Summary
Новые, иммуноспотенцом совместимые методы очистки тканей, как конечная 3D-изображения растворителя очищенных органов позволяют 3D визуализации бешенства вирус инфекции головного мозга и его сложной клеточной среды. Толстые, антитела помечены ломтиками ткани мозга сделаны оптически прозрачными для увеличения глубины изображения и для включения 3D-анализа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Abstract
Визуализация инфекционных процессов в тканях и органах с помощью иммуномаркировки является ключевым методом в современной инфекционной биологии. Способность наблюдать и изучать распределение, тропизм и обилие патогенных микроорганизмов внутри тканей органов дает ключевые данные о развитии и прогрессировании болезней. Используя обычные методы микроскопии, иммуномаркировка в основном ограничивается тонкими секциями, полученными из парафина или замороженных образцов. Однако ограниченная плоскость 2D-изображений этих тонких секций может привести к потере важной информации о сложной структуре инфицированного органа и клеточном контексте инфекции. Современные многоцветные, иммуносно-совместимые методы очистки тканей теперь обеспечивают относительно быстрый и недорогой способ изучения высокообъемных 3D-изображений стеков зараженной вирусом ткани органов. Подвергая ткани органических растворителей, она становится оптически прозрачной. Это соответствует рефракционным индексам образца и в конечном итоге приводит к значительному сокращению рассеяния света. Таким образом, в сочетании с длинными свободными целями рабочего расстояния, большие секции ткани размером до 1 мм могут быть изображены обычными конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM) с высоким разрешением. Здесь мы описываем протокол для нанесения визуализации глубоких тканей после очистки тканей для визуализации распространения вируса бешенства в инфицированных мозгах для изучения таких тем, как вирусный патогенез, распространение, тропизм и нейровторжение.
Introduction
Обычные методы гистологии в основном опираются на тонкие участки тканей органов, которые могут по своей сути обеспечить только 2D-понимание сложной 3D-среды. Хотя это возможно в принципе, 3D-реконструкция из серийных тонких секций требует требовательных технических трубопроводов как для нарезки, так и для последующего выравнивания силико приобретенных изображений1. Кроме того, бесшовная реконструкция z-томов после нарезки микротомов имеет решающее значение, так как механические и вычислительные артефакты могут оставаться из-за неоптимальной регистрации изображений, вызванной неоверплавлением плоскостей изображения, вариациями окрашивания и физическими разрушение тканей, например, лезвием микротома. В отличие от этого, чистая оптическая нарезка нетронутых образцов толстой ткани позволяет приобрести перекрывающиеся плоскости изображения (перевыборка) и, таким образом, облегчает 3D-реконструкцию. Это, в свою очередь, очень полезно для анализа инфекционных процессов в сложных популяциях клеток (например, нейронных сетей в контексте окружающих глиальных и иммунных клеток). Однако, присущие препятствия толстых секций ткани включают рассеяние света и ограниченное проникновение антител в ткани. В последние годы, различные методы были разработаныи оптимизированы для преодоления этих вопросов 2,3,4,5,6,8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13. По существу, целевые ткани становятся оптическипрозрачными при лечении либо с aqueous 2,3,4,6,7 ,8,9 или органических растворителей на основе10,11,12,13 решений. Внедрение 3DISCO (3D-изображения органов, очищенных от растворителя)11,12 и его преемника uDISCO (конечная 3D-изображение органов, очищенных от растворителя)13 обеспечило относительно быстрый, простой и недорогой инструмент с отличные возможности очистки. Основными компонентами клирингового протокола являются органические растворители терт-бутанол (TBA), бензиловый спирт (BA), бензил бензоат (BB) и дифениловый эфир (DPE). Разработка и добавление iDISCO (иммуномаркировка с поддержкой 3D-изображения органов, очищенных от растворителя)14, совместимого протокола иммуносохранения, стало еще одним преимуществом перед существующими методами и позволило провести маркировку антигенов в глубоких тканях интерес, а также длительное хранение иммунозапятнанных образцов. Таким образом, сочетание iDISCO14 и uDISCO13 позволяет с высоким разрешением изображения антител помечены белки в больших разделах тканей (до 1 мм) с использованием обычных CLSM.
Сохранение сложной структуры органа во всех трех измерениях особенно важно для тканей мозга. Нейроны составляют очень разнородную клеточную субпопуляцию с очень разнообразными 3D морфологиями на основе их невритовых проекций (рассмотрено Masland15). Кроме того, мозг состоит из ряда отсеков и подотсеков, каждый из которых состоит из различных клеточных субпопуляций и их соотношений, включая глиальные клетки и нейроны (обзор фон Бартхолд и др.16). Как нейротропный вирус, вирус бешенства (RABV, рассмотренный Fooks et al.17)в первую очередь заражает нейроны, используя свой транспортный механизм для передвижения в ретроградном направлении вдоль аксонов от основного места инфекции до центральной нервной системы (ЦНС). Описанный здесь протокол(рисунок 1А) позволяет иммуноспотеченно-помощь обнаружения и визуализации RABV и RABV-инфицированных клеток в больших, согласованных стеков изображений, полученных из инфицированных тканей мозга. Это позволяет объективно, 3D высокого разрешения оценки инфекционной среды. Это применимо к ткани мозга из различных видов, может быть выполнена сразу после фиксации или после длительного хранения образцов в параформальдегиде (PFA), и позволяет хранения и повторного изображения окрашенных и очищенных образцов в течение нескольких месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RABV-инфицированных, PFA фиксированной архивных мозга материал был использован. Соответствующие экспериментальные исследования на животных были оценены ответственным комитетом по уходу за животными, использованию и этике Государственного управления по сельскому хозяйству, безопасности пищевых продуктов и рыболовству в Мекленбурге-Передней Померании (LALFF M-V) и получили одобрение с разрешения 7221.3-2.1-002/11 (мыши) и 7221.3-1-068/16 (хоррет). Общий уход и методы, используемые в экспериментах на животных, осуществлялись в соответствии с утвержденными руководящими принципами.
ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует различные токсичные и / или вредные вещества, в том числе PFA, метанол (MeOH), перекись водорода (H2O2), азид натрия (NaN3), TBA, BA, BB, и DPE. MeOH и TBA легко воспламеняются. Избегайте воздействия, нося соответствующее индивидуальное защитное оборудование (лабораторное пальто, перчатки и защиту глаз) и проводя эксперименты в дымовом капюшоне. Сбор отходов отдельно в соответствующих контейнерах и утилизировать их в соответствии с местными правилами. Вирус бешенства классифицируется как уровень биобезопасности (BSL)-2 патогена и, следовательно, может, как правило, обрабатываются в условиях BSL-2. Некоторые виды деятельности, включая процедуры, которые могут генерировать аэрозоли, работать с высокой концентрацией вируса или работать с новыми лиссавирусами, могут потребовать классификации BSL-3. Предэкспозиционная профилактика рекомендуется персоналу высокого риска, в том числе зооработникам и лаборантам18,19. Обратитесь к местным органам власти.
1. Фиксация тканей головного мозга и секция
- Исправить образцы мозга в соответствующем объеме 4% ПФА в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS (pS 7.4) не менее 48 ч при 4 градусов по Цельсию (с приблизительным соотношением ткани к фиксативному 1:10 .v/v).
- Вымойте образцы тканей 3x в PBS, по крайней мере 30 минут каждый мыть и хранить их в 0,02% NaN3/PBS при 4 C до использования.
- Разделите ткань на 1 мм толщиной разделов с использованием вибратом (скорость подачи лезвия: 0,3-0,5 мм/с, амплитуда: 1 мм, толщина ломтика: 1000 мкм).
- Чтобы сохранить правильную последовательность срезов, храните каждый раздел ткани отдельно в колодце многофункциональной пластины культуры клеток. Добавьте 0.02% NaN3/PBS и храните секции ткани при 4 градусах Цельсия до использования.
2. Пробная предварительная обработка метанолом
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Перед лечением образца служит общая цель улучшения диффузии антител и снижения аутофлуоресценции тканей при воздействии meOH и H2O2, соответственно14.
- Подготовка 20% (v/v), 40%, 60%, и 80% MeOH решений в дистиллированной воде. Например, для 20% MeOH, добавить 10 мл 100% MeOH до 40 мл дистиллированной воды в соответствующем герметичном сосуде и перемешать путем инвертирования его.
- Передача образцов на сосуды разумного размера (например, реакционные трубки 5 мл). Позаботьтесь об использовании материалов, химически устойчивых к реагентам, используемым в данном протоколе. Например, обратите внимание, что в то время как полипропилен подходит, полистирол не является.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спецификации громкости в этом протоколе относятся к 5 мл реакционных труб. Если используется другое судно, отрегулируйте объемы соответствующим образом. - Инкубировать образцы в 4 мл каждой концентрации подготовленной серии растворов MeOH в порядке возрастания по 1 ч каждый.
- Инкубировать образцы 2x на 1 ч каждый в чистом (100%) MeOH.
- Охладите образцы до 4 градусов по Цельсию (например, в лабораторно-безопасном холодильнике).
- Подготовка отбеливания решение (5% H2O2 в MeOH) например, разбавления 30% H2O2 фондовый раствор на 1:6 в чистом (100%) MEOH, и охладить его при 4 градусах по Цельсию.
- Удалите 100% MeOH из рефрижераторных образцов и добавьте 4 мл прешилового отбеливания (5% H2O2 в MeOH). Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Обменять раствор отбеливания на 4 мл 80% MeOH и инкубировать на 1 ч. Продолжайте использовать подготовленную серию решений MeOH в порядке убывания по 1 ч каждый, пока образцы не будут инкубированы на 1 ч в 4 мл 20% MeOH.
- Вымойте образцы 1x на 1 ч с 4 мл PBS.
3. Иммуностогирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Чтобы предотвратить рост микробов, добавьте NaN3 к окончательной концентрации 0,02% к растворам в этом разделе. Образцы тканей дополнительно пронизаны путем лечения неионическими моющими средствами Triton X-100 и Tween 20. Нормальная сыворотка используется для блокирования неспецифических связывания антител. Глицин и гепарин добавляются для уменьшения иммуномаркировки фон14.
- Вымойте образцы 2x на 1 ч каждый в 4 мл 0,2% Тритон X-100/PBS.
- Пермяки образцы в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия с 4 мл 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M глицин/PBS.
- Блокируйте неспецифическую привязку антител путем инкубации образцов в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия в 4 мл 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% нормальной сыворотки/PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нормальную сыворотку от того же вида вторичное антитело было поднято в для достижения идеальных результатов блокирования. - Инкубировать образцы в 2 мл первичного раствора антитела (3% нормальной сыворотки /5% DMSO/PTwH (PBS-Tween 20 с гепарином) - первичные антитела/антитела) в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия. Освежите основной раствор антитела после 2,5 дней.
- Для PTwH, восстановить соль гепарина натрия в дистиллированной воде, чтобы сделать 10 мг / мл бульона раствор (храните это решение, aliquoted, при 4 градусах Цельсия). Добавьте штоковое раствор до 0,2% Tween 20/PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор правильного разбавления антител может потребовать оптимизации. Как правило, стандартные концентрации иммуногистохимии являются хорошей отправной точкой.
- Для PTwH, восстановить соль гепарина натрия в дистиллированной воде, чтобы сделать 10 мг / мл бульона раствор (храните это решение, aliquoted, при 4 градусах Цельсия). Добавьте штоковое раствор до 0,2% Tween 20/PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл.
- Вымойте образцы в течение 1 дня в 4 мл PTwH, обменивая буфер стирки по крайней мере 4x-5x в течение дня и оставляя окончательное мыть на ночь.
- Инкубировать образцы в 2 мл вторичного раствора антитела (3% нормального раствора сыворотки/PTwH - вторичные антитела/антитела) в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия. Освежите вторичный раствор антитела после 2,5 дней.
- Разбавить вторичные антитела/антитела при 1:500 во вторичном антителрастворе (т.е. 4 л в 2 мл).
- Вымойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставляя окончательную стирку на ночь.
4. Ядерное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Если не требуется ядерное окрашивание или частота волн/эмиссионная длина/выброс TO-PRO-3 требуется для возбуждения или обнаружения другого фторофра, пропустите этот шаг.
- Разбавить нуклеиловую кислоту пятно TO-PRO-3 на 1:1,000 в PTwH и инкубировать образцы в 4 мл ядерного раствора окрашивания для 5 ч.
- Вымойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставляя окончательную стирку на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: После смок, образцы могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия до оптической очистки.
5. Очистка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Образцы тканей обезвоживаются в градуированных рядах решений TBA. Как иммунопятнанирование требует вакавных решений, все процедуры окрашивания должны быть закончены до очистки тканей. Оптический клиренс и рефракционный индекс соответствия достигаются путем лечения со смесью BA, BB и DPE. Клиринговое решение дополняется DL-я-токоферолом в качестве антиоксиданта13.
- Подготовьте 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% и 96% TBA растворов в дистиллированной воде. Например, для 30% TBA, добавить 15 мл 100% TBA до 35 мл дистиллированной воды в соответствующем герметичном сосуде и перемешать путем инвертирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: TBA имеет точку плавления 25-26 градусов по Цельсию; таким образом, он имеет тенденцию быть твердым при комнатной температуре. Для того, чтобы подготовить решения TBA, нагрейте хорошо запечатанную бутылку при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе или водяной бане. - Обезвоживать образцы с 4 мл каждой концентрации подготовленной серии растворов TBA в порядке возрастания по 2 ч каждый. Оставьте 96% TBA на ночь.
- Обезвоживать образцы дальше в чистом (100%) TBA на 2 ч.
- Подготовьте клиринговое решение BABB-D15.
ПРИМЕЧАНИЕ: BABB-D15 представляет собой комбинацию BA и BB (BABB), которая смешивается с DPE в соотношении x:1, где x указан в названии решения, в данном случае 15.- Для BABB, смешать одну часть BA с двумя частями BB.
- Смешайте BABB и DPE в соотношении 15:1.
- Добавьте 0,4 vol% DL-я-токофероль (витамин Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 20 мл BABB-D15, смешать 6,25 мл BA с 12,5 мл BB. Добавьте 1,25 мл DPE и дополните его 0,08 мл DL-я-токоферола.
- Очистите образцы в клиринговом растворе до оптических прозрачных (2–6 ч).
- Образцы могут храниться при 4 градусах Цельсия в BABB-D15, защищены от света, до монтажа и изображения.
6. Выборка монтажа
- С помощью 3D-принтера распечатайте камеру изображения и крышку (материал: кополистер ,CPE, сопло: 0,25 мм, высота слоя: 0,06 мм, толщина стен: 0,88 мм, количество стен: 4, заполнение: 100%, нет опорной структуры; соответствующая . Файл STL можно найти в дополнительных материалах этого протокола).
- Соберите камеру изображения(рисунок 2).
- Установите круглую крышку (диаметр: 30 мм) на камеру изображения с RTV-1 (однокомпонентная комнатно-температурно-вулканизирующая) силиконовая резина. Удалите избыток силиконовой резины с водой смоченной ватным тампоном и вылечить на ночь.
- Установите круглую крышку (диаметр: 22 мм) на крышку с силиконовой резиной РТВ-1. Удалите избыток силиконовой резины с водой смоченной ватным тампоном и вылечить на ночь.
- Поместите образец в камеру изображения, добавьте небольшой объем BABB-D15 и вставьте крышку. Заполните камеру с BABB-D15 через впуск, используя подкожную иглу (27 G х 3/4 дюйма (0,40 мм х 20 мм).
- Подключите входе и запечатать камеру изображения с RTV-1 силиконовой резины. Лечить ночь в темноте.
7. Визуализация и обработка изображений
- Настройка приобретения изображения, выбрав соответствующие лазерные линии в соответствии с фторфорами, используемыми. Отрегулируйте диапазоны обнаружения каждого детектора, чтобы предотвратить перекрытие сигнала между каналами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцовые диапазоны обнаружения для Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 и TO-PRO-3 500-550 нм, 590-620 нм и 645-700 нм соответственно. - Выберите параметры приобретения, определите верхнюю и нижнюю границу z-стека и приобретите стек изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцовые параметры приобретения являются последовательным сканированием с размером пикселя 60-90 нм, размером с 0,5 мкм, средней линией 1, скоростью сканирования 400 Гц и размером пинхола 1 единицы Airy. - Обработайте стек изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (например, Фиджи) для создания 3D-проекций или проведения углубленного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого размера приобретенных файлов изображений, использование рабочей станции, как правило, необходимо.- Откройте файл приобретения или изображения (ы) на Фиджи(Файл Открыто (ru) Выберите файлы).
- При использовании, например, . Файлы LIF, выберите или отбрасывайте нужные параметры в окне диалога Bio-Formats. Просмотр стека с Hyperstack. Помимо этого, никаких конкретных выделений или клещей не требуется. Пресс OK.
- Если файл содержит несколько стеков изображений, выберите те, которые должны быть проанализированы и подтверждены нажатием OK.
- Выполните коррекцию отбеливателя путем разделения объединенного изображения на отдельные каналы (Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее Сплит каналы). Для каждого канала выберите коррекцию отбеливателя (изображение Отрегулируйте (англ.) Коррекция отбеливателя) и выбрать простое соотношение (интенсивность фона: 0,0).
ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, например, когда нет линейного распада сигнала или сигнал слишком слаб в целом, простое соотношение может потерпеть неудачу. Кроме того, попробуйте Экспоненциальный Fit или пропустить коррекции отбеливателя. - Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью ползунок (изображение Отрегулируйте (англ.) Яркость Контраст).
- Слияние каналов(Изображение Цветовая гамма Слияние каналов), сделать композитный (Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее СделатьКомпозитный ), и преобразовать его в форматЕ RGB(Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее Преобразование в RGB).
- При необходимости избавь сяризуйте стек изображения, чтобы уменьшить время вычисления и размер файла (изображение ) Отрегулируйте (англ.) Размер,оба варианта галочкой плюс билинейнерной интерполяции).
- Создание 3D-проекции (Изображение) Стеки 3D проект). Выберите Brightest Point в качестве метода проекции и установите интервал среза в соответствии с размером z-шага приобретенного стека изображений. Для максимального качества установите приращение угла вращения до 1 и включите интерполяцию. Изменение общей ротации, порогов прозрачности и непрозрачности по мере необходимости.
- При необходимости отспособьте контрастность и яркость, преобразовав 3D-проекцию обратно в 8-битный формат (изображение Тип (тип) 8-битный). Используйте соответствующие ползунки (изображение) Отрегулируйте (англ.) Яркость Контрастность) и переформатировать стек изображения в формат RGB, описанный в шаге 7.3.4.
- Сохранить 3D-проекцию как . Файл TIF (формат файла изображения) и . Файл AVI (формат видеофайла).
- Откройте файл приобретения или изображения (ы) на Фиджи(Файл Открыто (ru) Выберите файлы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сочетание iDISCO14 и uDISCO13 в сочетании с CLSM с высоким разрешением дает глубокое понимание пространственно-временного разрешения и пластичности rabV инфекции мозговой ткани и окружающего клеточного контекста.
Использование иммуностоинга фосфопротеина RABV (P), сложные слои инфицированных нейрональных клеток могут быть визуализированы в толстых участках мозга мыши(рисунок 3). Впоследствии можно реконструировать бесшовные 3D-проекции приобретенных стеков изображений(рисунок 3А,Б, правая панель; Анимированная фигура 1). Необходимо принимать меры по уходу при использовании первичных антител и вторичных антител против видов, из которые берет свое начало органный материал. Использование антимыковых антител IgG на ткани мозга мыши привело к четкому окрашиванию сосудистой системы(рисунок 3B,левая панель). Из-за высокого разрешения изображения стеки приобретаются с, инфекция может быть оценена до одноклеточного уровня(рисунок 4), что позволяет утверждения, например, обилие и распределение антигена в клетке (Рисунок 4C ).
Помимо ткани мозга мыши, протокол также может быть применен к ткани мозга других видов животных (например, хорьков) (Рисунок5; Анимированная фигура 2). Разделы взяты из различных отсеков инфицированного мозга хорька показали различную степень инфекции RABV(Рисунок 5A-D).
Поскольку мозг состоит из множества различных клеточных субпопуляций, дифференциация между этими популяциями имеет жизненно важное значение. Использование антител, направленных против клеточных маркеров, оценка клеточной идентичности инфицированных и соседних клеток возможно. Например, астроциты могут быть дифференцированы через выражение глиального фибриллечного кислотного белка (GFAP)(Рисунок 6A,C; Анимированная рисунок 3), в то время как невриты могут быть специально окрашены для микротрубо-ассоциированного белка 2 (MAP2) (Рисунок6B,D; Анимированная фигура 4). Одновременно, вирусные белки, в этом случае, NUcleoprotein RABV (N), могут быть costained для оценки связи между инфицированными клетками и подчеркнул клеточной субпопуляции.
Рисунок 1 : Основной принцип и рабочий процесс протокола. (A) Графическое представление рабочего процесса на основе протоколов Renier et al.14 и Pan et al.13. (B) Два образцовых ломтика мозга хорета, один до (левая панель) и один после лечения с органическими растворителями (правая панель). Очистка превращает ткань оптически прозрачной, как наблюдаемый затем читаемым текстом. Очищенный мозг встроен в 3D-печатную камеру изображений (правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Техническая иллюстрация 3D-печатной камеры изображения. (A) Взорванный рисунок представления камеры изображения. Линии с точками подчеркивают компоненты, которые должны быть установлены друг на друга с помощью силиконовой резины RTV-1. Разбитые линии представляют собой инструкции для последующего собрания камеры. (B) CAD (компьютерный дизайн) файл камеры изображения. Соответствующий . ФАЙЛ STL для печати камеры изображения можно найти в дополнительных материалах. (C) Полностью собранная камера изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Глубоко-тканевая визуализация rabV-инфицированной ткани мозга мыши. (A и B) Мыши были инфицированы рекомбинантным вульпиновым уличным вирусом. RABV P окрашивания (зеленый) показывает инфицированных нейронных слоев с большими, запутанные невритовых проекций внутри очищенной ткани мозга. Ядра были противопоставлены TO-PRO-3 (синий). (B) Использование фторофора помечены анти-мышь IgG вторичных антител (красный) на ткани мыши приводит к четкой маркировки сосудистой системы. 3D-реконструкция приобретенных стеков изображений позволяет осуществлять наблюдение под разными углами обзора (A и B,правые панели). Шкала баров 60 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : приобретение изображений с высоким разрешением позволяет проводить комплексные оценки до одноклеточного уровня. Мозг был рассечен с зараженной САД L16 мыши. (A) RABV P окрашивания (зеленый) подчеркивает индивидуально инфицированных нейронов. (B и C) Детальные изображения и проекции показывают, что можно проводить углубленный анализ изобилия, распределения и локализации антигенов. Ядра были противопоставлены TO-PRO-3 (синий). Шкала баров 20 мкм (A, 5 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Глубоко-тканевая визуализация ткани мозга головного мозга, инфицированной RABV. Хорьки были заражены собачьей улицей RABV. (A-D) Были взяты фрагменты из определенных участков мозга, иммунозапятнаны для RABV P (зеленый) и оптически очищены. Прогнозы показывают, что инфицированные клетки в различных частях мозга различаются по количеству и морфологии. Кроме того, они подчеркивают применимость протокола к тканям, не полученным из мыши. Ядра были противопоставлены TO-PRO-3 (синий). Шкала баров 60 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Многоцветная иммунофлуоресценция позволяет утилистить клеточные маркеры. Мозг ткани ломтики хорьков, инфицированных собачьей улице RABV были использованы и coimmunostained для RABV N (красный) и либо (A и C) GFAP (зеленый) или (B и D) MAP2 (зеленый). В то время как GFAP является маркером астроцитов, MAP2 специально выделяет невриты. Ядра были противопоставлены TO-PRO-3 (синий). (C и D) В нижней части изображены односеточное извлечение изведанных видов деталей из объединенных проекций. Шкала баров No 15 мкм (A и B) 10 мкм (C и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Анимированный рисунок 1: 3D-реконструкции и подробные проекции стеков изображений из RABV-инфицированных мозгов мыши. Проекции были получены из стеков изображений, описанных на рисунке 3. (A и C) Анимация всего соответствующего z-стеков. (B) Подробная проекция 3D-реконструкции части z-стек областей, выделенных в начале видео. (D) Подробная проекция томограммы части z-стек областей, выделенных в начале видео. Зеленый цвет и RABV P; красный й мышь IgG; синие и ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Анимированная фигура 2: 3D-реконструкция стеков изображений, полученных из rabV-инфицированного мозга хорька. Проекции были получены из стеков изображений, описанных на рисунке 5. (A-D) Аннотации относятся к той же цифре и описывают соответствующие области мозга, из которых были взяты срезы. Зеленый цвет и RABV P; синие и ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Анимированная рисунок 3: Постепенная проекция различных каналов 3D-реконструкции RABV-инфицированного мозга хорька, запятнанном астроцитным маркером GFAP. Прогнозы были получены из стека изображений, описанного на рисунке 6A. Постепенное добавление каналов начинается с RABV N (красный), после чего следуют ядра клетки (синий) и, наконец, GFAP (зеленый), в то время как вычитание сначала удаляет RABV N, затем ядра клетки, и в конечном итоге GFAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Анимированная рисунок 4: Постепенная проекция различных каналов 3D-реконструкции RABV-инфицированного мозга хорька, запятнанном нейрональным маркером MAP2. Прогнозы были получены из стека изображений, описанного на рисунке 6B. Постепенное добавление каналов начинается с RABV N (красный), после чего следуют ядра клетки (синий) и, наконец, MAP2 (зеленый), в то время как вычитание сначала удаляет RABV N, затем ядра клетки, и в конечном итоге MAP2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возрождение и дальнейшее развитие методов очистки тканей в последние годы2,3,4,5,6,7, 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 открыли много новых возможностей для получения больших объемных изображений стеки ткани органа. Это обеспечило беспрецедентный и мощный инструмент для изучения, среди многих других тем, вирусной инфекции. Последующая 3D-реконструкция этих стеков изображений позволяет делать сложные утверждения о, например, вирусном тропизме, изобилии и временном ходе инфекции. Этот протокол описывает иммуномаркировку с помощью визуализации инфекции RABV в ткани мозга, очищенной от растворителя.
Есть несколько критических шагов в подготовке и приобретении изображения стеки иммуномаркировки, растворителя очищенной ткани. Длительное воздействие ПФА может маскировать эпитопы и, таким образом, приводит к снижению антигенности20,21,22. Поэтому важно ограничить время фиксации необходимым минимумом и перевести образцы на соответствующее решение (например, PBS, дополненный 0,02% NaN3 для длительного хранения). Тем не менее, все репрезентативные изображения и проекции, представленные здесь, были получены из архивных образцов мозга, некоторые из которых хранились в ПФА в течение нескольких недель, подчеркивая применимость метода к органному материалу, который был подвержен ПФА для длительные периоды времени. Аналогичные результаты были показаны для образцов человеческого мозга13. Другим, если не самым важным шагом является инкубация антител. Концентрации антител должны быть выбраны тщательно. Хотя в большинстве случаев стандартные концентрации IHC являются хорошей отправной точкой для маркировки антител глубокой ткани, некоторые антигены могут потребовать дополнительной оптимизации концентрации антител. Этот протокол показывает, что rabV N и P легко обнаруживаются использованными антителами. Хотя MeOH предварительного лечения обычно улучшает иммуномаркировки, некоторые антигены несовместимы с этим лечением. Для тех, Ренье и коллеги14 при условии, альтернативные MeOH-бесплатный образец предварительной обработки. Анализ приобретенных стеков изображений требует адекватной вычислительной мощности. Из-за больших размеров файлов до нескольких гигабайт на стек, мощные компьютеры необходимы для обработки изображений. Постобработка часто включает в себя вычитание фонового шума и коррекции отбеливателя, чтобы компенсировать эффекты отбеливания, связанные с приобретением. При измерении расстояний, следует иметь в виду, что, как побочный эффект, ткани сокращается во время процесса очистки.
По сравнению с другими платформами микроскопии, такими как флуоресценция светового листа (LSFM) или двухфотонное лазерное сканирование микроскопии (2PLSM), CLSM имеет наиболее ограниченное рабочее расстояние. Поэтому для визуализации необходимо предварительно нарезать органы толщиной до 1 мм. Кроме того, CLSM имеет самую низкую скорость приобретения из-за его высокого разрешения изображения. Использование легкого листового микроскопа позволит быстрее изображения больших объемов до всего мозга изображения, в то же время жертвуя разрешением изображения. Другим ограничением является присущее увеличение аутофлуоресценции тканей с уменьшением длины волны. Это делает использование флюорофоров и красителей возбужденных лазерной линии на 405 нм, в том числе Hoechst красителей, непрактично невозможно.
Что касается других методов очистки тканей, гибрид iDISCO14 и uDISCO13 сочетает в себе самые положительные атрибуты: он очень совместим с иммуностоингом, высоко универсален, сравнительно быстр и недорог отличные возможности очистки, и это возможно со стандартным конфопальный микроскоп. Кроме того, этот протокол не ограничивается иммуностоингом и очисткой тканей мозга, но также может быть применен к целому ряду других мягких тканей и патогенов, как нейроинвазивных, так и ненейроинвазии. В заключение, описанный здесь протокол представляет собой конвейер для 3D-изображения RABV-инфицированной ткани мозга. 3D-реконструкции инфицированной ткани мозга могут быть использованы для ответа на различные вопросы, касающиеся прогрессирования болезни RABV, патогенеза и нейровторжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Томаса Меттенлейтера и Верену те Камп за критические прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Федеральной инициативой передового опыта Мекленбурга Западной Померании и Европейским социальным фондом (ESF) Грантом Коинфектом (ESF/14-BM-A55-0002/16) и интрамуральным грантом на совместные исследования лиссавирусов на Институт Фридриха-Леффлера (Ri-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
