Summary
在这里,我们提出一种以非侵入性和细节导向的方式记录果蝇胚胎胚胎肌肉收缩的方法。
Abstract
协调肌肉收缩是果蝇胚胎早期出现的节奏行为的一种形式。神经感官反馈电路需要控制此行为。未能产生有节奏的收缩模式可能表明神经异常。我们之前发现,蛋白质O-mannosylation的缺陷,一种翻译后蛋白质修饰,影响感觉神经元的斧头形态,并导致胚胎异常协调肌肉收缩。在这里,我们提出了一个相对简单的方法来记录和分析蠕动肌肉收缩的模式,通过活成像的晚期胚胎到孵化点,我们用它来描述蛋白质的肌肉收缩表型O-mannosyl转移酶突变体。从这些记录获得的数据可用于分析肌肉收缩波,包括频率、传播方向和不同身体段肌肉收缩的相对振幅。我们还检查了身体姿势,并利用在肌肉中专门表达的荧光标记,以准确确定胚胎中线的位置。类似的方法也可以用来研究发育过程中的各种其他行为,如胚胎滚动和孵化。
Introduction
蠕动性肌肉收缩是一种有节奏的运动行为,类似于人类行走和游泳1,2,3。在果蝇晚期胚胎中看到的胚胎肌肉收缩就是这种行为的一个例子。果蝇是研究各种发育过程的优秀模型生物体,因为果蝇的胚胎发育特征良好,相对较短,易于监测。我们的方法的总体目标是仔细记录和分析胚胎肌肉收缩和放松的波浪状模式。我们使用一种简单、非侵入性的方法,提供肌肉收缩的详细可视化、记录和分析。这种方法还可用于研究其他体内过程,如在孵化前在晚期胚胎中看到的胚胎滚动。在以前的研究中,胚胎肌肉收缩主要根据频率和方向1、2进行分析。为了估计收缩的相对程度,因为它们沿着身体轴在前或后方向前进,我们使用了在肌肉中专门表达GFP的胚胎。这一分析提供了一个更定量的方法来分析肌肉收缩,并揭示在肌肉收缩的一系列蠕动波中,胚胎的身体姿势是如何维持的。
蠕动性肌肉收缩由中央模式发生器(CPG)回路和周围神经系统(PNS)、中枢神经系统(CNS)和肌肉4、5的神经元之间的通信控制。未能产生正常的蠕动性肌肉收缩可能导致缺陷,如孵化2和异常幼虫运动6,并可能指示神经异常。肌肉收缩蠕动波的实时成像和收缩表型的详细分析可以帮助发现与影响运动有关的肌肉和神经回路的遗传缺陷相关的致病机制。我们最近使用这种方法来研究机制,导致身体姿势扭转表型的p死神O-m annosylt兰斯芬酶(POMT)突变体7。
蛋白质O-mannosylation(POM)是一种特殊的翻译后修饰,其中单体糖被添加到丝氨酸或三角氨酸残留的分泌途径蛋白8,9。POM的遗传缺陷导致先天性肌肉萎缩症(CMD)在人类10,11,12。我们用果蝇作为模型系统调查了这些疾病的致病机制。我们发现,在果蝇蛋白O-mannos转酶基因POMT1和POMT2(又名旋转腹部(rt)和扭曲(tw)中发生突变的胚胎显示身体段的位移("旋转"),导致身体异常姿势7。有趣的是,这个缺陷与发育阶段相吻合,当时蠕动性肌肉收缩变得突出7。
由于POM突变胚胎的异常身体姿势是在肌肉和表皮已经形成,并且协调肌肉收缩的蠕动波已经开始时产生的,我们假设异常的身体姿势可能是异常肌肉的结果收缩,而不是肌肉或/和表皮形态的缺陷7。CMD可能与异常肌肉收缩和姿势缺陷13相关,因此,在果蝇POMT突变体中,对姿势表型的分析可以阐明与肌肉萎缩症相关的病理机制.为了研究果蝇POMT突变体的身体姿势表型与肌肉收缩蠕动波的可能异常之间的关系,我们决定使用活的成像方法。
我们对果蝇胚胎的蠕动收缩波的分析揭示了两种截然不同的收缩模式,被指定为1型和2型波。类型 1 波是从前波传播到后波的简单波,反之亦然。类型 2 波是在前端启动的双相波,在后方方向半传播,暂时停止,形成暂时静态收缩,然后,在第二阶段,被传播的蠕动收缩所席卷从后端向前。野生型胚胎通常产生一系列收缩,包括大约75%的1型和25%的2型2波。相反,POMT突变胚胎以大约相等的相对频率产生1型和2型波。
我们的方法可以提供详细的信息,定量分析肌肉收缩和胚胎滚动7。这种方法也可以用于分析涉及肌肉收缩的其他行为,如孵化和爬行。
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Protocol
1. 准备
- 使用热的 25 G 针头在 100 mL 容量的三角塑料烧杯中打大约 50 个孔,准备飞笼(参见材料表)。
- 准备 60 毫米 x 15 毫米培养皿,配苹果汁-琼脂(3% 琼脂和 30% 苹果汁)。
- 通过混合干酵母颗粒和水来制备新鲜的酵母糊。将酵母糊涂在苹果琼脂板上以增加卵子的产卵。
- 在CO2上麻醉大约50-60只苍蝇(使用大致相等数量的雄性和雌性),并将其放入苍蝇笼中。
注:使用增加的女性比例(女性比例高达+2:1:雄性)可能有助于增加某些基因型的产卵量。 - 将苹果汁-阿加培养皿与酵母糊紧紧地连接到苍蝇笼,用造型粘土密封。确保它密封在所有角落。
- 等到苍蝇从麻醉中醒来,然后倒置笼子,使培养皿现在在底部。将笼子放入具有受控温度(25°C)和湿度(60%)的培养箱中。
- 让苍蝇产卵2-3小时,用新鲜的苹果板代替苹果板,让卵子在孵化器中年龄为19-20小时。
注:在上述步骤之前,苍蝇必须同步,以方便收集阶段17e-f(19-21 h AEL)胚胎。这可以通过将苍蝇转移到笼子里,用新鲜的酵母-苹果汁-琼脂板3-4次,12小时(每3-4小时一次)。保持苍蝇在受控的昼夜光环境(LD周期)也有助于收集同步的胚胎群,但这不是在我们的实验中必不可少的。
2. 胚胎收集
- 用湿画笔仔细挑选胚胎,并将其放入装满 1x PBS 的收集玻璃盘中。
- 选择气管充满空气的胚胎。充满空气的气管表明胚胎已经到了第17阶段,他们的蠕动肌肉收缩应该已经开始。当充满空气时,气管变得清晰可见,这可以作为第17阶段的标记。
- 将苹果汁琼脂板放在玻璃幻灯片上,小心地将胚胎从PBS转移到板子上。将胚胎与胚胎的腹腔侧向上排列。
注:胚胎的背和腹侧可以通过背端附属物在蛋壳上的位置来区分。 - 使用蜡笔在另一张玻璃幻灯片上制作矩形蜡边界(参见材料表)。
- 将双面胶带放在该边界内,通过将滑轨降低到琼脂板上,轻轻拾起胚胎。施加温和的压力,确保胚胎粘在胶带上,其背侧向上。如有必要,胚胎可以滚到胶带上以校正其方向。在解剖显微镜下监测胚胎时,做所有操作。
- 用1xPBS覆盖胚胎,用于肌肉收缩的活成像。
注:上述一些程序与许多研究中使用的基本果蝇技术有关。关于常见的果蝇技术的更详细说明,可以在其他地方找到14。
3. 胚胎记录
- 使用具有延时功能的显微显微镜和带有适当发射滤镜的数码相机(参见材料表)对安装的胚胎进行实时成像。"
注:在这里,我们使用在肌肉表达GFP的胚胎。还可使用其他具有适当激发光和发射滤光集的荧光标记(例如,用于 tdTomato 检测,可以使用色度 ET-561 滤波器集,分别用于最佳 554 nm 和 581 nm 周围的激励和发射)。 - 使用合适的软件(见材料表)对胚胎进行1-2小时的实时视频记录,采集速率为4帧/秒。
注:为了分析在壳内发育的胚胎的滚动,可以使用没有荧光标记表达的胚胎。为此,应用没有光谱滤镜的常规透射光照明来可视化外壳内的胚胎运动(参见影片2)。
4. 录音分析
- 将录制的视频直接导出到图像 J 以进行进一步分析(例如,作为 AVI 文件)。
- 在 ImageJ 中,通过在每个胚胎周围绘制一个框,然后单击Image >裁剪,将视频录制裁剪为单个胚胎的大小。这大大减少了视频文件的大小,而不会影响其分辨率,并有助于其分析。
- 通过单击图像>变换>旋转,旋转裁剪的图像,实现胚胎中线的垂直位置相对于屏幕。
注:在此过程中选择"预览"将提供有关旋转的指导,显示网格线以确保中线的垂直位置。 - 胚胎滚动的定量分析:
注:对于距离分析,请先确认图像包含缩放信息。可以通过选择"分析>设置比例",然后输入像素转换为距离(例如微米)来添加图像比例- 在视频的第一帧中标记一个或两个气管的位置,位于后部和前两端之间的中间点。单击"分析> 工具>ROI 管理器",通过绘制一个约 7 μm x 7 μm 的框并在键盘上键入t,将此位置记录为切片数字-y 坐标-x坐标。 确保在键入t时选择视频上感兴趣的区域。或者,选择 ROI 管理器上的"添加 (t)"选项卡来记录气管的位置,而不是键入命令。
注:感兴趣的区域的形状或大小可能因所研究的胚胎区域或发育事件而异。 - 标记每次蠕动收缩后气管的相同区域的位置。通过绘制连接每个框的中心并在键盘上键入m的线,测量从收缩前位置到收缩后位置的距离。使用已知的图像比例将距离转换为 μm。或者,通过单击"分析>设置刻度",在单个步骤中测量 μm 的距离,然后输入已知的像素到微米转换系数以生成以微米为单位的报告。
注:可以输入以像素为单位的距离及其相应的距离(以 μm 为单位)。 - 将每个滚动事件的距离和方向与至少 8 个胚胎中的肌肉收缩传播方向相关联,以表示统计显著性差异。
- 在视频的第一帧中标记一个或两个气管的位置,位于后部和前两端之间的中间点。单击"分析> 工具>ROI 管理器",通过绘制一个约 7 μm x 7 μm 的框并在键盘上键入t,将此位置记录为切片数字-y 坐标-x坐标。 确保在键入t时选择视频上感兴趣的区域。或者,选择 ROI 管理器上的"添加 (t)"选项卡来记录气管的位置,而不是键入命令。
- 胚胎肌肉收缩的定量分析:
- 使用在肌肉中表达荧光标记的胚胎(例如,我们使用转基因苍蝇表达M yosin Heavy C海因促进剂和GFP称为MHC-GFP5的融合结构),分析肌肉收缩参数,如收缩幅度。
- 使用荧光读出的记录并绘制感兴趣的区域(例如,以特定身体段的肌肉(由于荧光标记的存在而清晰可见)为中心的15μm至45 μm [HXW]的盒子,并选择第 1 个"添加 (t)"选项卡e ROI 经理记录 ROI 的位置。单击ROI 管理器>测量记录为视频的每一帧选择的每个感兴趣区域的平均荧光强度。
- 将框移动到其他感兴趣身体部位的中心,然后单击 ROI 管理器中的添加(t)以记录其位置。这将在所有要分析的体段中提供相同大小的感兴趣区域。分别选择至少一个后段、一个内段和一个前段,例如 A7、A4 和 T2。
- 在 ROI 管理器中,选择记录为切片数字-y 坐标-x 坐标的所有感兴趣区域(例如,通过按住Ctrl时选择),然后单击更多>多度量以测量均值荧光视频所有帧的每个感兴趣区域的强度,并在表中报告每个度量值。感兴趣的每个区域是表的列,每个帧是一行。将表传输到电子表格程序进行进一步分析。
- 在 x 轴上绘制带有帧数的图形,并在 y 轴上绘制平均荧光强度。帧数可以使用视频的帧速率 (4 帧/秒) 转换为时间 (图 1A)。
- 通过估计相对于基线的 GFP 荧光强度的增加来确定肌肉收缩幅度。肌肉收缩增加GFP强度,因为他们带来了更多的GFP到焦点区域附近,因为更多的肌肉在这些收缩中被拉入(电影1)7。建立基线荧光作为收缩波之间的平均强度。通过将每个 ROI 强度值除以基线强度,将 GFP 强度标准化为基线。
注:每个轮廓具有不同的基线荧光,因为在不同的肌肉片段中可能有不同的表达水平。
注:一个潜在的并发症是,由于照片漂白,GFP荧光可能会随时间而改变。这可以通过监测荧光基线的变化和使用足够的样本大小进行波分析来解决(我们通常使用10个荧光波集,并通过仅采集这些峰值的平均值来确认基线大致保持不变)最小值作为基线,荧光比初始最小峰降低 10% 或更少)。脉冲LED照明也可以应用来缓解这个问题16。 - 通过分析相同部分胚胎两侧的峰强度,比较胚胎左右两侧的肌肉收缩。使用收缩振幅和峰值强度的时间来检查沿胚胎两侧传播的蠕动肌肉收缩波的范围和时间差异。
- 在肌肉收缩波传播期间,比较不同段(例如,前段、中段和后部区域)的 GFP 的标准化强度,以检查波传播时收缩的变化。此分析还确定波的方向(即,它是否传播到胚胎的前部或后区域)。
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Representative Results
正常的蠕动肌肉收缩在电影1中显示在WT(野生型,广S)胚胎中。在我们的分析中,肌肉收缩蠕动波的平均频率为每小时47次收缩,平均振幅比WT胚胎的基线高出60%。影片 2 中为WT胚胎显示胚胎滚动,白色箭头标记气管的初始位置,黑色箭头表示背端附属项的位置。背端附属体(外部)不移动,而气管(内部)移动,表明胚胎在其壳内滚动
在分析肌肉收缩模式时,我们指定蠕动收缩为类型 1 波,如果其轮廓首先出现在后部区域的峰值,然后是中间和前部区域的峰值(前波)或峰值的剖面首先出现在前段,然后传播到后区域(后波)(图2A和电影1)。我们还观察到另一种类型的波,我们指定为类型2。类型2波从胚胎的一端开始(通常是前部),向中间区域移动,然后返回到其起源,作为一个扫波在相反端重新启动(图2A和电影1,波4)。POMT突变胚胎显示1型/类型2波生成(图3)的异常相对频率,导致身体姿势异常,身体扭转(或"旋转")表型(图4)。
图 1A显示肌肉收缩振幅监测随着时间的推移作为标准化的GFP强度在不同的胚胎段(前,中和后)。165-178 s 期间的峰值表示简单的前波(类型 1)。图 1B显示胚胎左右两侧的振幅(如 GFP 强度)和肌肉收缩时间无差异。
图 2显示了使用 GFP 强度作为收缩振幅度量生成的类型 1 和类型 2 肌肉收缩配置文件。1型波是在胚胎前或后端产生的单个波,继续向另一端传播。类型 2 是双相波,其中波在第一阶段传播到胚胎中间,然后返回到原点,作为蠕动收缩在相反端重新启动。每个波线表示在胚胎连续身体段检测到的标准化GFP强度,峰对应于肌肉收缩。峰的倾斜外观表明肌肉收缩沿着连续段传播,从前段到后段,反之亦然,因此峰在连续身体段中连续发生。
图3包括WT和POMT突变胚胎中的收缩波序列图。图表表明,与WT胚胎相比,2型收缩波在POMT突变体中相对频率增加。WT胚胎中的波浪系列(上图)描述了电影1所示的收缩。
图4显示了固定WT和POMT突变胚胎,其肌肉沾染了荧光素-结合的噬菌体,以突出胚胎体姿势。弯曲的虚线说明了 POMT 突变体的身体姿势表型。
电影1:WT胚胎蠕动肌肉收缩的例子。肌肉收缩以伪彩色格式显示,以说明收缩发生时 GFP 强度的增加(大多数明亮的像素为红色)。该视频以 4 帧/秒 (fps) 的速度采集,以 20 fps 的速度显示。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
电影2:一个野生型胚胎在其壳内滚动。白色箭头表示气管的初始位置,黑色箭头表示背端附属项的位置。请注意,当胚胎滚动时,气管位置改变,但背端附属性不会移动,这表明胚胎在蛋壳内滚动。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
图 1:肌肉收缩振幅。(A) GFP 强度针对胚胎的不同身体部位绘制(Y 轴)时间(X 轴)。(B) GFP 强度 (Y 轴) 针对收缩胚胎同一部分的左右两侧的时间绘制。两个图形的帧速率均为 4 帧/秒。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:类型 1 和类型 2 蠕动肌肉收缩波配置文件。(A) 类型 1 波轮廓,其中单个线表示特定体段随时间的标准化 GFP 强度,而峰值表示收缩事件。(B) 2型波轮廓,显示双相收缩波的例子,绘制方式与 A 相同。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:野生型和POMT突变胚胎产生的收缩波系列。蓝色和红色条分别表示类型 1 和类型 2 波。请注意,与WT 相比,POMT 突变体生成 2 型波的比例增加。WT 图表示影片 1中显示的收缩。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:固定和染色的POMT突变体 (rt=) 和 WT 胚胎.注意POMT突变胚胎体段的旋转,通过跟踪中线位置的虚线突出显示。肌肉可视化使用染色与荧光素结合的噬菌体素。前在左边,背是向上。比例尺 = 100 mm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该方法为分析发育过程中的重要胚胎行为提供了定量方法,如蠕动性肌肉收缩波,包括波周期、振幅和模式,以及波效应对胚胎滚动和姿势的影响。这在分析不同突变体时非常有用,可以研究特定基因在胚胎发育过程中调节这些和其他行为的作用。我们使用肌肉特异性GFP标记强度的变化来分析肌肉收缩幅度、频率和胚胎收缩波传播的方向。GFP 信号的这些变化反映了收缩的程度,因为收缩体段将更多的 GFP 带入 ROI 和焦点区域附近。这种方法大大简化了分析,并给出了蠕动收缩波模式的更好视觉表现。
在我们的实验中,我们使用基因型与肌肉特异性转基因表达的GFP可视化和研究在胚胎发育期间详细的肌肉收缩。其他研究使用类似的方法来分析幼虫运动,如爬行和弯曲5,15。研究协调肌肉收缩的类似技术以前应用于胚胎的三明治制备,这是一种更具侵入性的方法,可能会影响胚胎的行为和发育3。相反,我们的方法是完全非侵入性的,胚胎在检测过程中不受干扰。我们的协议不要求胚胎被去功能化或去向化,并且感兴趣的活胚胎可以在化数后被恢复并繁殖,以便进一步分析。
我们的方法有可能进一步开发,用于基于高含量分析 (HCA) 的筛选,以分离和分析影响胚胎肌肉收缩和其他行为和发育过程的突变。例如,这种策略可用于同时记录许多胚胎的肌肉收缩,并评估它们对各种刺激、药物或环境变化的反应。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目部分得到国家卫生研究院批准RO1 NS099409、NS075534和CONACYT 2012-037(S)副总裁的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 inch |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
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