Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להקליט התכווצויות שרירים עובריים בעוברי דרוזוהילה בצורה לא פולשנית ומונחה פרטים.
Abstract
התכווצויות שרירים מתואמת הם צורה של התנהגות קצבית לראות מוקדם במהלך הפיתוח של העוברים דרוסופילה . מעגלי משוב חושי סנסוריים נדרשים לשלוט באופן פעולה זה. אי הפקת דפוס קצבי של התכווצויות יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. בעבר גילינו כי פגמים בחלבון O-mannosyזילציה, שינוי חלבון posttranslational, להשפיע על מורפולוגיה אקסון של נוירונים חושים ולגרום התכווצויות שרירים מתואמת נורמלי עוברים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית להקלטה וניתוח התבנית של התכווצויות שרירים הפריסטלטיות על ידי הדמיה חיה של עוברי שלב מאוחר עד לנקודת הבקיעה, אשר השתמשנו כדי לאפיין את התכווצות שרירים מרשם של חלבון . או-מנסילאז מוטציות נתונים שהתקבלו מהקלטות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח גלי התכווצות שרירים, כולל תדירות, כיוון התפשטות ומשרעת יחסי של התכווצויות שרירים בחלקי גוף שונים. בדקנו גם את תנוחת הגוף ואת היתרון של סמן פלורסנט הביע במיוחד השרירים כדי לקבוע במדויק את מיקומו של העובר באמצע הקו. גישה דומה יכולה להיות מנוצל גם לחקר התנהגויות שונות במהלך הפיתוח, כגון העובר מתגלגל והבקיעה.
Introduction
התכווצות שרירים פריסטלטית היא התנהגות מוטורית קצבית דומה הליכה ושחייה בבני אדם1,2,3. התכווצויות שרירים עובריים לראות Drosophila ילה עוברים בשלב מאוחר מייצגים דוגמה של התנהגות כזאת. דרוזופילה היא אורגניזם מודל מצוין לחקר תהליכים התפתחותיים שונים, משום שפיתוח עובריים בדרוסופילה מאופיין היטב, קצר יחסית, וקל לניטור. המטרה הכוללת של השיטה שלנו היא להקליט בקפידה ולנתח את דפוס ההתכווצות של התכווצות והרפיה של השרירים העובריים. השתמשנו בגישה פשוטה, לא פולשנית המציעה הדמיה מפורטת, הקלטה וניתוח של התכווצויות שרירים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד אחרים בתהליכים vivo, כגון מתגלגל עובריים לראות העוברים בשלב מאוחר רק לפני הבקיעה. במחקרים קודמים, התכווצויות שרירים עובריים נותחו בעיקר במונחים של תדר וכיוון1,2. על מנת לאמוד את היקף יחסי של הצירים כפי שהם התקדמות לאורך ציר הגוף בכיוון הקדמי או האחורי, השתמשנו העוברים ביטוי GFP במיוחד השרירים. ניתוח זה מספק דרך כמותית יותר לנתח התכווצויות שרירים כדי לחשוף כיצד תנוחת הגוף העוברים נשמרת במהלך סדרה של גלי הפריסטטיים של התכווצויות שרירים.
התכווצויות שרירים פריסטלטיות נשלטות על ידי מחולל תבנית מרכזית (CPG) מעגלים ותקשורת בין נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מערכת העצבים המרכזית (cn), והשרירים4,5. אי הפקת התכווצויות שרירים נורמלית הפריסטלטית יכול להוביל לפגמים כגון כישלון בצוהר2 ו זחל נורמלי תנועה6 והוא יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. הדמיה חיה של גלים הפריסטטיים של התכווצות שרירים וניתוח מפורט של פנוטיפים התכווצות יכול לעזור לחשוף מנגנונים פתוגניים הקשורים פגמים גנטיים המשפיעים על השרירים ומעגלים עצביים מעורב תנועה. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כדי לחקור מנגנונים כי התוצאה של פיתול יציבה הגוף פנוטיפ של pפרוטאין O-mannosyltבראנפראז (pomt) מוטציות7.
החלבון O-mannosylation (פום) הוא סוג מיוחד של שינוי פוסט-ממדי, שם מתווסף הסוכר סרין או שאריות של חלבונים של מסלול הפרשה8,9. פגמים גנטיים ב פום לגרום dystrophies שרירים מולדים (CMD) בבני אדם10,11,12. בדקנו את המנגנונים הסיבתי של מחלות אלו באמצעות דרוסופילה כמערכת מודל. מצאנו כי עוברים עם מוטציות ב Drosophila ילה חלבון O-mannosyltransferase גנים POMT1 ו POMT2 (הידוע הבטן מסובב (rt) ו מעוות (tw)) להראות מ עקירה ("סיבוב") של חלקי הגוף, אשר התוצאה היא יציבה גוף7. מעניין, פגם זה בד בבד עם השלב ההתפתחותי כאשר התכווצויות שרירים הפריסטלטיות להיות בולטות7.
מאז יציבה גוף חריג העוברים מוטציה פום מתעוררת כאשר השרירים והאפידרמיס הם כבר הקימו וגלים הפריסטלטיים של התכווצויות שרירים מתואמת החלו, שיערו כי יציבה הגוף לא נורמלי יכול להיות תוצאה של שריר נורמלי התכווצויות במקום פגם שריר או/ו אפידרמיס מורפולוגיה7. CMDs יכול להיות משויך עם התכווצויות שרירים חריגים ופגמים יציבה13, ובכך ניתוח של התנוחה פנוטיפ ב- drosophila pomt מוטציות עשוי להבהיר מנגנונים פתולוגיים הקשורים dystrophies שרירי . על מנת לחקור את היחסים בין הגוף הפנוטיפ של מוטציות מוטנטים וליקויים אפשריים בגלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים, החלטנו לנתח התכווצויות שרירים בפירוט באמצעות לחיות גישת הדמיה.
הניתוח שלנו של גלי התכווצות הפריסטטיות בעוברים הדרוזופילה חשף שני מצבי התכווצות נפרדים, המיועדים כסוג 1 ומסוג 2 גלים. מסוג 1 גלים הם גלים פשוטים הפצת מן הקדמי לאחורי או להיפך. הגלים מסוג 2 הם גלים ביפאטיים היוזמים בקצה הקדמי, מופצים באמצע הדרך בכיוון האחורי, מסתיימים לרגע, יוצרים כיווץ סטטי זמני, ולאחר מכן, במהלך השלב השני, הם נסחפים באמצעות כיווץ פריסטי המחפיץ . קדימה מהקצה האחורי פראי טיפוס העוברים בדרך כלל ליצור סדרה של התכווצויות המורכבת של כ 75% סוג 1 ו -25% סוג 2 גלים. לעומת זאת, עוברי מוטציה של Pomt ליצור סוג 1 ו 2 גלים בערך שוויון תדרים יחסית.
הגישה שלנו יכול לספק מידע מפורט לניתוח כמותי של התכווצויות שרירים העובר מתגלגל7. גישה זו יכול גם להיות מותאם לניתוח של התנהגויות אחרות הקשורות התכווצויות שרירים, כגון בקיעה וזחילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- להכין כלוב זבוב על ידי הפיכת כ 50 חורים בתוך 100 mL קיבולת פלסטיק תלת-ממדי הפינה באמצעות מחט חם 25 גרם (ראה טבלת חומרים).
- להכין 60 mm x 15 מ"מ מנות פטרי עם מיץ תפוחים-אגר (3% אגר ו 30% מיץ תפוחים).
- הכינו ממרח שמרים טריים על ידי ערבוב גרגרי שמרים יבשים ומים. הפיצו את שמרים להדביק על לוחות תפוח אגר כדי להגדיל את הטלת ביצים.
- הרדים על 50-60 זבובים (להשתמש במספר שווה של זכרים ונקבות) על CO2 ולשים אותם בכלוב לטוס.
הערה: שימוש בחלק מוגבר של הנקבות (עד ~ 2:1 יחס של נקבות: זכרים) עשוי לסייע להגדיל את כמות הביצים הונחו עבור כמה גנוטיפים. - לצרף צלחת התפוח אגר מיכל פטרי עם שמרים להדביק את כלוב לטוס הדוק ולאטום אותו עם חימר דוגמנות. ודא שהוא חתום בכל הפינות.
- המתן עד שהזבובים יתעוררו מהרדמה ולאחר מכן הפוך את הכלוב כך שצלחת פטרי נמצאת כעת בתחתית. הכניסו את הכלוב לתוך אינקובטור עם טמפרטורה מבוקרת (25 ° c) ולחות (60%).
- אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2-3 h, להחליף את צלחת התפוח עם אחד טרי, ולתת את הצלחת עם ביצים גיל עבור 19-20 h בחממה.
הערה: לפני השלב לעיל, זבובים חייב להיות מסונכרן כדי להקל על אוסף של שלב 17e-f (19-21 h ח. י.) עוברים. זה יכול להיות מושגת על ידי העברת זבובים לכלוב עם הצלחת טרי שמרים-תפוח לוחית אגר 3-4 פעמים עבור 12 h (פעם בכל 3-4 h). שמירה על זבובים בסביבה מבוקרת האור במעגל (LD מחזור) יכול גם לעזור עם איסוף אוכלוסיה מסונכרנת של עוברים, אבל זה לא היה חיוני בניסויים שלנו.
2. אוסף העוברים
- בזהירות לאסוף עוברים עם מכחול רטוב למקם אותם בצלחת זכוכית איסוף מלא 1x PBS.
- בחר את העוברים שלהם הקנה הנשימה שלהם מלא אוויר. דלקת הקנה מלאת האוויר מצביעה על כך שעוברים הגיעו לשלב 17, והתכווצויות השרירים הפריסטלטיות שלהם היו אמורות להתחיל. קנה הנשימה הופך להיות גלוי בבירור כאשר הם מלאים אוויר, אשר יכול לשמש כסמן עבור שלב 17.
- מקום מיצים התפוח אגר הלוח על שקופית זכוכית והעברת עוברים בזהירות מ-PBS אל לוח. לסדר את העוברים. עם הצד הגחוני שלהם למעלה
הערה: הצדדים הגהים של העוברים יכולים להיות מכובדים על ידי מיקום של תוספות בקליפת הברזל. - להפוך גבול שעווה מלבני על שקופית זכוכית אחרת באמצעות עט שעווה (ראה טבלת חומרים).
- מניחים סרט דביק דו צדדי בתוך הגבול הזה ובעדינות להרים את העוברים על ידי הנמכת שקופית זו אל לוח אגר. הפעילו לחץ עדין כדי לוודא שעוברים נדבקים בקלטת היטב, כאשר הצד השני שלהם למעלה. במקרה הצורך, ניתן לגלגל את העוברים על הקלטת כדי לתקן את האוריינטציה שלהם. האם כל המניפולציות בעת ניטור עוברים תחת מיקרוסקופ ניתוח.
- לכסות עוברים עם 1x PBS עבור הדמיה חיה של התכווצויות שרירים.
הערה: כמה הליכים המתוארים לעיל קשורים לטכניקות בסיסיות של דרוזוהילה המשמשות במחקרים רבים. תיאורים מפורטים יותר של טכניקות משותפות של דרוזופילה ניתן למצוא במקום אחר14.
3. הקלטת עוברים
- לבצע הדמיה חיה של העוברים רכוב על מיקרוסקופ אפיפלרליים עם פונקציה לשגות זמן מצלמה דיגיטלית עם מסנני פליטה מתאים (ראה טבלה של חומרים) באמצעות עדשת המים 10x היעד טבילה.
הערה: כאן השתמשנו עוברים המבטאים GFP בשרירים. סמנים פלורסנט אחרים עם אור עירור מתאים וערכות מסנן פליטה יכול לשמש גם (למשל, עבור זיהוי tdTomato, ניתן להשתמש במסנן עוצמת הצבע ET-561 הגדרת עירור ופליטה סביב האופטימלי 554 nm ו 581 nm, בהתאמה). - בצע הקלטת וידאו חיה של עוברים באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים) עבור כ 1-2 h עם שיעור הרכישה של 4 מסגרות/s.
הערה: כדי לנתח גלגול של העובר המתפתח בתוך המעטפת שלה, עוברים ללא ביטוי של סמנים פלורסנט ניתן להשתמש. לשם כך, האור רגיל המשודר תאורה ללא מסננים ספקטרלי מוחל על התנועה העובר להמחיש בתוך המעטפת (ראה סרט 2).
4. ניתוח ההקלטות
- לייצא את הווידאו המוקלט ישירות לתוך תמונה J עבור ניתוחים נוספים (g., כמו קבצי AVI).
- ב-ImageJ, חתוך את הקלטות הווידאו לגודל העוברים הבודדים על-ידי ציור תיבה סביב כל עובר ולאחר מכן לחיצה על התמונה > יבול. זה מפחית במידה ניכרת את הגודל של קבצי וידאו מבלי להשפיע על הרזולוציה שלה ומקלה על הניתוח שלהם.
- סובב תמונות שנחתכו כדי להשיג מיקום אנכי של קו האמצע ביחס למסך, על-ידי לחיצה על תמונה ≫ שינוי צורה > סובב.
הערה: בחירת תצוגה מקדימה במהלך תהליך זה תספק הדרכה לסיבוב, הצגת קווי רשת כדי להבטיח מיקום אנכי של קו האמצע. - אנליזה כמותית של העובר מתגלגל :
הערה: לניתוחי מרחק, ודא תחילה שהתמונות כוללות מידע קנה מידה. ניתן להוסיף את קנה המידה של התמונה על-ידי בחירה באפשרות ' נתח ≫ קביעת קנה מידה' ולאחר מכן הזנת המרה של פיקסלים למרחקים, לדוגמה, מיקרומטר- סמן את המיקום של אחד או את שני הגרניים במסגרת הראשונה של הווידאו בנקודה באמצע בין הקצוות האחוריים והקדמי. לחץ על לנתח > כלים > רועי מנהל ולהקליט מיקום זה כמו פרוסה מספר y קואורדינטות-x קואורדינטות ידי ציור תיבת של כ 7 יקרומטר על ידי 7 יקרומטר מסביבו והקלדת t על המקלדת. ודא שבעת הקלדת t, אזור מעניין נבחר בווידאו. לחלופין, בחר בכרטיסיה הוספה (t) במנהל הROI כדי לתעד את מיקום קנה הנשימה במקום להקליד את הפקודה.
הערה: אזור העניין יכול להשתנות בצורה או בגודל בהתאם לאזור העובריים או לאירוע התפתחותי שנלמד. - סמן את המיקום של אותו אזור של קנה הנשימה לאחר כל התכווצות פריסטלטית. מדוד את המרחק מהמיקום שלפני הכיווץ למיקום שלאחר הכיווץ על-ידי ציור קו המחבר בין המרכזים של כל תיבה והקלדת m בלוח המקשים. המר את המרחק ל-יקרומטר באמצעות מידה ידועה של תמונות. לחילופין, למדוד את המרחק ב-יקרומטר בצעד אחד על ידי לחיצה על לנתח את סרגל > קבוע ולהזין את פקטור ההמרה פיקסל-מיקרון ידוע כדי להניב דוח ב מיקרון.
הערה: ניתן להזין מרחק בפיקסלים יחד עם המרחק המתאים ב-μm. - לתאם את המרחק והכיוון של כל אירוע מתגלגל עם כיוון התפשטות התכווצות שרירים ב 8 עוברים לפחות עבור הבדלים משמעותיים סטטיסטית.
- סמן את המיקום של אחד או את שני הגרניים במסגרת הראשונה של הווידאו בנקודה באמצע בין הקצוות האחוריים והקדמי. לחץ על לנתח > כלים > רועי מנהל ולהקליט מיקום זה כמו פרוסה מספר y קואורדינטות-x קואורדינטות ידי ציור תיבת של כ 7 יקרומטר על ידי 7 יקרומטר מסביבו והקלדת t על המקלדת. ודא שבעת הקלדת t, אזור מעניין נבחר בווידאו. לחלופין, בחר בכרטיסיה הוספה (t) במנהל הROI כדי לתעד את מיקום קנה הנשימה במקום להקליד את הפקודה.
- ניתוח כמותי של התכווצויות שרירים עובריים:
- השימוש עוברים המבטא סמנים פלורסנט בשרירים (g., השתמשנו בזבובים טרנסגניים המבטא בונה היתוך של Myosin Heavy Cסלסטיאל יזם ו gfp שנקרא mhc-gfp5) כדי לנתח פרמטרים התכווצות שרירים כגון משרעת התכווצות.
- השתמש בהקלטה של הבדיקה פלורסנט לצייר אזור מעניין (למשל, קופסה של 15 יקרומטר כדי 45 יקרומטר [hxw]) ממורכז על השרירים (אשר ברור לעין עקב נוכחות של סמן פלורסנט) של פלח גוף מסוים, ובחר את הוסף (t) tab על ה e ROI מנהל להקליט את המיקום של ההחזר. לחץ על ROI מנהל > למדוד כדי להקליט את עוצמת הפלורסנט הממוצעת של כל אזור של עניין שנבחר עבור כל מסגרת של הווידאו.
- הזז את התיבה למרכזים של חלקי גוף אחרים של עניין ולחץ על הוסף (t) במנהל הROI כדי להקליט את עמדותיהם. זה ייתן אזורים של עניין בגודל זהה בכל חלקי הגוף כדי להיות מנותח. בחר לפחות אחד אחורי, אחד המדיאלי, ומקטע קדמי אחד, לדוגמה, A7, A4 ו-T2, בהתאמה.
- במנהל הROI, בחר את כל אזורי הריבית הנרשמים כקואורדינטות מספר פרוסה-y של קואורדינטת x (לדוגמה, על-ידי בחירה בעת החזקת Ctrl) ולחץ על מידת > רב יותר כדי למדוד את הפלורסנט הממוצע אינטנסיביות של כל אזור מעניין עבור כל המסגרות של הווידאו, ולדווח על כל מדידה בטבלה. כל אזור מעניין הוא עמודה של הטבלה, וכל מסגרת היא שורה. העבר את הטבלה לתוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
- התווה גרף עם מספר מסגרת על ציר x ועוצמת פלורסנט מתכוונת על ציר ה-y. ניתן להמיר מספר מסגרת לזמן באמצעות קצב המסגרות (4 מסגרות/s) של הווידאו (איור 1א).
- קביעת משרעת התכווצות שרירים על ידי הערכת העלייה בעוצמת הזריחה GFP ביחס לקו הבסיס. התכווצויות שרירים להגדיל את עוצמת GFP כפי שהם מביאים יותר GFP לתוך הסביבה של אזור המוקד כמו שרירים יותר לקבל במהלך התכווצויות אלה (סרט 1)7. צור פלואורסצנטית בסיסית כעוצמה הממוצעת בין גלי התכווצות. נרמל את עוצמת ה-GFP לתוכנית הבסיסית על-ידי חלוקת כל ערך העוצמה של ROI על-ידי העוצמה הבסיסית.
הערה: לכל פרופיל יש פלואורסצנטית בסיסי שונה, מאחר שייתכנו רמות ביטוי שונות במקטעי שרירים שונים.
הערה: סיבוך פוטנציאלי אחד הוא כי הזריחה GFP עשוי להשתנות במשך הזמן עקב הלבנת תמונה. זה יכול להיפתר על ידי ניטור שינויים בתוכנית בסיסית פלואורסצנטית באמצעות גודל לדוגמה מספיק עבור ניתוח גל (אנחנו בדרך כלל להשתמש סטים של 10 גלי פלורסנט ולוודא כי הבסיס הוא קבוע בקירוב על ידי לקיחת ממוצע של הפסגה בלבד קיצון כמו בסיס כי ירדו באור הזריחה על ידי 10% או פחות יחסית השיא הראשוני קיצון). התאורה הנורית פולס עשוי להיות מיושם גם כדי לרכך את הבעיה16. - השוואת התכווצויות שרירים על הצד השמאלי והימני של העובר על ידי ניתוח עוצמות שיא משני צידי העובר עבור מקטעים זהים. השתמש משרעת התכווצות והזמן של עוצמות שיא כדי לבחון את ההבדלים במידה והעיתוי של גלי התכווצות שרירים פריסטלטית הפצת לאורך שני צידי העובר.
- השוואת העוצמה המנורמלת של GFP במקטעים שונים (למשל, באזורים האחוריים, המדילי והאחורי) במהלך הפצת גל התכווצות שרירים כדי לבחון שינויים התכווצות כמו גל מפיץ. ניתוח זה קובע גם את כיוון הגל (קרי, בין אם הוא מפיץ לעבר אזורים הקדמי או האחורי של העובר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התכווצויות שרירים נורמלי קנולות מוצגים WT (פראי סוג, קנטון-S) העובר בסרט 1. התדר הממוצע של גלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים בניתוח שלנו היה 47 התכווצויות לשעה ואת משרעת הממוצע היה 60% מעל הבסיס עבור עוברי WT. מתגלגל העובר מוצג עבור העובר WT בסרט 2, כאשר החץ הלבן מסמן את המיקום הראשוני של קנה הנשימה ואת החץ השחור המתאר את המיקום של תוספת בראש. הנספח הפנימי (החיצוני) אינו זז בעוד הדלקת הקנה (פנים) מציינת כי העובר התגלגל בתוך הקליפה שלו
בניתוח שלנו של דפוס של התכווצויות שרירים, החלטנו התכווצות הפריסטטית כסוג 1 גל אם הפרופיל שלו יש שיא שעולה על האזור האחורי הראשון, ואחריו פסגות באמצע ובאזורים הקדמיים (גל קדימה) או פרופיל שבו השיא מתעוררת לראשונה בקטעים הקדמי ולאחר מכן מפיץ לכיוון האזורים האחוריים (גל לאחור) (איור 2A וסרט 1). הבחנו גם בסוג אחר של גלים שאנו מיועדים לסוג 2. מסוג 2 גלים מתחילים בקצה אחד של העובר (הקדמי בדרך כלל), להמשיך לכיוון האזורים האמצעיים, ולאחר מכן לחזור למקור שלהם כמו גל גורף ביוזמת מחדש בקצה הנגדי (איור 2a וסרט 1, גל 4). העוברים המוטציות Pomt להציג תדירות יחסית נורמלי של סוג 1/סוג 2 גל הדור (איור 3), אשר תוצאות חריגות יציבה הגוף, פיתול הגוף (או "סיבוב") פנוטיפ (איור 4).
איור 1 A מראה משרעת התכווצות שרירים פיקוח לאורך זמן כחוזק מנורמל gfp במקטעי העובר שונים (קדמי, האמצע והאחורי). פסגות במהלך התקופה 165-178 s מייצגים גל פשוט קדימה (סוג 1). איור 1 B מראה כי אין הבדל בשרעת (מתואר כאינטנסיביות gfp) והזמן של התכווצויות שרירים על צד ימין ושמאל של העובר.
איור 2 מראה סוג 1 ו-2 התכווצות שרירים פרופילים שנוצרו באמצעות עוצמת gfp כאמצעי של התכווצות משרעת. גל מסוג 1 הוא גל בודד שנוצר בקצה הקדמי או האחורי של העובר הממשיך להפיץ לקראת הקצה הנגדי. סוג 2 הוא גל biphasic שבו הגל מפיץ לאמצע העובר בשלב הראשון ולאחר מכן חוזר למקור כמו התכווצות הפריסטלטית מחדש בקצה הנגדי. כל קו גל מייצג עוצמה מנורמלת של GFP שזוהתה במקטעי גוף רצופים של עובר, ופסגות מתאימות להתכווצות שרירים. שיפוע המראה של הפסגות ממחיש כי התכווצויות שרירים מופצים לאורך מקטעים רצופים, מן הקדמי לאחורי, או להיפך, ולכן פסגות להתרחש באופן רציף במקטעי גוף רצופים.
איור 3 כולל גרפים של סדרת התכווצות גל ב WT ו מוטציה pomt . הגרפים מדגימים כי סוג 2 גלים התכווצות נוצרות בתדר יחסי מוגבר מוטציות Pomt , לעומת העובר WT. סדרת הגלים בעובר WT (הגרף העליון) מתארת את הצירים המוצגים בסרט 1.
איור 4 מראה העוברים ומוטאנטים קבועים עם השרירים ויטראז ' באמצעות פלואור-מעלה להאיר תנוחת הגוף העובר. הקו המקווקו המעוקל ממחיש את הגוף הפנוטיפ של מוטציה של POMT.
סרט 1: דוגמה של התכווצויות שרירים פריסטלטיות של העובר WT. התכווצויות שרירים מוצגים בתבנית צבעונית מדומה כדי להמחיש את העלייה בעוצמה GFP כאשר הכיווץ מתרחשת (הפיקסלים הבהירים ביותר הם אדומים). הווידאו נרכש ב 4 מסגרות/s (fps) והוא מוצג 20 fps. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
סרט 2: העובר פראי מתגלגל בתוך המעטפת שלו. החץ הלבן מציין את המיקום ההתחלתי של קנה הנשימה, והחץ השחור מציין את מיקום התוספת ההתחלתית. שימו לב כי כאשר העובר לחמניות, מיקום הקנה משתנה אך הנספח הפנימי אינו זז, הממחיש כי העובר מתגלגל בתוך קליפת הבטן שלו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור 1 : התכווצות שרירים משרעת. (א) עוצמה gfp מותוות נגד (ציר Y) זמן (ציר X) עבור פלחי גוף שונים של העובר. (ב) עוצמה gfp (ציר Y) מותווה נגד הזמן עבור צד שמאל וימין של אותו מקטע של העובר הקבלנות. קצב המסגרות הוא 4 מסגרות/s עבור שני הגרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : מסוג 1 ומסוג 2 התכווצות שרירים הפריסטלטיות. (A) סוג 1 פרופיל הגל שבו קווים בודדים מייצגים עוצמות gfp מנורמלות של מקטעי גוף מסוימים לאורך זמן, בעוד הפסגות מציינות אירועי התכווצות. (ב) סוג 2 פרופיל הגל המציג דוגמה של גל התכווצות biphasic, המותווה באותו אופן כמו ב-a. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : סדרה של גלי התכווצות שנוצרו על ידי מסוג פראי ועוברי מוטציה pomt . בארים כחולים ואדומים מתארים סוג 1 וגלים מסוג 2, בהתאמה. שים לב כי מוטציה Pomt יוצר חלק מוגבר של גלי סוג 2, לעומת WT. גרף ה-WT מייצג את הצירים המוצגים בסרט 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : קבוע ומוכתם pomt המוטציות (rt–) ו-WT עוברים. שים לב לסיבוב במקטעי הגוף של העובר מוטציה Pomt , המסומן על-ידי קו מקווקו העוקב אחר מיקום קו האמצע. השרירים הם דמיינו באמצעות כתמים עם מעלה fluorescidin. , הקדמי הוא משמאל. הקודם למעלה סרגל קנה מידה = 100 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שלנו מספקת דרך כמותית לנתח התנהגויות העובר חשוב במהלך הפיתוח, כגון גלי השריר הפריסטטי התכווצות, כולל גל תקופתיות, משרעת ודפוס, כמו גם אפקט גל על העובר מתגלגל ויציבה. זה יכול להיות שימושי ניתוחים של מוטציות שונות כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים בוויסות אלה והתנהגויות אחרות במהלך התפתחות עובריים. השתמשנו בשינויים בעוצמת סמן GFP שרירים ספציפיים כדי לנתח משרעת התכווצות שרירים, תדירות וכיוון של הפצת גל התכווצות בעוברים. שינויים אלה באות GFP לשקף את היקף הצירים, כמו מגזרים הגוף מתקשרת להביא יותר GFP לתוך התשואה ואת הסביבה של אזור המוקד. גישה זו מפשטת באופן משמעותי את הניתוחים ומעניקה ייצוג חזותי טוב יותר של התבנית של גלי התכווצות הפריסטטיים.
בניסויים שלנו, השתמשנו גנוסוגים עם ביטוי הטרנסגניים ספציפי שרירים של GFP כדי להמחיש וללמוד בפירוט התכווצויות שרירים במהלך התפתחות עובריים. מחקרים אחרים השתמשו בגישה דומה לניתוח תנועת זחל כגון זחילה וכיפוף5,15. טכניקה דומה למחקר התכווצויות שרירים מתואמת הוחל בעבר על הכנת כריך של עוברים, אשר היא גישה פולשנית יותר העלולה להשפיע על התנהגות העובר ופיתוח3. לעומת זאת, השיטה שלנו היא לא פולשנית לחלוטין והעוברים לא מודאג במהלך העונה. הפרוטוקול שלנו לא דורש את העוברים כדי להיות de, או devitellinated, ואת העוברים חיים של עניין ניתן לשחזר לאחר הספר והופץ לניתוחים נוספים.
השיטה שלנו יכולה להיות מפותחת יותר עבור ניתוח תוכן גבוה (HCA) ההקרנה מבוסס לבודד ולנתח מוטציות המשפיעות על התכווצויות שרירים עובריים והתנהגויות אחרות תהליכים התפתחותיים. אסטרטגיה זו, למשל, יכולה לשמש במקביל לרישום התכווצויות שרירים של עוברים רבים ולהערכת התגובה שלהם לגירויים שונים, סמים או שינויים סביבתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
הפרויקט היה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות RO1 NS099409, NS075534, ו CONACYT 2012-037 (S) לסמנכ ל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. Hames, B. D. , Oxford University Press. New York. 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
