, 3D imágenes (Z2-Z5) de GerD-GFP (green), GerKB-mCherry (rojo) y las correspondientes imágenes compuestas de dos esporas de KGB80 (i y ii) se muestran en el panel. Imágenes luz transmisión (transporte) de dos esporas (i y ii) indican la ubicación de las esporas que aparecen como imágenes densas oscuras rodeadas de un halo brillante. Barra de escala = 1 μm y todos los paneles están en la misma ampliación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La intensidad de la fluorescencia máxima de GerD-GFP en KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) esporas latentes y la intensidad máxima auto-fluorescencia de PS4150 esporas en unidades arbitrarias. Todas las esporas fueron iluminadas por los ajustes indicados el protocolo. Paneles (A) y (B) muestran la intensidad de la fluorescencia máxima de los focos de GerD-GFP y GerKB-mCherry, respectivamente, en esporas latentes de KGB80 así como en ambos casos la intensidad máxima auto-fluorescencia de las esporas de padres PS4150. Paneles (C) y (D) muestran la intensidad de fluorescencia integrada de los focos de GerD-GFP y la intensidad de fluorescencia integrada de los focos de GerKB-mCherry, respectivamente, en B. subtilis KGB80 esporas latentes. Se utilizó ANOVA unidireccionales-pruebas para la determinación de la significación de las diferencias en intensidad máxima coordinación e intensidades de fluorescencia espora integrado con software 9.0 de origen teniendo en cuenta los valores de P < 0,05 como significativo. Esporas con 4 o 5 focos fueron excluidas del análisis debido a su baja abundancia. Los datos se representan en boxplots con muescas. Las muescas en las parcelas están alrededor de los valores promedio observados con su anchura proporcionales al rango intercuartil (IQR). Los bigotes que se muestra representan un máximo de 1.5 el IQR. Los asteriscos indican una diferencia significativa de la mediana. GerD-GFP e intensidades de fluorescencia de GerKB-mCherry integrado tienen una fuerte correlación positiva (coeficiente de correlación de Spearman = 0.73)18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Representante de Pseudo-Widefield (PWF) imágenes (A y C) y reconstruido SIM (B y D) del FM4-64 manchado IM de PS4150 B. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) esporas. FM-464 se incorporó las esporas durante la esporulación. Imágenes 3D-SIM de esporas intactas (A y B) y esporas decoated (C y D) fueron tomadas con la excitación de un canal (561 nm láser, energía del laser de 20%, 400 ms) usando un top 25 paso a fondo Z-stack. Posteriormente, los datos brutos de SIM fue reconstruidos por el software de imágenes de microscopio (véase Tabla de materiales) en imágenes de 3D-SIM, o convertidos en PWF por SIMcheck (plugin de ImageJ). Las flechas cian señalan focos de FM4-64 en la mensajería instantánea en el panel B y D. Barra de escala = 1 μm y todos los paneles están en la misma ampliación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cepa Esporas contadas Focos Focos por espora (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabla 1: Presencia de focos de esporas KGB80. El número de focos germinosome por espora en una población de doble etiquetado KGB80 B. subtilis (PS4150 Edwin gerKC gerKB-cat mCherry gerD-gfp kan) las esporas latentes. Fluorescencia de las esporas se cuenta como focos germinosome al máxima intensidad de un foco fue mayor que la intensidad de la fluorescencia de auto, que era la intensidad máxima de PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) esporas latentes excitados por la misma configuración de iluminación como las esporas de KGB80.

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Discussion

El protocolo presentado contiene un procedimiento estándar 3D-SIM para el análisis de FM4-64 tinción de esporas B. subtilis que incluye esporulación, preparación de los portaobjetos y procesos de la proyección de imagen. Además, el protocolo describe un SIMcheck modificado (ImageJ)-asistido 3D imaging proceso para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis con reporteros fluorescentes. El último procedimiento nos ha permitido observar esta estructura tenue con contraste. Por acoplamiento dos procedimientos por imágenes, es posible visualizar estructuras discretas sub en la misma espora al microscopio SIM mismo, mejorando así nuestra base para una comprensión mecanicista del proceso de germinación. Tenga en cuenta que el procedimiento funciona a una resolución lateral de ~ 100 nm y una resolución axial de ~ 200-250 nm. Esto es mejor que el enfoque de amplio campo de la microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC) utilizado por Griffith7. Vez resueltos análisis de aspecto germinosome sobre la iniciación de la germinación sería un siguiente paso deseado. Desafortunadamente, aunque la microscopia SIM es en principio compatible con imágenes en vivo, debido a la naturaleza tenue de la germinosome señales tal SIM tiempo resuelto, análisis no son factibles debido a la rápida decoloración de las muestras durante la adquisición de la imagen. Con el fin de obtener suficientes esporas para el análisis, es crucial para asegurarse de que eso esporulación eficientemente está llevando a cabo. Los investigadores por lo tanto deben verificar eficiencia de esporulación meticulosamente con 90% de eficiencia como el objetivo. En los resultados representativos, en esporas latentes, respectivamente ~ 50% y el 40% de todas las esporas tienen uno o dos GerD-GFP y focos de GerKB-mCherry (tabla 1). El porcentaje de esporas con los dos focos es mucho mayor que el reportado por Griffiths previamente7. Hay varias razones que podrían explicar el resultado diferente en el trabajo actual. En primer lugar, el proceso de la proyección de imagen en 3D podría facilitar la detección de focos más. Focos diferentes en la misma espora se encuentran en lugares diferentes en la dirección vertical como se muestra en la figura 1. En segundo lugar, la cámara CCD (Tabla de materiales) y la unidad de láser para el microscopio SIM contribuyen significativamente a los resultados de la proyección de imagen. En tercer lugar, similar a la enfoque7 media docenas de imágenes consecutivas para el mejor análisis de la imagen de Griffiths, la imagen de Pseudo-campo amplio de la germinosome era también una imagen promedio de imágenes raw de SIM (5 fases y 3 imágenes de orientaciones). Finalmente, el medio de esporulación y las condiciones de esporulación, una variable importante en la determinación de propiedades de esporas, son diferentes en nuestro trabajo de la utilizada previamente. Griffiths et al.7 utiliza rico 2 x de Schaeffer-glucosa (2 x SG) medio para esporulación, mientras MOPS mínimo definido medio tamponado con trabajó aquí. Varios trabajos han demostrado que las condiciones y medio de esporulación tienen efectos significativos en la composición de proteínas, resistencia, y la germinación de B. subtilis esporas22,23,24 , 25. en efecto, se ha demostrado que los niveles de subunidades GR son 3 a 8 veces menor de esporas en un medio pobre versus los obtenidos en medio rico. Niveles de GerD también fueron unos 3.5-fold menores de esporas medio pobre, y estas esporas tomaron más tiempo para iniciar la germinación de la espora26. Sin embargo, no está claro si las condiciones de esporulación también influyen en el número de focos de germinosome observado.

Ramirez Peralta et al..' s resultados26 indica que las tasas de nutrientes germinación de las esporas en los niveles de población son influenciadas significativamente por los niveles de germinación las proteínas y GerD. Si la intensidad fluorescente integrada por la espora de los reporteros fluorescentes son directamente proporcionales a los niveles de proteínas de fusión de GerD y GerKB, los niveles de ambas proteínas de fusión diferencian extensamente en esporas de KGB80, que está de acuerdo con trabajos anteriores 7. esta heterogeneidad del nivel de proteína se pudo relacionar a la heterogeneidad de la germinación de esporas observada en el nivel de esporas individuales y germinosome número de focos podría ser otro factor que contribuye a la heterogeneidad de la germinación de esporas. Otros experimentos centrarán en un análisis del posible efecto de ese número de focos de germinosome y composición focos germinación (germinosomes no todos pueden ser iguales en composición germinación) podría tener en la heterogeneidad de la germinación. Los datos dieron lugar a una serie de preguntas de investigación actuales incluyendo: i) Cuál es el papel de GerD en el agrupamiento de los recursos genéticos en el IM; y ii) ¿Cómo son los dos otros GRs, GerA y GerB, organizado en la espora IM?

El protocolo presentado para las muestras de la espora oscura y brillante, es posible visualizar estructuras discretas sub en la misma espora por microscopia de la SIM. Los puntos brillantes de FM4-64 que se observaron en las esporas podrían ser debido a la gran plegamiento de la IM27. Como alternativa, presumimos que estas regiones son las áreas de la IM donde el tinte podría más fácilmente acceder a debido a la creciente fluidez IM local. Tales regiones de mayor fluidez (RIFs) puede ser organizado por el homólogo del citoesqueleto actina MreB, conocida por su concentración de líquido corta acil cadena lípidos28,29. Perceptiblemente, aplicando el mismo procedimiento al salvaje-tipo B. subtilis esporas también conduce a un similar patrón de manchas de FM4-64 (nuestras observaciones no publicadas). En células vegetativas de B. subtilis , un potencial de membrana colapsada resulta en la agrupación de MreB y RIFs29. La membrana interna de las esporas latentes probablemente tiene una relativa baja membrana potencial20,21 y contiene niveles detectables de MreB30 que podría conducir a la agrupación de RIFs en dominios más grandes de la alta fluidez29 . Si tales dominios podrían coincidir con la presencia de germinosomes está actualmente bajo investigación.

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Disclosures

No hay conflicto de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Christiaan Zeelenberg por su ayuda durante la proyección de imagen de la SIM. JW reconoce al Consejo de becas de China para una beca predoctoral y gracias Irene Stellingwerf por su ayuda durante la etapa primaria de la proyección de imagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

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References

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