Summary
هنا، نقدم طريقة لتسجيل تقلصات العضلات الجنينية في أجنة دروسوفيلا بطريقة غير الغازية والموجهة نحو التفاصيل.
Abstract
تقلصات العضلات المنسقة هي شكل من أشكال السلوك الإيقاعي ينظر في وقت مبكر أثناء التنمية في أجنة دروسوفيلا. مطلوب دوائر التغذية المرتدة الحسية العصبية للسيطرة على هذا السلوك. الفشل في إنتاج النمط الإيقاعي من تقلصات يمكن أن يكون مؤشرا على تشوهات عصبية. وجدنا سابقا أن العيوب في البروتين O-mannosylation، تعديل البروتين ما بعد الترجمة، تؤثر على مورفولوجيا محور الخلايا العصبية الحسية وتؤدي إلى تقلصات العضلات المنسقة غير طبيعية في الأجنة. هنا، نقدم طريقة بسيطة نسبيا لتسجيل وتحليل نمط تقلصات العضلات التمعجية عن طريق التصوير الحي للأجنة المرحلة المتأخرة حتى نقطة الفقس، والتي كنا تميز النمط الظاهري للتقلص العضلي للبروتين مسوخ المنوسيلترانساز ويمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التسجيلات لتحليل موجات تقلص العضلات، بما في ذلك التردد، واتجاه الانتشار والسعة النسبية لتقلصات العضلات في أجزاء الجسم المختلفة. كما قمنا بفحص وضع الجسم واستفادتنا من علامة الفلورسنت التي تم التعبير عنها على وجه التحديد في العضلات لتحديد بدقة موقف خط الوسط الجنيني. ويمكن أيضا استخدام نهج مماثل لدراسة مختلف السلوكيات الأخرى أثناء النمو، مثل المتداول الجنين والفقس.
Introduction
تقلص العضلات التمعجي هو سلوك حركي إيقاعي مشابه للمشي والسباحة في البشر1و2و3. إن تقلصات العضلات الجنينية التي شوهدت في أجنة دروسوفيلا في مرحلة متأخرة تمثل مثالاً على مثل هذا السلوك. Drosophila هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة مختلف العمليات التنموية لأن النمو الجنيني في دروسوفيلا يتميز بشكل جيد، قصيرة نسبيا، وسهلة الرصد. الهدف العام لأسلوبنا هو تسجيل وتحليل نمط الموجي من الانكماش والاسترخاء من العضلات الجنينية بعناية. استخدمنا نهجا ً بسيطاً وغير غازي يقدم تصوراً مفصلاً وتسجيلاً وتحليلاً لتقلصات العضلات. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة عمليات أخرى في الجسم الحي، مثل المتداول الجنيني ينظر في الأجنة في مرحلة متأخرة فقط قبل الفقس. في الدراسات السابقة، تم تحليل تقلصات العضلات الجنينية في الغالب من حيث التردد والاتجاه1،2. من أجل تقدير المدى النسبي للتقلصات لأنها تتقدم على طول محور الجسم في الاتجاه الأمامي أو الخلفي، استخدمنا الأجنة التي تعبر عن GFP على وجه التحديد في العضلات. يوفر هذا التحليل طريقة كمية أكثر لتحليل تقلصات العضلات والكشف عن كيفية الحفاظ على وضع الجسم في الأجنة خلال سلسلة من الموجات التمعجية من تقلصات العضلات.
يتم التحكم في تقلصات العضلات التمعجية بواسطة الدوائر مولد نمط مركزي (CPG) والاتصالات بين الخلايا العصبية للجهاز العصبي المحيطي (PNS)، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، والعضلات4،5. الفشل في إنتاج تقلصات العضلات التمعجية الطبيعية يمكن أن يؤدي إلى عيوب مثل الفشل في فقس2 وحركة اليرقات غير طبيعية6 ويمكن أن يكون مؤشرا على تشوهات عصبية. التصوير الحي للموجات التمعجية من تقلص العضلات والتحليل المفصل للأنماط الظاهرية الانكماش يمكن أن تساعد في الكشف عن الآليات المسببة للأمراض المرتبطة بالعيوب الوراثية التي تؤثر على العضلات والدوائر العصبية المشاركة في الحركة. استخدمنا مؤخرا هذا النهج للتحقيق في الآليات التي تؤدي إلى وضع الجسم التواء النمط الظاهري من Protein O-mannosyltransferase (POMT) المسوخ7.
البروتين O-mannosylation (POM) هو نوع خاص من تعديل ما بعد الترجمة، حيث يتم إضافة السكر مانوز إلى بقايا سيرين أو ثروينين من البروتينات المسار إفرازي8،9. العيوب الوراثية في POM تسبب خلل العضلات الخلقية (CMD) في البشر10،11،12. لقد بحثنا في الآليات المسببة لهذه الأمراض باستخدام دروسوفيلا كنظام نموذجي. وجدنا أن الأجنة مع الطفرات في بروتين دروسوفيلا O-mannosyltransferase الجينات POMT1 وPOMT2 (المعروف أيضا باسم البطن المتناوب (RT) والملتوية (TW)) تظهر الإزاحة ("دوران") من أجزاء الجسم، مما يؤدي إلى وضع الجسم غير طبيعي7. ومن المثير للاهتمام، تزامن هذا العيب مع مرحلة النمو عندما تصبح تقلصات العضلات التمعجية بارزة7.
منذ وضع الجسم غير طبيعي في الأجنة متحولة POM تنشأ عندما يتم تشكيل العضلات والبشرة بالفعل وبدأت موجات التمعجية من تقلصات العضلات المنسقة، افترضنا أن وضع الجسم غير طبيعي يمكن أن يكون نتيجة لعضلة غير طبيعية تقلصات بدلا من عيب في العضلات و / ومورفولوجيا البشرة7. CMDs يمكن أن ترتبط مع تقلصات العضلات غير طبيعية وعيوب الموقف13، وبالتالي فإن تحليل النمط الظاهري الموقف في مسوخ Drosophila POMT قد توضح الآليات المرضية المرتبطة بخلل العضلات . من أجل التحقيق في العلاقة بين النمط الظاهري موقف الجسم من المسوخ Drosophila POMT والتشوهات المحتملة في موجات التمعجيمن من تقلصات العضلات، قررنا تحليل تقلصات العضلات بالتفصيل باستخدام العيش نهج التصوير.
كشف تحليلنا لموجات الانكماش التمعجي في أجنة دروسوفيلا عن وضعين منفصلين للإنقباض، تم تعيينهما كموجات من النوع 1 والنوع 2. موجات النوع 1 هي موجات بسيطة تُنشر من الأمامي إلى الخلفي أو العكس بالعكس. موجات من النوع 2 هي موجات biphasic التي تبدأ في الطرف الأمامي، تنتشر في منتصف الطريق في الاتجاه الخلفي، ووقف لحظة، وتشكيل انكماش ثابت زمني، وبعد ذلك، خلال المرحلة الثانية، اجتاحت من قبل تقلص التمعجي الذي ينتشر إلى الأمام من النهاية الخلفية. تولد الأجنة البرية عادة سلسلة من الانقباضات التي تتكون من حوالي 75٪ من النوع 1 و 25٪ من النوع 2 موجات. وعلى النقيض من ذلك، تولد الأجنة المتحولة من نوع POMT موجات من النوع 1 والنوع 2 بترددات نسبية متساوية تقريباً.
نهجنا يمكن أن توفر معلومات مفصلة للتحليلالكمي لتقلصات العضلات والجنين المتداول 7. ويمكن أيضا تكييف هذا النهج لتحليل السلوكيات الأخرى التي تنطوي على تقلصات العضلات, مثل الفقس والزحف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- الإعداد
- إعداد قفص ذبابة عن طريق جعل ما يقرب من 50 ثقوب في قدرة 100 مل ثلاثة الزاوية الكأس البلاستيكية باستخدام إبرة 25 G الساخنة (انظر جدولالمواد).
- إعداد 60 مم × 15 ملم أطباق بيتري مع عصير التفاح أجار (3٪ أجار و 30٪ عصير التفاح).
- إعداد معجون الخميرة الطازجة عن طريق خلط حبيبات الخميرة الجافة والماء. نشر عجينة الخميرة على لوحات أجار التفاح لزيادة وضع البيض.
- التخدير حوالي 50-60 الذباب (استخدام أعداد متساوية تقريبا من الذكور والإناث) على CO2 ووضعها في قفص ذبابة.
ملاحظة: استخدام نسبة متزايدة من الإناث (تصل إلى ~ 2:1 نسبة الإناث: الذكور) قد يساعد على زيادة كمية البيض وضعت لبعض الأنماط الجينية. - إرفاق عصير التفاح أجار طبق بيتري مع معجون الخميرة إلى قفص ذبابة بإحكام وختم ه مع الطين النمذجة. تأكد من أنها مختومة في جميع الزوايا.
- انتظر حتى يستيقظ الذباب من التخدير ثم عكس القفص بحيث طبق بيتري هو الآن في الجزء السفلي. وضع القفص في حاضنة مع درجة حرارة تسيطر عليها (25 درجة مئوية) والرطوبة (60٪).
- السماح للذباب لوضع البيض لمدة 2-3 ح، واستبدال لوحة التفاح مع واحدة جديدة، والسماح لللوحة مع عمر البيض لمدة 19-20 ساعة في حاضنة.
ملاحظة: قبل الخطوة المذكورة أعلاه، يجب مزامنة الذباب لتسهيل جمع الأجنة المرحلة 17e-f (19-21 h AEL). ويمكن تحقيق ذلك عن طريق نقل الذباب إلى قفص مع الخميرة الطازجة التفاح عصير أجار لوحة 3-4 مرات لمدة 12 ساعة (مرة واحدة كل 3-4 ح). الحفاظ على الذباب في بيئة الضوء circadian تسيطر (دورة LD) يمكن أن تساعد أيضا في جمع مجموعة متزامنة من الأجنة، ولكن هذا لم يكن أساسيا في تجاربنا.
2- جمع الأجنة
- اختيار الأجنة بعناية مع فرشاة الطلاء الرطب ووضعها في طبق زجاجي جمع مليئة PBS 1X.
- حدد الأجنة التي تحتوي على القصبة الهوائية مليئة بالهواء. تشير القصبة الهوائية المملوءة بالهواء إلى أن الأجنة قد وصلت إلى المرحلة 17، وكان ينبغي أن تبدأ تقلصات العضلات التمعجية. تصبح القصبة الهوائية واضحة للعيان عندما تمتلئ بالهواء، والتي يمكن أن تكون بمثابة علامة للمرحلة 17.
- ضع لوح أجار عصير التفاح على شريحة زجاجية ونقل الأجنة بعناية من PBS إلى لوح. يصطف الأجنة مع جانبها البطني.
ملاحظة: يمكن تمييز الجوانب الظهرية والبطنية للأجنة بوضع الزوائد الظهرية على قشر البيض. - جعل حد الشمع مستطيلة على شريحة زجاجية أخرى باستخدام قلم الشمع (انظر جدولالمواد).
- ضع شريط لاصق على الوجهين داخل تلك الحدود والتقط الأجنة بلطف عن طريق خفض هذه الشريحة على لوح أجار. تطبيق ضغط لطيف لضمان أن الأجنة التمسك الشريط بشكل جيد، مع الجانب الظهري حتى. إذا لزم الأمر، يمكن لف الأجنة على الشريط لتصحيح اتجاهها. القيام بجميع التلاعبات أثناء رصد الأجنة تحت المجهر تشريح.
- تغطية الأجنة مع 1X PBS للتصوير الحي لتقلصات العضلات.
ملاحظة: ترتبط بعض الإجراءات الموضحة أعلاه بتقنيات دروسوفيلا الأساسية المستخدمة في العديد من الدراسات. ويمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلا من تقنيات Drosophila المشتركة في مكان آخر14.
3- تسجيل الأجنة
- إجراء التصوير الحي للأجنة المركبة على مجهر دقيق مع وظيفة الفاصل الزمني وكاميرا رقمية مع مرشحات الانبعاثات المناسبة (انظر جدولالمواد) باستخدام عدسة موضوعية الغمر المياه 10X.
ملاحظة: هنا استخدمنا الأجنة التي تعبر عن GFP في العضلات. ويمكن أيضا استخدام علامات الفلورسنت الأخرى مع ضوء الإثارة مناسبة ومجموعات تصفية الانبعاثات (على سبيل المثال، للكشف عن tdTomato، يمكن للمرء استخدام مرشح كروما ET-561 مجموعة للإثارة والانبعاثات حول الأمثل 554 نانومتر و 581 نانومتر، على التوالي). - إجراء تسجيل فيديو مباشر للأجنة باستخدام برامج مناسبة (انظر جدولالمواد) لمدة 1-2 ساعة تقريبًا بمعدل اكتساب يبلغ 4 إطارات/إطارات.
ملاحظة: لتحليل المتداول من الجنين النامية داخل قوقعته، يمكن استخدام الأجنة دون التعبير عن علامات الفلورسنت. ولهذه الغاية، يتم تطبيق إضاءة الضوء العادية المنقولة دون مرشحات الطيفية لتصور حركة الجنين داخل القشرة (انظر الفيلم2).
4- تحليل التسجيلات
- تصدير الفيديو المسجل مباشرة إلى صورة J لمزيد من التحليلات (على سبيل المثال، كملفات AVI).
- في ImageJ، قم باقتصاص تسجيلات الفيديو إلى حجم الأجنة الفردية عن طريق رسم مربع حول كل جنين ثم النقر على Image > Crop. وهذا يقلل إلى حد كبير من حجم ملفات الفيديو دون التأثير على حلها ويسهل تحليلها.
- تدوير الصور المقطوعة لتحقيق الموضع الرأسي للخط الأوسط الجنيني بالنسبة للشاشة، وذلك بالنقر على الصورة > تحويل > تدوير.
ملاحظة: سيؤدي تحديد المعاينة أثناء هذه العملية إلى توفير إرشادات للتدوير، مع إظهار خطوط الشبكة لضمان الموضع العمودي للخط الأوسط. - التحليل الكمي لدوار الأجنة :
ملاحظة: بالنسبة لتحليل المسافة، تأكد أولاً من أن الصور تتضمن معلومات المقياس. يمكن إضافة مقياس الصورة عن طريق تحديد تحليل > تعيين مقياس، ثم إدخال تحويل وحدات البكسل إلى مسافات، على سبيل المثال، الميكرومترات- وضع علامة على موقف واحد أو كليهما القصبة الهوائية في الإطار الأول من الفيديو في منتصف الطريق نقطة بين الخلفية والنهايات الأمامية. انقر على تحليل > أدوات > مدير عائد الاستثمار وتسجيل هذا الموقف كشريحة عدد y إحداثيات س عن طريق رسم مربع من حوالي 7 ميكرومتر من 7 ميكرومتر حوله وكتابة ر على لوحة المفاتيح. تأكد من أنه عند كتابة t، يتم تحديد منطقة اهتمام على الفيديو. بدلاً من ذلك، حدد علامة التبويب إضافة (t) في إدارة عائد الاستثمار لتسجيل موضع القصبة الهوائية بدلاً من كتابة الأمر.
ملاحظة: يمكن أن تختلف منطقة الاهتمام من حيث الشكل أو الحجم حسب المنطقة الجنينية أو الحدث التنموي الذي تجري دراسته. - وضع علامة على موقف نفس المنطقة من القصبة الهوائية بعد كل تقلص التمعجي. قياس المسافة من موقف ما قبل الانكماش إلى موقف ما بعد الانكماش عن طريق رسم خط يربط مراكز كل مربع وكتابة m على لوحة المفاتيح. تحويل المسافة إلى ميكروم باستخدام مقياس معروف من الصور. بدلاً من ذلك، قم بقياس المسافة في ميكروم في خطوة واحدة بالنقر على تحليل > تعيين مقياس وأدخل عامل التحويل المعروف من البكسل إلى ميكرون لإنتاج تقرير بالميكرون.
ملاحظة: يمكن إدخال مسافة بالبكسل مع المسافة المقابلة لها في ميكرومتر. - ربط المسافة والاتجاه لكل حدث المتداول مع اتجاه انتشار تقلص العضلات في ما لا يقل عن 8 أجنة للاختلافات الهامة إحصائيا.
- وضع علامة على موقف واحد أو كليهما القصبة الهوائية في الإطار الأول من الفيديو في منتصف الطريق نقطة بين الخلفية والنهايات الأمامية. انقر على تحليل > أدوات > مدير عائد الاستثمار وتسجيل هذا الموقف كشريحة عدد y إحداثيات س عن طريق رسم مربع من حوالي 7 ميكرومتر من 7 ميكرومتر حوله وكتابة ر على لوحة المفاتيح. تأكد من أنه عند كتابة t، يتم تحديد منطقة اهتمام على الفيديو. بدلاً من ذلك، حدد علامة التبويب إضافة (t) في إدارة عائد الاستثمار لتسجيل موضع القصبة الهوائية بدلاً من كتابة الأمر.
- التحليل الكمي لتقلصات العضلات الجنينية:
- استخدام الأجنة التي تعبر عن علامات الفلورسنت في العضلات (على سبيل المثال، استخدمنا الذباب المعدل وراثيا التعبير عن بناء الانصهار من Mيوسين Heavy Cهاين المروج وGFP دعا MHC-GFP5)لتحليل معلمات تقلص العضلات مثل تقلص السعة.
- استخدام تسجيل قراءة الفلورسنت ورسم منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال، مربع من 15 ميكرومتر إلى 45 ميكرومتر [HXW]) تتمحور حول العضلات (التي تظهر بوضوح بسبب وجود علامة الفلورسنت) من قطعة معينة من الجسم، وحدد علامة التبويب إضافة (ر) على ال ه مدير عائد الاستثمار لتسجيل موقف عائد الاستثمار. انقر على مدير عائد الاستثمار > قياس لتسجيل متوسط كثافة الفلورسنت لكل منطقة من المناطق ذات الأهمية المحددة لكل إطار من إطار الفيديو.
- نقل المربع إلى مراكز قطاعات الجسم الأخرى ذات الاهتمام وانقر على إضافة (ر) في مدير عائد الاستثمار لتسجيل مراكزهم. وهذا سيعطي المناطق ذات الأهمية ذات الحجم نفسه في جميع أجزاء الجسم لتحليلها. حدد على الأقل الخلفية، واحد الوسيط، وشريحة أمامية واحدة، على سبيل المثال، A7، A4، و T2، على التوالي.
- في مدير عائد الاستثمار، حدد جميع المناطق ذات الأهمية المسجلة كإحداثيات x لرقم الشريحة (على سبيل المثال، عن طريق التحديد أثناء الضغط على Ctrl)وانقر على المزيد > قياس متعدد لقياس متوسط الفلورسنت كثافة كل منطقة ذات أهمية لجميع إطارات الفيديو، والإبلاغ عن كل قياس في جدول. كل منطقة ذات أهمية هي عمود من الجدول، وكل إطار صف. نقل الجدول إلى برنامج جدول بيانات لمزيد من التحليلات.
- رسم رسم بياني مع رقم الإطار على محور س ومتوسط كثافة الفلورسنت على محور ص. يمكن تحويل رقم الإطار إلى وقت باستخدام معدل الإطار (4 إطارات/إطارات) للفيديو (الشكل1A).
- تحديد سعة تقلص العضلات عن طريق تقدير الزيادة في كثافة الفلورة GFP نسبة إلى خط الأساس. تقلصات العضلات زيادة كثافة GFP لأنها تجلب المزيد من GFP في محيط المنطقة المحورية كما يحصل على سحب المزيد من العضلات في خلال هذه الانقباضات (فيلم 1)7. إنشاء الفلورة خط الأساس كمتوسط كثافة بين موجات الانكماش. تطبيع كثافة GFP إلى خط الأساس عن طريق تقسيم كل قيمة كثافة عائد الاستثمار على كثافة خط الأساس.
ملاحظة: كل ملف شخصي له مستوى أساسي مختلف، حيث قد تكون هناك مستويات تعبير مختلفة في أجزاء العضلات المختلفة.
ملاحظة: أحد المضاعفات المحتملة هو أن الفلورة GFP قد تتغير مع مرور الوقت بسبب تبييض الصور. ويمكن حل ذلك عن طريق رصد التغيرات في خط الأساس للفلورة واستخدام حجم عينة كاف لتحليل الأمواج (نستخدم عادة مجموعات من 10 موجات فلورية ونؤكد أن خط الأساس ثابت تقريبا عن طريق أخذ متوسط تلك الذروة فقط المينيما كخط أساس التي انخفضت في الفلورة بنسبة 10٪ أو أقل بالنسبة للذروة مينيما الأولية). ويمكن أيضا تطبيق إضاءة النبض LED للتخفيف من هذه المشكلة16. - قارن تقلصات العضلات على الجانبين الأيسر والأيمن من الجنين عن طريق تحليل كثافات الذروة على جانبي الجنين لنفس الأجزاء. استخدام السعة الانكماش والوقت من كثافة الذروة لدراسة الاختلافات في مدى وتوقيت موجات تقلص العضلات التمعجية نشر على طول جانبي الجنين.
- قارن بين الكثافة الطبيعية لـ GFP في قطاعات مختلفة (على سبيل المثال، في المناطق الأمامية والوسطى والخلفية) أثناء انتشار موجة تقلص العضلات لدراسة التغيرات في الانكماش مع انتشار الموجة. يحدد هذا التحليل أيضًا اتجاه الموجة (أي ما إذا كانت تنتشر باتجاه المناطق الأمامية أو الخلفية للجنين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر تقلصات العضلات التمعجية العادية في WT (البريةمن نوع، كانتون-S) الجنين في الفيلم 1. كان متوسط وتيرة الموجات التمعجية من تقلصات العضلات في تحليلنا 47 تقلصات في الساعة وكان متوسط السعة 60٪ فوق خط الأساس لأجنة WT. يظهر الجنين المتداول لجنين WT في الفيلم 2، مع السهم الأبيض بمناسبة الموقف الأولي للالقصبة الهوائية والسهم الأسود الذي يصور موقف الزائدة الدودية الظهرية. لا يتحرك الزائدة الدودية الصددية (الخارجية) في حين أن القصبة الهوائية (الداخلية) لا، مما يشير إلى أن الجنين قد تدحرج داخل قوقعته
في تحليلنا لنمط تقلصات العضلات، حددنا تقلصاً تحلابياً كموجة من النوع 1 إذا كان ملفه الشخصي يحتوي على ذروة تنشأ في المنطقة الخلفية أولاً، تليها قمم في المناطق الوسطى والأمامية (الموجة الأمامية) أو لمحة عن الذروة التي تصل فيها الذروة ينشأ أولا في الأجزاء الأمامية ومن ثم ينتشر نحو المناطق الخلفية (الموجة الخلفية) (الشكل2A والفيلم 1). كما لاحظنا نوع آخر من الموجات التي حددناها على أنها النوع 2. تبدأ موجات النوع 2 من نهاية واحدة من الجنين (عادة الأمامي)، والمضي قدما نحو المناطق الوسطى، ومن ثم العودة إلى أصلها كموجة كاسحة إعادة بدء في الطرف الآخر (الشكل2A والفيلم 1، موجة 4). تظهر الأجنة المتحولة POMT ترددًا نسبيًا غير طبيعي من نوع 1/type 2 جيل الموجة (الشكل3)،مما يؤدي إلى شذوذ في وضع الجسم، أو التواء الجسم (أو "دوران") النمط الظاهري (الشكل4).
الشكل 1 يظهر السعة تقلص العضلات رصدها مع مرور الوقت كما تطبيع شدة GFP في قطاعات الجنين المختلفة (الأمامية والمتوسطة والخلفية). القمم خلال الفترة الزمنية 165-178 ثانية تمثل موجة بسيطة إلى الأمام (نوع 1). الشكل 1 B يظهر أنه لا يوجد فرق في السعة (يصور على أنها كثافة GFP) ووقت تقلصات العضلات على الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين.
ويبين الشكل 2 من النوع 1 والنوع 2 ملامح تقلص العضلات التي تم إنشاؤها باستخدام كثافة GFP كمقياس لسعة الانكماش. الموجة من النوع 1 هي موجة واحدة يتم إنشاؤها في الطرف الأمامي أو الخلفي للجنين الذي يستمر في الانتشار نحو الطرف الآخر. النوع 2 هو موجة biphasic التي تنتشر الموجة إلى منتصف الجنين خلال المرحلة الأولى ومن ثم يعود إلى الأصل كانكماش التمعجي بدأت في الطرف الآخر. كل خط موجة يمثل كثافة GFP الطبيعية التي تم الكشف عنها في أجزاء الجسم المتعاقبة من الجنين، والقمم تتوافق مع تقلص العضلات. مظهر مائل من القمم يوضح أن تقلصات العضلات تنتشر على طول أجزاء متتالية، من الأمامي إلى الخلفي، أو العكس بالعكس، وبالتالي تحدث القمم بطريقة متتالية في أجزاء الجسم المتعاقبة.
يتضمن الشكل 3 الرسوم البيانية لسلسلة موجات الانكماش في WT وPOMT الأجنة المتحولة. توضح الرسوم البيانية أن موجات الانكماش من النوع 2 يتم إنشاؤها بتواتر نسبي متزايد في متحولي POMT، مقارنة بجنين WT. سلسلة من الموجات في جنين WT (الرسم البياني الأعلى) يصور تقلصات تظهر في الفيلم 1.
يظهر الشكل 4 الأجنة المتحولة الثابتة WT وPOMT مع عضلات ملطخة بالفلودين المترافق ة لإبراز وضع جسم الجنين. يوضح الخط المنحني المتقطع النمط الظاهري لموقف الجسم لمتحولة POMT.
الفيلم 1: مثال على تقلصات العضلات التمعجية من جنين WT. وتظهر تقلصات العضلات في شكل الزائفة اللون لتوضيح زيادة في كثافة GFP عند حدوث انكماش (معظم بكسل مشرق هي حمراء). تم الحصول على الفيديو في 4 إطارات / ق (إطارا في الثانية) ويظهر في 20 إطارا في الثانية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيلم 2: جنين من نوع البرية المتداول داخل قذيفة لها. يشير السهم الأبيض إلى الموضع الأولي للالقصبة الهوائية، ويشير السهم الأسود إلى موضع الزائدة الدودية الظهرية. لاحظ أنه مع لف الجنين، يتغير موضع القصبة الهوائية ولكن الزائدة الظهرية لا تتحرك، مما يوضح أن الجنين يتدحرج داخل قشر البيض. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الشكل 1 سعة تقلصالعضلات. (أ) يتم رسم كثافة GFP ضد (Y- محور) الوقت (X-محور) لأجزاء الجسم المختلفة من الجنين. (ب) شدة GFP (Y- محور) مرسومة مع الوقت للجانبين الأيسر والأيمن من نفس الجزء من الجنين المتعاقد. معدل الإطار هو 4 إطارات / ث لكلا الرسمين البيانيين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 النوع 1 والنوع 2 ملامح موجة تقلص العضلات التمعجية. (A) نوع 1 موجة الشخصي الذي تمثل خطوط الفردية كثافة GFP تطبيع من أجزاء معينة من الجسم مع مرور الوقت،فيحين تشير القمم أحداث الانكماش. (ب) نوع 2 موجة الشخصي الذي يظهر مثالا على موجة انكماش biphasic، مرسومة بنفس الطريقة كما هو الحال في A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 سلسلة من موجات الانكماش التي تولدها الأجنة من النوع البري وPOMT متحولة. تُصوّر القضبان الزرقاء والحمراء موجات من النوع 1 والنوع 2، على التوالي. لاحظ أن متحولة POMT يولد نسبة متزايدة من موجات النوع 2، بالمقارنة مع WT. يمثل الرسم البياني WT تقلصات تظهر في الفيلم 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 ثابت ة وملطخة POMT متحولة (RT–) وWT الأجنة. لاحظ الدوران في أجزاء الجسم من الجنين متحولة POMT، أبرزها خط متقطع تتبع موقف خط الوسط. يتم تصور العضلات باستخدام تلطيخ مع الفالودين المترافق الفلوري. الأمامي إلى اليسار، الظهرية فوق. شريط مقياس = 100 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر طريقتنا طريقة كمية لتحليل سلوكيات الأجنة الهامة أثناء النمو، مثل موجات تقلص العضلات التمعجية، بما في ذلك دورية الموجة، والسعة والنمط، فضلا عن تأثير الموجة على لف الأجنة والموقف. وهذا يمكن أن يكون مفيدا في تحليلات المتحولين المختلفة لدراسة دور جينات محددة في تنظيم هذه السلوكيات وغيرها أثناء النمو الجنيني. لقد استخدمنا التغيرات في كثافة علامة GFP الخاصة بالعضلات لتحليل سعة تقلص العضلات وتواتر واتجاه انتشار موجة الانكماش في الأجنة. وتعكس هذه التغيرات في إشارة GFP مدى التقلصات، حيث أن قطاعات الهيئات المتعاقدة تجلب المزيد من عائد الاستثمار والمنطقة المجاورة لمجال التركيز. هذا النهج يبسط إلى حد كبير التحليلات ويعطي تمثيلا مرئيا أفضل لنمط موجات الانكماش التمعجي.
في تجاربنا، استخدمنا الأنماط الجينية مع التعبير المعدل وراثيا محددة العضلات من GFP لتصور ودراسة بالتفصيل تقلصات العضلات أثناء النمو الجنيني. واستخدمت دراسات أخرى نهجا مماثلا لتحليل حركة اليرقات مثل الزحف والانحناء5،15. تم تطبيق تقنية مماثلة لدراسة تقلصات العضلات المنسقة في السابق لإعداد شطيرة من الأجنة، وهو نهج أكثر الغازية التي قد تؤثر على سلوك الجنين والتنمية3. وعلى النقيض من ذلك، فإن أسلوبنا غير الغازية تماماً، كما أن الأجنة غير مضطربة أثناء الاختبارات. بروتوكولنا لا يتطلب أن تكون الأجنة منزوعة الشهي أو منحرفة، ويمكن استرداد الأجنة الحية ذات الأهمية بعد الاختبارات ونشرها لمزيد من التحليلات.
يمكن تطوير أسلوبنا بشكل أكبر لإجراء فحص قائم على تحليل المحتوى العالي (HCA) لعزل وتحليل الطفرات التي تؤثر على تقلصات العضلات الجنينية وغيرها من السلوكيات والعمليات التنموية. هذه الاستراتيجية، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لتسجيل تقلصات العضلات في وقت واحد من العديد من الأجنة ولتقييم استجابتها لمختلف المحفزات، والأدوية، أو التغيرات البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم المشروع جزئيامن المعاهد الوطنية للمنح الصحية RO1 NS099409، NS075534، وCONACYT 2012-037 (S) إلى نائب الرئيس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
