Summary
이 기사에서는 지질학 및 전사학, 그리고 지질의 근본적인 염증 및 신경 활동, 막 지질, 다운스트림 메신저 및 mRNA 인코딩 효소/수용체를 대상으로 하는 신경 질환 마우스 모델의 혈장 지질학에 대한 모듈식 프로토콜을 제시합니다. 샘플링, 샘플 처리, 추출 및 정량화 절차가 설명되어 있습니다.
Abstract
지질은 신경 질환에 도움이되는 뇌 모욕이나 자극에 대한 기본 인터페이스 역할을하며 질병의 발병 및 진행을 강조 할 수있는 다양한 신호 또는 리간드 기능을 가진 지질 합성을위한 저수지입니다. 종종 전증상 수준에서 변화, 지질은 약물 표적과 바이오 마커의 신흥 소스입니다. 많은 신경 질환은 신경 염증을 전시, 신경 변성, 일반적인 특징으로 신경 흥분성, 부분적으로 특정 지질 신호 시스템에 의해 변조. 다양한 지질의 합성의 상호 의존성 및 상호 관계는 신경학적 맥락의 공통점과 특이성을 도출하고 질병 발병 및 진행의 기계적 측면의 해명속도를 촉진하기 위해 다중 지질, 다효소 및 다수용체 분석을 자극한다. 뚜렷한 뇌 영역에 지질 역할을 아스포딩하는 것은 신경 질환과 관련된 지질 분자 표현형 및 형태학의 결정을 진행합니다.
여기에 제시된 모듈식 프로토콜은 특정 신경 질환 및/또는 조건에 관련있는 이산 뇌 영역에서 추출된 기능의 근간이 되는 효소 및 중재자의 mRNA와 함께 멤브레인 지질 및 하류 지질 신호의 분석에 적합한 모듈식 프로토콜이다. 정확한 비교 지질 프로파일링을 보장하기 위해, 워크플로우 및 운영 기준은 최적화 및 표준화되었다: i) 뇌 샘플링 및 관심 영역의 해부, ii) 다중 지질 신호 및 멤브레인 지질의 공동 추출, iii) 이중 지질/mRNA 추출, iv) 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링(LC/MRM), 및 v) 표준 mRNA 프로파일링에 의한 정량화. 이러한 워크플로우는 기능적으로 이산뇌 하위 영역(즉, 뇌 펀칭에 의한)의 샘플링에 의해 얻어진 낮은 조직량에 대해 가능하므로 조직 이질성 및/또는 동물 적 변이성으로 인한 다분자 분석의 편견을 방지할 수 있습니다. 신경 질환의 말초 결과를 밝히고 신경 질환 상태의 번역 분자 판독을 확립하기 위해 말초 장기 샘플링, 처리 및 후속 지방 피도혈 분석뿐만 아니라 혈장 리피도믹도 추구되고 설명됩니다. 프로토콜은 급성 간질 마우스 모델에서 입증된다.
Introduction
지질의 기능과 신경 질환의 발병 및 진행에 대한 역할의 최근 발전은 새로운 치료 목표 및 질병 메커니즘 의 새로운 연구 및 개발 장소를 열어1. 질량 분석 영상 및 고급 질량 분광 프로파일링과 같은 현대 분자 이미징 기술에 의해 강조되는 다른 뇌 영역에서 지질 조성에 대한 문서화 된 차이는 전체 뇌에서 지질 조사의 패러다임을 기능적으로 뚜렷하고 이산적인 뇌 영역으로 전환합니다. 지질 성분이 다른 뇌 영역에서 다르다는 사실은 기능적으로 뚜렷한 뇌 영역을 가로지르는 뇌 모욕이나 자극에 대응하여 멤브레인 지질 감수성과 하류 지질 신호의 새로운 개념화를 자극합니다. 따라서 지질 프로토콜은 더 높은 공간 분해능 검출 및 정량화, 그리고 동시에 세포막 및 신호 경로의 여러 지질 성분의 분석을 위해 낮은 조직 량의 과제를 해결하기 위해 새로운 개발이 필요합니다. 또한, 효소의 결정, 지질 리간드, 그들의 수준 및 기능의 조절에 관련 된 수용 체는 신경 질환에 영향을 받는 신호 경로를 해명 하 고 병리학적 맥락에서 새로운 기계분석 조사를 안내 하는 것이 가장 중요 하다.
증가 된 뇌 공간 해상도 뿐만 아니라, 새로운 신경 지질 도성 접근의 개발에 도전 하는 두 가지 주요 어려움이 있다. 첫째, 지질 신호 분자는 일반적으로 막 구성 지질에 비해 매우 낮은 풍부의. 둘째, 리피돔은 단일 분석 접근법을 사용하여 해부하기 어려운 높은 구조적 이질성을 나타낸다. 따라서 추출 및 분석 방법은 다른 지질 범주에 맞게 조정되며 일반적으로 뚜렷한 조직 샘플에서 수행됩니다.2. 산탄총 리피도믹 방법3 막 지질의 광범위한 프로파일을 빠르게 드러내는 우수한 도구이며, 표적 발견 및 정량화 질량 분광 방법에 의해 제공되는 감도와 선택성이 증가하면서: i) 염증지질 및 ii) 지질을 포함하는 낮은 풍부한 신호 지질의 조사를 위해 자본화되어 있습니다. 등.4,5. 신경 질환 모델의 뇌 영역에서 발생하는 세포막 및 신호 수준 모두에서 지질 변화를 포괄하기 위해, 전형적으로 지질 추출 및 분석은 뚜렷한 조직 샘플에서 수행되며, 뚜렷한 동물 배치 또는 다른 반구로부터 얻어지거나, 더 큰 조직 영역을 여러 조각으로 해부함으로써 수행된다. 효소 수용체의 mRNA 수준이 또한 관심있는 때, 그들의 조사는 일반적으로 명백한 조직 견본의 조달을 요구합니다. 예를 들어, 막 지질, 내인성 카나비노이드 및 mRNA의 조사는 3개의 다른 조직 샘플(예를 들어, 2개의 지질 추출 방법-막 지질 및 신호 지질에 대한 2개의 샘플-및 mRNA 분석을 위한 1개의 샘플)을 요구할 것이다. 염증성 지질 및 내인성 카나비노이드에 대한 조사는 각각 두 가지 조직 샘플, 추출 방법 및 분석 방법을 필요로합니다. 또 다른 예는 mRNA와 뇌 펀치 또는 레이저 미세 절 샘플에서 임의의 지질 범주의 조사로, 결과적으로 뇌 (하위) 지역 당 두 개의 샘플을 조달하기 위해 두 개의 별개의 동물을 필요로합니다. 결과의 가변성 및/또는 나쁜 재현성의 상당한 정도는 생물학적 가변성 및/또는 조직 이질성에서 기인하는 그러한 경우에 자주 발생합니다. 특히 뇌의 높은 공간 해상도에서 발생하는 다분자 분석의 이러한 실질적인 한계에 의해 유도된 3모듈 신경지질학 프로토콜은 염증지질의 LC/MRM(예를 들어, eicosanoids(eiC)에 의한 코추출 및 공동 분석을 포괄하도록 설계되었으며, eCB와 같은 뉴런 활동의 변조에 관여하는 지질2; 2) 후속 멀티스캔 LC/MRM 및 전구체/중립 손실 스캔 분석을 통해 인지질(PL) 및 ECB의 공동 추출2; 및 3) 후속 LC/MRM 및 qPCR 또는 RNA 염기서열 분석과 함께 막(인)과 eCB뿐만 아니라 mRNA의 이중 추출6. 신경질환과 관심있는 뇌 영역에서 다루어야 할 생물학적 질문에 따라, 제1 및 제2 프로토콜의 조합, 또는 제 1 및 제 3 프로토콜의 조합은 약 4 mg의 조직을 위한 동일한 조직 표본에 적용될 수 있다. 첫 번째 및 세 번째 프로토콜은 약 2 mg의 조직에 독립적으로 적용할 수 있습니다. 두 번째 프로토콜은 0.5 mg의 무게 조직에 적용할 수 있습니다. 선택된 신경지질성 프로토콜 모듈에 관계없이, 조직 샘플링 및 사전 분석 처리, 뇌 격리 및 영역 해부뿐만 아니라 동물 모델을 희생하는 절차는 프로토콜의 세 모듈 모두에 대해 표준화되고 동일하다. 신경 질환에 대한 우리의 조사에서, 질병의 병리학적 결과에 관련있는 말초 기관은 항상 이러한 모듈형 프로토콜을 사용하여 수집및 분석됩니다. 또한, 혈액은 정기적으로 플라즈마 리피도믹스를 위해 샘플링되어 미래의 번역 응용 분야에 대한 견해를 가진 신경 질환의 판독 도구로 사용됩니다. 여기에 제시 된 모듈식 리피도믹스 프로토콜은 매우 다재다능합니다 : 더 큰 조직 양으로 확장 가능하고 거의 모든 조직 유형및 질병에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 모듈식 프로토콜의 적용을 위해(그림 1)) 신경질환에서는 외상성 뇌손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질 등 신경질환의 발병 및 진행의 표준화된 설치류 모델이 가능하다.
이러한 프로토콜은 kainic acid (KA)유도 마우스 모델인 간질의 급성 단계에서 조직 립피돔 및/또는 전사체의 변화를 연구하기 위해 광범위하게 적용되었으며, 인간 측두엽 간질(TLE)과 유사하기 때문에 전임상 연구에서 널리 사용되는 모델이다.8,911.11. 이러한 프로토콜을 이용하여, 팔미토일레탄올라미드(PEA)12,13과 같은 약물의 치료 잠재력은 간질의 동일한 마우스 모델에서 평가되었다. 이 연구는 뇌와 주변의 높고 낮은 공간 해상도에서 지질 및 mRNA 의 변화를 확인, 최대 급성 발작 강도의 시점에서 (60 분 발작 유도), 4 개의 다른 시점에서 완두콩과 과급성 및 급성 치료에 (20, 60, 120, 180 분) 후 KA 발작 후 급성 시간 감이, 시간 감전. 치료되지 않은 KA 주입 마우스의 플라즈마, 뇌 및 말초 기관, 급성 및 하위 완두콩 처리 마우스뿐만 아니라 차량 및 완두콩 차량 제어 마우스는 매 시점 12,13에 수집되었으며, 이러한 분자 분석을 통해 조사하였다. 분자 데이터는 급성 간질 단계및 PEA의 잠재력의 진행을 해명하기 위해 발작 점수에 의해 얻어진 행동 표현형뿐만 아니라 신경 퇴행성 과정에 대한 면역 조직화학 유래 데이터와 상관관계가 있었다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 실험 절차는 2010년 9월 22일(2010/63EU)의 유럽 공동체 위원회 지침에 따라 독일 라인란트 팔츠 주 지역 동물위원회의 승인을 받았습니다(파일 참조: 23 177-07/G16-1-075).
1. 급성 및 예방 치료 KA 유도 간질의 동물 모델
- 발작 유도, 치료 및 행동 점수를 수행합니다.
- 단일 케이지에서 분리 마우스(최소 n = 그룹당 6마우스).
- 발작 유도 주입 용액 및 해당 차량( 표 1 참조)과 치료 사출 용액 및 해당 차량을 준비합니다( 표 2 참조).
- 그들의 그룹 정체성에 따라 마취 없이 마우스 내회(즉, 10mL/kg 마우스 체질량)를 주입합니다: 질병, 치료 또는 차량 치료(즉, KA, PEA 처리된 KA 및 2개의 차량 그룹). 그림 2, 표 1 및 표 2를 참조하십시오.
- 다음 표준화된 발작 강도 척도에 따라 동작을 모니터링하고 점수를 매는 다: 0 = 응답 없음; 1 = 부동성 및 응시; 2 = 앞다리 및/또는 꼬리 확장, 경직된 자세; 3 = 반복적 인 움직임, 머리 보빙; 4 = 사육 및 낙하; 5 = 연속 사육 및 낙하; 6 = 심한 클로닉 토닉 발작; 7 = 데스14,15 (그림 3).
- 리피도믹 및 전사 분석을 위한 희생 절차를 수행합니다.
- 4개의 시점에서(즉, 20, 60, 120 및 180분 포스트 KA-또는 차량 주입) 각 그룹에서 6개의 마우스를 희생합니다: 완두콩 처리, 완두콩 처리되지 않은 간질 차량 1, 및 차량 2, IACUC 승인 프로토콜에 따라.
- 매 시간 점에 도달 한 후 10 초, 유리 챔버에서 이소플루란 에 젖은 조직을 사용하여 마우스를 마취. 유리 챔버를 천천히 뒤집으면서 움직일 수 없음으로 표시된 오른쪽 반사반사의 손실로 마취를 확인합니다. 외과 가위를 사용하여 쥐를 참수하고 플라즈마, 뇌 및 말초 장기를 수집합니다 (단계 2.2.2-2.2.4 참조).
주의: 희생 절차에 대한 윤리 규정은 지역 동물 위원회마다 다릅니다. 지역 동물 위원회가 발행한 규정을 확인하고 준수해야 합니다.
- 면역히스토화학 분석을 위한 희생 절차를 따르십시오.
- 면역조직화학 염색13의 경우, 완두콩 처리, 완두콩 처리되지 않은 간질 및 차량 그룹( 전체 시간 과정(180분)에서 행동적으로 다음 각 그룹에서 3개의 마우스를 득점한다.
- 5 일 후 마우스를 희생하고 퍼퓨즈하십시오. 심층 마취 마우스 (마우스 그룹에 대 한 단계 1.3.1 참조) i.p. 펜토 바르 비탈의 주입 (100 mg/kg) 및 buprenorphine (0.1 mg/kg) 마약 약물로. 발가락 사이의 반사의 손실에 의해 깊은 마취를 확인합니다.
- 폴리스티렌 플레이트에 마우스를 고정하고 즉시 미세 가위와 표준 집게를 사용하여 흉부를 엽니 다. 왼쪽 심장 심실에 나비를 설정하고 미세 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 잘라.
- 펌프의 속도와 압력을 2-3mL/min의 속도로 일정한 연동 흐름으로 조정합니다. 얼음 차가운 인산염 완충식식염(PBS)을 ~5분 동안 퍼퓨즈합니다. 필요한 경우 나비를 교체하십시오.
참고 : 적절한 관혈으로 내부 장기 (비장을 제외한)는 1 -2 분 이내에 표백하기 시작합니다. - -5 분 동안 얼음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션으로 관류를 전환합니다. 단계 2.2.2에 설명된 대로 전체 뇌를 분리하고 4°C에서 4% PFA 용액에서 24시간 동안 수정합니다.
- 4°C에서 48h용 30% 자당 용액으로 뇌를 배양한다. 마른 조직 종이로 남은 자당을 제거하고 금속 판 (-80 °C)에 뇌를 동결. 염색 절차를 위해 뇌를 -80 °C에 저장13.
2. 리피도믹/전사 분석을 위한 샘플링 절차
- 샘플링을 준비합니다.
- 플라즈마 샘플링을 위한 사전 냉각 EDTA-튜브를 4°C로 샘플링합니다. 원심분리기 및 소용돌이 장치를 4°C로 미리 식힙니다. 건조 얼음 (-80 °C)에 알루미늄 호일로 덮여 금속 판을 미리 식힙니다 (냉동 뇌 및 / 또는 관심의 다른 조직을 스냅). 플라즈마 알리쿼트, 냉동 조직 및 뇌 수집을 위해 드라이 아이스(-80°C)에 2mL 및 5mL 튜브를 미리 냉각시합니다. 호박색 튜브를 사용하여 eI와 같은 빛에 민감한 분자를 보호합니다.
- 조직 샘플링 및 격리 장비(수술 용 가위, 직선 미세 가위, 직선 매끄러운 표준 집게, 거울 마감, 곡선 집게 및 주걱, 폴리스티렌 폼 플레이트 및 고정바늘이 있는 미세한 집게, 폴리스티렌 폼 플레이트 및 고정바늘)을 소독제로 청소하십시오(예: 70% 에탄올).
- 샘플링 프로토콜
- 샘플링 순서를 결정합니다.
- 미리 냉각된 1mL EDTA 튜브에서 참수 직후 혈액을 수집합니다(2.2.3단계 참조).
- 전체 뇌를 제거하고 제거 직후 동결을 스냅합니다. 이 단계는 1-2 분 정도 걸릴 것입니다. 추가 처리를 위해 -80 °C에 냉동 된 두뇌를 저장합니다 (2.2.2 단계 참조).
- 관심있는 주변 장기 (예 : 폐, 심장, 간)를 제거하고 5 분 이내에 뇌 제거를 제거하고 추가 처리를 위해 -80 °C에서 고정 및 저장하십시오 (단계 2.2.4 참조).
- 해부 또는 펀칭 절차에 대 한 뇌를 제거 합니다. 이 절차는 1-2 분 / 뇌를 취합니다.
- 참수 후 (단계 1.2 참조), 미세 가위를 사용하여 피부에 중간 절개를 만들기 시작합니다. 눈 위로 피부를 뒤집어 두개골을 풀어. 두개골 의 상단에 도달하고 함정 뼈의 수준에서 시작하는 작은 caudal 절개를합니다. 뇌를 절단하지 마십시오.
- 눈 사이에 두개골의 가장 앞쪽 부분을 단단히 잘라 뇌 제거를 용이하게합니다. 구부러진 좁은 패턴 집게를 사용하여 정수리 뼈의 한쪽을 기울이고 끊습니다. 다른 쪽의 마지막 단계를 반복합니다.
- 뇌 수막을 제거합니다. 뇌의 전방 부분(즉, 후각 전구)에서 주걱을 밀어 내고 뇌를 부드럽게 위쪽으로 기울입니다. 주걱을 더 아래로 밀어 광학 및 기타 두개골 신경을 분해합니다.
- 두개골에서 뇌를 들어 올리고 스냅은 금속 판 (등쪽 업)을 향한 복부 면이있는 미리 냉각 된 (-80 °C) 금속 판에 즉시 전체 뇌를 얼립니다.
- 뇌가 완전히 동결및 미리 냉각된 5mL 튜브로 옮기고 뇌 영역의 해부 또는 펀칭 시술까지 -80°C에 저장하도록 허용합니다(단계 3.1 및 3.2).
- 플라즈마 샘플링을 수행합니다.
- 스파이크는 10 μM의 목표 농도로 갓 준비된 10 μL의 EDTA-튜브를 미리 냉각시켰다.
- 몸을 부드럽게 압박하여 참수 직후 에쓰-1mL의 최대 혈액 부피로 몸을 부드럽게 압박하여 트렁크 혈액을 수집합니다.
참고: 적절한 혈압의 경우 압박이 필요하지 않습니다. 혈액 부피가 1mL 미만인 경우 적절한 혈류를 가능하게하기 위해 이소플루란 인큐베이션 시간을 줄입니다. - 즉시 원심 분리 혈액 튜브에 2,000 x g 에 10 분 4 °C에서.
- 생성된 상부 플라즈마 위상을 제거하고 다음과 같이 미리 냉각된 2mL 튜브에서 정의된 다중지질 분석 알리쿼트(aliquot)를 목적으로: eCB/eiC 분석을 위한 50μL, PLs 분석을 위한 30μL, 그리고 나머지 플라즈마 부피가 백업 샘플 또는 다른 유형의 분석으로.
- 플라즈마 샘플을 추가 추출을 위해 -80°C에 저장합니다(4.1.2 단계 및 4.1.4 단계 참조).
- 주변 기관 샘플링을 수행합니다.
참고: 마우스 해부학 참조16 및 동물 조사자가 참석한 의무 과정(FELASA)에 제공된 문서를 사용하여 개별 장기, 결합 조직 및/또는 혈관을 식별합니다.- 바늘을 사용하여 장기 제거를 용이하게하기 위해 마우스 몸통을 고정. pubis 높이에서 직선 날카로운 가위를 사용하여 복부 중간 선 절개를합니다. 무딘 표준 집게를 사용하여 복강을 열도록 절단하는 동안 복벽을 고정하십시오.
- 무딘 집게를 사용하여 복부 기관 제거를 허용하기 위하여 피부를 움직이지 않습니다. 심장 또는 폐 제거를 위해 유방 동굴 방향으로 내측 절단을 계속하십시오. 미세 한 집게를 사용 하 여 폐 및/또는 심장을 제거 합니다.
- 출혈을 피하기 위해 유방 구멍을 조심스럽게 엽니다. 장기를 절단하지 않고 각 장기를 고정 결합 조직과 혈관을 잘라.
- 미리 냉각된 금속 판(-80°C)에 즉시 티슈 조각을 옮기고 완전히 동결할 수 있습니다. 조직 조각을 미리 냉각된 튜브로 옮기고 -80°C에 저장하여 추가 처리를 위해(4.1단계 참조).
- 샘플링 순서를 결정합니다.
3. 생물학적 재료 처리
참고: eCB/eiC의 공동 추출을 위해 2mL 호박관을 추출 튜브로 사용하고 각 튜브에 7개의 미리 냉각된 강철 공을 추가합니다. PLs/ECB의 공동 추출과 이중 지질 및 RNA 공동 추출을 위해 세라믹 구슬(재료 표)으로 스파이크된 RNA 가없는 추출 튜브 2mL을 사용하십시오.
- 뇌 해부 및 주변 장기 처리를 수행합니다.
참고: 돋보기 램프를 사용하여 해부에 대한 뇌의 가시성을 높입니다.- 슈퍼 미세 한 팁과 집게를 포함 하 여 수술 도구를 청소, 2 x 와 70% 에탄올.
- 냉동 뇌를 -80°C에서 미리 냉각된 생리적 완충액(pH 5.5)을 함유한 페트리 접시로 옮기면 페트리 접시가 4°C에 있는지 확인합니다. 뇌가 완전히 동결 해제되어 해부를 허용하십시오. 집게를 사용하여 신중하게 테스트합니다.
주의: 해빙에 필요한 것보다 뇌를 4°C 이상 유지하지 마십시오. - 얼음(4°C)에 금속판을 미리 식히고 얼음냉이 생리완(pH 5.5)에 담근 젖은 조직으로 덮고, 뇌를 얼음 위에 미리 냉각된(4°C) 금속판에 조심스럽게 올려놓습니다. 얼음 차가운 생리완충(pH 5.5)에 담근 젖은 조직으로 덮습니다.
- 슈퍼 미세 팁 집게를 사용하여 최대 5 분 이내에 뇌 영역을 해부합니다. 시상 하부 (HYP)로 시작하고 오른쪽으로 진행하기 위해 등쪽을 위로 설정합니다. 해마 (HCr), 전두엽 피질 (PFCr), 스트트리아툼 (STR), 대뇌 피질 (cCTXr)을 분리합니다. 그런 다음 왼쪽을 해부합니다. 해마 (HCl), 전두엽 피질 (PFCl), 스트트리아툼 (STRl), 대뇌 피질 (cCTXl)을 분리합니다. 소뇌와 탈라믹 부위를 해부한다. 뇌 영역 식별을 위해 출판 된 해부학 적 참조16,17을 사용합니다.
- 알루미늄 호일 덮인 미리 냉각된 금속 판(-80°C)에 직접 해부된 각 조각을 전달합니다. 표지된 2mL 튜브에서 격리된 뇌 영역을 동결하고 이송할 수 있습니다.
- 조직의 해동을 피하면서 조직 분쇄기(-80°C)를 사용하여 조직 조각을 분쇄합니다. 차가운 방에서, 세라믹 구슬 이나 강철 공을 포함 하는 라벨, 미리 냉각 추출 튜브에 알리 쿼트 조직 분말. 이중 리피도믹스/전사학 분석을 위해, 차가운 방에 있는 조직 분말 알리쿼트의 무게를 달아라. 리피도믹스 전용 분석의 경우 조직 중량 또는 단백질 함량으로의 정상화 중에서 선택하십시오. 후자의 경우, 조직 계량없이 더 진행하십시오.
- 20 mg의 최대 무게로 말초 장기 조직을 조각으로 잘라냅니다. 3.1.6 단계에서와 같이 조직 분쇄를 진행합니다.
- 조직 샘플의 추출을 진행 (단계 4.1.1, 4.1.3, 또는 4.1.5) 또는 나중에 추출을위한 -80 °C에서 튜브를 저장합니다.
참고: 연구 설계가 허용하는 경우 뇌 매트릭스도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 이산 및 제한된 수의 뇌 영역에 더 적합하며, 설정된 시간 내에 위에서 언급한 모든 뇌 영역을 해부하고 격리하는 것은 실용적이지 않다.
- 뇌 펀칭을 수행합니다.
- 냉동 된 뇌 전체를 냉동 된 뇌를 냉동 된 마운스트 (재료 표)에 장착하십시오. 두께를 50 μm로 설정하고 관심 영역과 가까운 트림 모드로 슬라이스합니다.
- 토루이딘 블루(0.1%-1%)를 이용한 스테인 브레인 브레인 슬라이스(18-20 μm)는 관심 있는 하위 영역을 국소화하는 기준이다. 현미경을 사용하여 얼룩진 조각을 검사하여 주먹으로 관심 있는 영역을 식별합니다. 마우스 아틀라스를 참조로 사용하여 적절한 뇌 해부학 영역을 찾습니다16. 미리 냉각된 튜브의 샘플 코러스를 사용하여 직경 0.8-1.0mm의 펀치를 사용하십시오.
- 세라믹 구슬이나 강철 공이 들어있는 2mL 추출 튜브로 표시된 콜드 룸에서 냉동 펀치의 무게를 측정합니다. EC및 eIC 공동 추출에 호박튜브를 사용합니다.
- 추출을 시작 (단계 4.1.1, 4.1.3 또는 4.1.5) 또는 추가 추출을 위해 -80 °C에서 튜브를 저장합니다.
- 플라즈마 처리를 수행합니다.
- 얼어붙은 플라즈마 샘플을 얼음(4°C)에 놓고 해동(~20분)합니다.
- 추출을 시작하기 전에 플라즈마가 완전히 고정되지 않았는지 확인합니다.
- 플라즈마 추출 절차를 진행합니다(4.1.2 또는 4.1.4 단계 참조).
참고: 플라즈마 샘플은 추출될 때까지 -80°C에 머물러야 합니다. 해동 및 동결주기를 피하십시오.
4. 추출 절차
- 액체 액체 (LLE) 지질 공동 추출 프로토콜을 수행합니다.
- 뇌 조각, 펀치 또는 조직 분말 샘플에서 EC및 eIC의 공동 추출을 수행합니다.
참고: 절차 전반에 걸쳐 정확한 파이펫팅이 필요합니다.- 조직 샘플과 7개의 강철 공을 포함하는 추출 튜브를 얼음(4°C)에 놓습니다. 내부 표준을 포함하는 얼음 차가운 MTBE 600 μL과 ACN/H2O(1:1; v/v)의 50 μL을 추가합니다. 분석(50 μL)에 대한 최종 부피에서 내부 표준의 표적 농도는 다음과 같습니다: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; 완두콩-d4, 12.5 ng/mL 1-AG-d5, 2.5 ng/mL PGF2α-d4 및 PGD2-d4용 5 ng/mL; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 각각 20-HETE-d6 및 TXB2-d4.
- 0.1M 포름산의 400 μL을 추가하고 티슈 서(30 s-1분)로 균질화합니다. 원심 분리기 4 °C에서 5,000 x g 에서 15 분 동안 동종. -80°C에서 10분 동안 수성 하층의 동결을 허용하여 상부 유기상의 전달을 용이하게 한다.
- 새로운 튜브에서 유기 상을 전송합니다. 37°C에서 N2 의 부드러운 스트림 하에서 증발하고 추가 분석을 위해 ACN/H2O(1:1; v/v)의 50μL로 재구성합니다.
- 추가 단백질 함량 분석을 위해 수성 상을 -20°C 또는 -80°C에 저장합니다.
- 플라즈마 샘플에서 EC및 eI의 공동 추출을 수행합니다.
- 4 °C에서 플라즈마 알리코를 해동하십시오. MTBE의 800 μL과 내부 표준을 포함하는 ACN/H2O(1:1; v/v)의 50 μL을 추가합니다(조직 분석에 사용되는 것과 유사하며, 단계 5.1.1참조). 레퍼런스 플라즈마 샘플을 사용하여 스파이크에 대한 내부 표준 농도를 최적화합니다.
- 0.1M 포름산및 소용돌이 시료 600μL을 4°C에서 2분 동안 추가합니다. 원심분리기 샘플은 4°C에서 15분 동안 4,000 x g 에서 샘플링합니다.
- 유기상을 새로운 튜브로 옮기고, 37°C에서 N2 의 부드러운 스트림 하에서 증발하고, LC/MRM 분석을 위해 50 μL의 ACN/H2O(1:1; v/v)로 재구성한다.
참고: 가능하면 말린 eiC 추출물을 보관하지 말고 LC/MRM 분석으로 즉시 진행하십시오. 저장을 피할 수 없는 경우 LC 사출 용매의 샘플과 함께 4° C에서 2-3일 동안만 짧은 저장에 의존하십시오.
- 뇌 영역, 펀치 또는 기타 조직 분말 샘플에서 PLs 및 ECB의 공동 추출을 수행합니다.
- 조직 샘플및 세라믹 구슬을 포함하는 추출 튜브를 얼음(4°C)에 놓습니다. MTBE/MeOH(10:3; v/v) 및 내부 표준을 포함하는 MeOH의 10 μL을 추가합니다. 분석(100 μL)에 대한 최종 부피에서 내부 표준의 목표 농도는 다음과 같습니다: PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; 추신수 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 및 3 ng/mL PEA-d4 각각.
- 25 μM 테트라하이드로립스타틴/URB597 및 50 μg/mL BHT를 함유한 0.1% 포름산의 200 μL을 추가합니다. 조직 균질화제(재료표) 및 원심분리기는 5,000 x g , 4°C에서 15분 동안 균질화한다.
- 새로운 튜브에서 상부 유기 상을 복구하고 37 °C에서 N2 의 부드러운 스트림에서 증발. MeOH의 90 μL로 재구성하고 -20°C 또는 -80°C에 저장하거나 다음 단계를 진행한다.
- 지질 추출물(4.1.3.3)의 알리쿼트에 10% H2O를 추가하고 LS 분석을 위해 LC/MS에 10 μL을 주입한다. 추가 eCB 분석을 위해 4.3.5 단계를 진행합니다.
- 추출물(4.1.3.3)의 알리쿼트(4.1.3.3)를 취하고, ACN/H2O(1:1; v/v)에서 건조하고 재구성하기 위해 증발한다. eCB 분석을 위해 LC/MS 주입에 20 μL을 사용하십시오.
- 플라즈마 샘플에서 PLs 및 ECB의 공동 추출을 수행합니다.
- 4°C에서 플라즈마 알리쿼트해, MTBE/메탄올 1,000μL(10:3; v/v) 및 내부 표준(4.1.3단계과 유사)을 포함하는 10 μL MeOH를 추가하고 1분 동안 4°C에서 소용돌이를 함유한다.
- H2O의 250 μL과 4 °C에서 45 분 동안 소용돌이를 추가하십시오. 원심분리기 샘플은 5,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 샘플링됩니다. 상부 유기 상을 복구하고, 37°C에서 N2의 부드러운 스트림 하에서 증발하고, 추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올의 90 μL로 재구성한다. -20°C 또는 -80°C에 보관하거나 다음 단계로 진행하십시오.
- PLs 분석을 위해 지질 추출물(4.1.2.2)의 알리쿼트에 10%의 물을 추가합니다.
- eCB 분석을 위해 지질 추출물의 알리쿼트에 10%의 물을 추가하고(4.1.4.3 참조), 건조로 증발하고 50% ACN/H2O(1:1; v/v)로 재구성합니다.
- 조직 샘플에서 RNA 및 지질(PLs 및 eBC의 공동 추출)의 이중 추출을 수행합니다.
주의: RNA 의 저하를 피하기 위해 RNA가 없는 조건에서 작동하도록 하십시오.- 해동 조직 분말 알리쿼트 또는 뇌 다발 (4 °C에서) 5 μM THL / URB597, 10 μg / mL BHT, 1 % β -mercaptoethanol을 포함하는 RLT 버퍼의 600 μL을 추가 (균질화 완충의 최종 볼륨의 백분율에 대한, 200 μL 의 추출 및 추출 에 단계 4.1)와 함께.
- PLs 및 eCB 공동 추출을 위한 10 μL의 내부 표준 혼합물을 가진 스파이크 샘플(단계 4.1.3 참조) 조직 균질화(고속, 20s)를 통해 균질화한다.
- 리세이트를 새로운 원심분리기 튜브및 원심분리기로 최대 속도 5분, 상 분리를 가능하게 하는 4°C로 이송한다.
- 표준 RNA 추출 절차 키트(재료 표)를 사용하여 RNA 추출을 위한 상층을 회수하고 사용합니다. Elute RNA는 RNase가 없는 물의 총 부피 50 μL로 - 80°C에 저장합니다.
참고: 4.1.5.4 단계의 샘플은 적절한 방법 및 계측을 사용하여 RNA 시퀀싱 및 qPCR 모두에 대해 가능합니다. - 지질 추출을 위해 하부 클로로폼 함유 단계를 사용합니다. MTBE/메탄올(10:3; v/v) 800 μL과 4°C에서 45분 동안 0.1%의 포름산과 소용돌이의 200 μL을 추가합니다. 상부 유기 상을 복구하고 37 °C에서 N2 의 부드러운 스트림에서 증발.
- 추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올의 90 μL로 재구성합니다. -20°C 또는 -80°C에 보관하거나 5단계로 진행하십시오.
- 지질 추출물의 알리쿼트에 10% H2O를 추가하고(위의 단계 4.1.5.6 참조) LS 분석을 위해 LC/MS에 10 μL을 주입합니다. 추가 eCB 분석을 위해 5.7 단계를 진행합니다.
- 추출물의 알리쿼트(위 단계 4.1.5.6 참조)를 사용하여 ACN/H2O(1:1; v/v)에서 건조및 재구성으로 증발합니다. eCB 분석을 위해 LC/MS 주입에 20 μL을 사용하십시오(4.3.5 단계와 유사).
- 뇌 조각, 펀치 또는 조직 분말 샘플에서 EC및 eIC의 공동 추출을 수행합니다.
5. LC/MRM 정성적 및 정량적 프로파일링
- LC 용매 시스템, 교정 솔루션 및 품질 관리 샘플을 준비합니다.
- PLs의 경우, 이동상 A: 메탄올/물(1:1; v/v)에 7.5mMM 암모늄을 함유하고 0.1% TEA를 준비한다. 이동상 B 준비: 메탄올/이소프로판올(2:8; v/v)은 7.5mM 암모늄과 0.1% 차를 함유하고 있다. LC 병에 용매를 보관하십시오.
- eCB 및 eiC 분리의 경우, 다음 LC-용매를 준비: 0.1% 포믹산 모바일 상 A로, 100% ACN은 0.1% 포믹산을 함유하고 있으며, 100% ACN은 LC 병에 용매로서 0.1%의 포믹산을 함유하고 있다.
- 교정 표준 및 내부 표준(표 3)을 사용하여 저구또는 사용자 정의 농도로 품질 제어를 준비합니다.
- 7개의 농도 점으로 교정 곡선을 준비합니다. 동일한 내부 표준 배치를 사용하여 캘리브레이션 곡선 솔루션과 분석할 샘플에서 스파이크합니다.
- LC-MRM 방법을 사용하여 질적 및 정량적 지질 프로파일링을 하십시오.
- 상용 소프트웨어(예: 분석가)에서 빌드 획득 방법 탭을 열고 극성 전환이 있는 LC/MRM 모드를 선택합니다. 정량 프로파일링을 위해 이온 전환( 표 3에 지정된 대로)을 메서드에 설정합니다. 정착 시간을 50ms로 설정합니다.
- PLs 프로파일링의 경우 다음 이온 소스 매개 변수를 설정합니다: 커튼 가스 = 40 psi; 소스 히터 온도 = 550 °C; 이온 스프레이 전압 = -4,500 V 음이온 모드 및 = 양성 이온 모드에서 +5,200 V.
- ECB 및 eIC의 공동 분석을 위해 커튼 가스 = 40 psi; 소스 히터 온도 = 550 °C; 이온 스프레이 전압 = -4,500 V 음수 이온 모드 및 = 양성 이온 모드에서 +4,500 V.
- PL 분석을 위해, 기둥 가열을 45°C로 설정하고 유량은 200 μL/min으로 설정하고 다음 그라데이션을 설정합니다: 최소 0 = 40% B; 최소 3 = 40% B; 최소 42 = 90% B; 최소 43 = 99% B; 분 50 = 99% B, 분 52 = 40% B. 사출 부피를 10 μL로 설정합니다.
- eBC 및 eIC 분석의 경우, 실온에서 기둥 온도를 설정하고 다음 그라데이션을 설정합니다: 최소 0 = 20% B; 최소 1 = 20% B; 최소 5 = 50% B, 최소 12 = 50% B; 최소 13 = 90% B, 최소 17 = 90% B; 최소 17.5 = 20% B; 분 20 = 20% B. 사출 부피를 20 μL로 설정합니다.
참고: MRM 조건은 기악 플랫폼마다 다를 수 있으므로 단편화 및 MRM 조건은 실험적으로 추론되어야 하며 최대 감도 및 선택성을 얻기 위해 필요한 경우 이온화 매개 변수를 테스트하고 조정해야 합니다.
- 일괄 분석을 수행합니다.
- 빌드 수집 배치를 열고 샘플 설명에 필요한 매개 변수, 자동 샘플러의 샘플 랙의 위치 및 수집 방법(단계 5.2로 설정)을 입력합니다.
- 항상 분석의 시작과 끝에 및 배치 내에서 품질 관리를 포함합니다. 매 25-30 샘플 후, 배치 내에서 적어도 세 개의 교정 곡선을 포함하고 모든 품질 관리 샘플, 교정 곡선 및 샘플 배치의 끝에 후 선택의 용매와 세척 단계를 포함한다.
- LC/MS 바이알의 4단계에서 얻은 샘플을 전송합니다. 배치에 정의된 위치에 따라 LC 자동 샘플러의 로딩 랙에 샘플을 배치하고 LC 자동 샘플러에 샘플 랙을 로드합니다.
- 일괄 처리를 제출하고 큐 분석을 시작합니다.
- 지질 정량화
- PLs 정량화에 대한 상용 소프트웨어(예: 분석가)와 EIC 정량화 및 상용 소프트웨어(예: 멀티퀀트)에 대한 임베디드 정량화 모듈을 사용합니다.
참고: 두 번째 소프트웨어는 특히 여러 분석물의 정량화에 하나의 내부 표준을 사용하는 경우 EC및 eIC에도 사용할 수 있습니다. - 개방형 빌드 정량화 방법을 열고 내부 표준, MRM 전환에 대한 매개 변수를 채우고 내부 표준을 정량화할 별립에 대한 결과물(표 3). 최소 피크 높이를 500 cps로 설정합니다.
- 지질 정체성 할당 및 후속 정량화6에 대한 다음 기준 또는 조합을 사용하십시오: 교정 표준과 지질 내인성 분석물의 보존 시간 매칭, 및/또는 유정된 내부 표준이 가능한 경우; 표준이 제공되지 않는 지질 분석물의 주어진 m/z에 대한 양수 및 음수 이온 모드 단편화에 의해 일치하는 조각 이온; 유사하게 사용되는 LC 조건하에서 지질의 문학 유추형 용출 거동은 이소성 및/또는 동소근 구조를 해부합니다. 그리고, 가능한 경우, 고해상도 질량 분석법으로 LC/MS 및 MS/MS 분석, 유사한 LC 조건을 사용하여 표적 분석(LC/MRM 사용), 관심 있는 내인성 지질의 신원 및 용출 거동을 정확하게 식별18,19.
- 일괄 분석의 유효성 검사에 대 한 다음 기준을 사용 하 여: 정량화의 정확도 ≤ ±20%; 회귀 계수 ≥0.97 (이상적으로 ≥0.99).
참고: 생체 분석 방법 개발 및 유효성 검사에 대한 지침을 따르면 표적 분자의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 분석을 보장합니다.
- PLs 정량화에 대한 상용 소프트웨어(예: 분석가)와 EIC 정량화 및 상용 소프트웨어(예: 멀티퀀트)에 대한 임베디드 정량화 모듈을 사용합니다.
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Representative Results
기술 된 프로토콜의 집합은 동물 모델의 선택, 샘플링 경로, 추출 및 프로파일링 방법과 같은 목표 특정 방식으로 상이한 수준에서 결합 될 수있다 (그림 1).
급성 간질 발작 상태의 시간 과정 동안 뇌와 주변의 지질 수준 변화를 결정하고 완두콩의 잠재적 인 항 간질 효과를 해명하기 위해13 뇌와 주변의 립피돔 변화에 미치는 영향, 세 가지 실험 동물 그룹은 차량으로 치료되었다, KA 급성 간질을 유도하기 위해, 및 PEA는 항질 약물 후보로. 완두콩은 KA-주입 전에 i.p.p.를 통해 투여되었다(예를 들어, 급성 치료를 위한 단일 완두콩 주사와 아만성 치료를 위한 2개의 완두콩 주사). 다중 분자 분석 및/또는 면역히스토케토화학 염색을 치료 후 5일 동안 의목적으로, 동물 실험은 필요에 따라 반복되었다(도 2).
급성 간질 발작의 KA 유도는 최대 발작 강도 1h 후 주사15로 이어집니다 (도 3). 최대 발작 강도의 상태에서 뇌와 말초 지질 수준 변화를 해명하기 위해, 마우스는 플라즈마, 뇌 및 말초 기관 샘플링 다음 1 h 포스트 KA 주사에서 희생되었다. 냉동 된 뇌는 6 개의 뇌 영역에서 해부되었다 (단계 3.1 참조). 뇌 영역 및 말초 기관(심장 및 폐) 조직은 동질조직 샘플을 얻기 위해 분쇄되었고, 이어서 eCB 및 eiC의 두 개의 리피도믹 프로파일링을 위해 알리인용(도 4A 및 단계 4.1.1) 및 P및 ECB(그림 4B 및 단계 4.1.3).
이중 추출 프로토콜(단계 4.1.5 참조)은 상하하부(HYP), 바칼라상(HYP), 바칼라탈 편도체(BLA) 및 복부(vHC) 및 도르살(dHC) 해마(그림 5)와 같은 다른 영역에서의 뇌 펀치로부터 프로파일링을 통해 더 높은 공간 해상도로 PLs/ECB및 RNA를 수행하기 위해 적용되었다. 1h 후 KA 주사에서 최대 발작 상태에서 KA 유도 간질 마우스 및 대조마우스로부터 (단계 3.2 참조)를 샘플링하였다(도 2).
간질과 완두콩을 가진 새로운 간질 치료에 신경 변성 범위에 지질 변화를 평가하고, 면역히토케컬 이중 염색은 뇌 구간(1.3단계 참조)에서 5일 후 KA 유도 간질 발작(도 2) 후, 아만성 완두콩 치료(가운데), 식염수 주입마우스(왼쪽) (그림 6) ). KA 유도 상태 간질(SE)은 주로 해마의 CA1, CA3 및 힐루스 영역에서 NeuN 신호의 대규모 손실을 발생시켰으며, 대조군(도 6, 왼쪽 이미지)에 비해 caspase-3(CASP3) 신호(도 6, 중간 이미지)로 표시된 세포증과 함께. 수만완두 처리(오른쪽 이미지)는 특히 보존된 뉴런 핵 단백질(NeuN) 신호, 반면(CASP3) 신호는 거의 검출할 수 없다.
| KA- 및 SAL 사출 솔루션. |
| KA 사출 솔루션 (8 mL 최종 볼륨): |
| 1. 15 mL 튜브에서 24 mgKA를 계량 (주의 : 글로테와 마스크를 착용) |
| 2. 10 분 동안 8 mL 식염수와 소용돌이를 추가 |
| 3. 간헐적 저장을 위해 4 °C에서 보관하십시오. |
| 4. 주입 전 실온 및 소용돌이로 재조정 |
| 차량 1 사출 솔루션 (8 mL 최종 볼륨): |
| 1단계를 건너뛰고 2-4단계를 진행합니다. |
표 1: 발작 유도 약물 및 차량 1 응용 프로그램의 준비. 카이닉산(KA) 사출용을 30mg/kg의 최종 농도로 24개의 회대 주사(10mL/kg)에 대비하고 해당 차량 사출 용액(vehicle 1)1을 준비하는 단계.
| 완두콩 및 SAL/DMSO/크레모프터(18:2:1, (v/v/v)) 사출 용액. |
| 완두콩 사출 솔루션 (8 mL 최종 볼륨): |
| 1. 15 mL 튜브에서 32 mg 완두콩을 계량 |
| 2. 0.4 mL DMSO 및 소용돌이를 10 분 동안 추가하십시오. |
| 3. 3.4 mL SAL 및 소용돌이를 5 분 동안 추가하십시오. |
| 4. 36°C에서 5분 동안 소닉세이트 혼합물 |
| 5. 0.4 mL 크레모프터와 소용돌이를 5분 동안 추가합니다. |
| 6. 36 °C에서 1 분 동안 소닉하고 3.4 mL SAL을 추가하십시오. |
| 7. 30 초 소용돌이 와 36 °C에서 3 분 동안 초음파 처리 |
| 8. 주입 전에 셰이커와 소용돌이에서 저속으로 36 °C에서 용액을 유지하십시오. |
| 차량 2 사출 솔루션 (8 mL 최종 볼륨): |
| 1단계를 건너뛰고 2-8단계를 진행합니다. |
표 2: 항간질 제약 및 차량 2 적용의 준비. 팔미토일레탄올라미드(PEA) 사출용을 40mg/kg의 최종 농도로 24개의 복구내 주사(10mL/kg)에 대비하고 해당 차량 사출 솔루션(Vehicle 2)1을 준비하는 모범적인 단계.
| 포지티브 이온 모드 | ||||||
| 선택된 교정 표준 P | 해당 내부 표준 | |||||
| 애일리테 | 전구체 이온 | 제품 이온 m/z | 애일리테 | 전구체 이온 | 제품 이온 m/z | |
| 이름 | m/z | 이름 | m/z | |||
| AEA | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| 완두 | 300.2 | 62.1 | 완두콩 d4 | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| 네거티브 이온 모드 | ||||||
| 선택된 교정 표준 P | 해당 내부 표준 | |||||
| 애일리테 | 전구체 이온 m/z | 제품 이온 m/z | 애일리테 | 전구체 이온 | 제품 이온 m/z | |
| 이름 | 이름 | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-d8 | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-헤테 | 319.48 | 115 | 5(S)-헤테-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-헤테 | 319.48 | 155 | 12(S)-헤테-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-헤테 | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-헤테 | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-헤테 | 319.48 | 231 | ||||
| 20-헤테 | 319.48 | 289 | 20-헤테-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| 추신수 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | 추신수 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| 추신수 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| 추신수 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
표 3: 표적 지질학 분석을 위한 지질 표준 및 MRM 전환. 테이블 콘텐츠는 원래 Lerner 등에서 게시되었습니다.2
그림 1: 워크플로 모듈개요입니다. 연구 목표와 샘플링의 다른 경로에 따라, 추출 및 프로파일링이 결합되어 연구에 중요한 결과를 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 급성 카이닉산(KA)-유도간질 발작 모델의 실험적 설계. 마우스는 1) 식염수 (10 mL/kg i.p.로 처리됩니다); 2) KA (30 mg/ kg i.p.); 및/또는 3) (서브) 만성 전처리 (1-2x 40 mg/kg i.p.) 잠재적인 항질 화합물 팔미토일레탄롤라미드 (PEA). 그룹당 24마리의 마우스가 위와 같이 처리되었고 발작 강도를 평가하기 위한 행동이 득점되었다. 그룹당 6마리의 마우스를 4개의 서로 다른 시점에서 희생하였다(T1−T4)는 뇌, 말초 기관 및 혈장에서 급성 간질 발작 상태의 시간 과정을 통해 지질 수준 변화를 결정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 급성 카이닉산(KA)-유도 간질 대 대조군의 시간 과정을 통해 행동 점수. 평균 행동 점수로 주어진 KA 발작 유도(n =24) 또는 식염수 주입(n =24)의 시간 과정을 통해 발작 강도의 평가. 차량 1과 차량 2 주입 그룹 사이에 는 차이가 발견되지 않았다. 오류 막대 = SEM. ANOVA 반복 측정은 측정의 시간 지점과 테스트 그룹 간의 상당한 상호 작용을 산출하여 KA 치료가 행동 점수에 상당한 영향을 미치는 것을 나타냅니다. KA 처리된 마우스의 발작 강도는 원래 Post et al.13에 간행되었습니다.13 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 급성 간질 발작 상태에서 뇌 및 말초 조직 지질 수준. 최대 발작 강도에서 SEM에 ± 평균 값으로 제시된 지질 수준 변화(예: 1h 포스트 KA 주사) 6개의 두뇌 지구에 걸쳐 (n = 9): 대뇌 피질 (cCTX), striatum (STR), 탈라믹 영역 (THL), 해마 (HC), 시상 하 부 (HYP), 소뇌 (CER), 뿐만 아니라 KA 유도 간질 마우스 (상부 값) 및 제어 (낮은 값)에서 심장과 폐 조직. 조직의 기저 지질 수준은 회색으로 묘사됩니다. PLs, 2-AG 및 AA값은 nmol/g. 및 PMol/g의 NAE, eiCs 및 AEA값에 대한 값으로 각각 제공됩니다. 모든 지질 수준은 조직 무게로 정상화됩니다. 특정 분자 변화를 강조하기 위해, KA 처리된 마우스의 지질 수준은 대조군과 비교하여 급성 발작 강도에서 감소된 값을 표시하는 열맵에서 식염수 주입(KA/sal)의 백분율로 나타내며, 각각 빨간색으로 조절하는 것에 비해 밝은 파란색 및 증가된 수준으로 묘사된다. p값 <0.05에서 중요한 것으로 간주됩니다. 이러한 데이터는 원래 Lerner 등에서 게시되었습니다.2이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스 뇌 펀치에서 정량 프로파일링을 위한 ECBs/PLs 및 RNA의 이중 추출. (A) 시상하부(HYP)의 하위 영역인 선택된 P및 EBC의 정량분포; 2) 바소포탈 편도체(BLA); 및 3) 해마의 복부(vHC) 및 등쪽(dHC) 하위 영역, KA 유도 간질 발작 마우스(upper 값)에서 대조군(lower 값) (n=10). 레벨은 조직 중량으로 정규화되고 (펀치는 약 0.5-1.5 mg에 해당) nmol/g에서 발현된다. 만 AEA는 pmol / g로 표현된다. 지질 수준은 평균 값 ±으로 제시된다 SEM. 펀치 뇌 영역 당 평균 변이 (평균의 백분율로 SEM, 모든 지질을 통해 평균) : HYP = 7.83 %; BLA = 7.80%; vHC = 6.28%; 및 dHC = 각각 7.90%입니다. (B) 지질 신호에 관여하는 내인성 효소 및 수용체의 상대적 발현 수준뿐만 아니라 KA 유도 간질 발작(red) 및 대조군(light grey)을 실시하는 마우스로부터 다른 뇌 영역/하위 영역에서 mRNA 수준에서 조사된 뇌 활동에 대한 마커(light grey). 그룹 수단 간의 차이에 대한 통계 분석은 쌍꼬리를 사용하지 않은 학생의 t-테스트를 사용하여 수행되었으며 p 값 <0.05 (n = 10)에서 유의한 것으로 간주되었습니다. 이러한 데이터는 원래 Lerner 등에서 게시되었습니다.7이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 면역화학적 NeuN 및 CASP3 이중 얼룩. 5일 후 KA 주사 면역히스토케는 치료되지 않은 식염수 주입 마우스(왼쪽), 복종완병 전처리마우스(가운데), 전처리 없이 간질 마우스(오른쪽)로부터 뇌 단면도에서 수행되었다. 완두콩 전처리는 치료되지 않은 간질 마우스 (n = 3)에 비해 신경 보호 효과를 보여줍니다. 이러한 데이터는 원래 Post et에 게시되었습니다. al.13 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 신경 지질도혈 및 전사 방법론은 뇌 및 말초 장기의 높고 낮은 공간 해상도에서 질병이나 건강한 발달을 조사하는 실행 가능한 의미입니다. 최적화된 플라즈마 샘플링 및 취급 절차로 인해 혈장 리피도믹 분석은 조직 리피도믹스 및 전사학을 위해 희생된 동일한 동물로부터 수행될 수 있으므로 조직 혈액 분자 상관관계 및 바이오마커 발견의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다. 3개의 프로토콜 또는 그 조합 중 하나를 적용하여 광범위한 데이터 세트를 제공하면 컨텍스트(동물 모델 실험) 내의 신경 질환뿐만 아니라 실험 모델 컨텍스트 를 가로질러 사이를 조사하는 것이 가치가 있습니다. 더욱이, 샘플링, 처리 및 분자 분석의 높은 수준의 표준화는 분자 데이터의 높은 재현성을 용이하게 하므로 연구 와 실험실 내의 분자 변화를 안정적으로 참조합니다.
그러나 이를 달성하기 위해 정의된 연구 목표에 대한 최대 판독 가능성을 제공하는 실험 설계의 설정이 중요합니다. 실험군 간의 분자 변화에 대한 신뢰할 수 있는 비교를 달성하기 위해 최소 10마리의 동물을 사용하여 동물 의 가변성과 지질 수준의 생물학적 범위를 보상하는 것이 좋습니다. 동물 처리 및/또는 동물 취급의 물류가 제한적인 경우, 그룹당 최소 6마리의 동물을 사용하는 것은 자신감 있는 통계 분석을 제공하는 것이 필수적입니다. 그룹 크기 계산은 모델 관련 사망률을 보상해야 합니다(즉, 모델의 가능한 사망률에도 불구하고 그룹당 최소 6개, 이상적으로 10개, 동물이 연구에 필요합니다). 중요한 필수 조건은 실험 그룹 당 연령, 성별 및 변형 일치 동물을 보장하는 것입니다. 발견 단계에 대 한, 가능한 행동 및 분자 표현형 차이 동물 배치 사이 가능한 행동 및 분자 표현형 차이 때문에 발견의 편견을 피하기 위해 가능한 경우 모든 연구 와 동일한 동물 배치에 대 한 실험 동물에 대 한 동일한 공급자를 사용 하는 것이 필수적이다. 연구에서 결정된 분자 및 행동 표현형의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해서는 가능한 한 생물학적 복제 분석을 수행하는 것이 중요합니다.
또 다른 중요한 단계는 동물 그룹과 표준화된 예정된 실험 작업을 설정하는 것입니다. circadian 분자 가변성을 우회하기 위하여 하루의 같은 시간 창 안에 동물을 취급하는 것이 필수적입니다. 하루의 시간은 대상 분자의 합성 및 저하에 circadian 리듬의 알려진된 영향에 따라 설정 하거나 circadian 리듬 효과 사용할 수 있는 경우 모든 실험 그룹에 대 한 일관 된 유지 해야. 마찬가지로, 동물 희생 이전의 하우징 및 수유 조건은 실험 모델 전반에 걸쳐 일관되고 엄격하게 제어되어야 합니다. 이것은 지질 혈장 및 조직 대사에 영양의 영향으로 인해 지질 프로파일링에 특히 관련이 있습니다. 치료 또는 질병 유도 약물의 투여는 지속적으로 제어 군의 차량 투여와 병행하여 수행되어야하며, 이에 따라 차량은 약물 투여에 사용되는 것과 동일해야 한다. 연구의 목적을 위해 가장 적합한 설치류 균주 및/또는 서브균을 선택하려면, 약물 기반 치료 전략은 투여 의 시간과 빈도, 투여 량 및 투여 경로, 그리고 문헌 및/또는 이전 경험에서 유추된 다른 균주의 약물에 대한 특정 감수성 측면에서 약물 특이성에 따라 수행되어야 한다. 질병및 대형 코호트 그룹 또는 다중 동물 그룹과 관련된 치료에 대한 대응에 대한 시간 과정 조사는 치료, 희생 및 샘플링 측면에서 하루 만에 수행 할 수 없습니다. 이러한 경우 동물군 처리는 일정화및 시행되어야 하며, 하루 중 시간, 실험설계, 처리시간, 연구자 등과 동일한 조건을 유지해야 한다. 화학 주사의 준비는 또 다른 중요한 단계입니다. 약물 또는 질병을 유발하는 화합물은 투여 전과 약물 사양에 따라 신선하게 준비해야 합니다. 약물의 동일한 생산 배치의 사용은 비교 하는 모든 코호트에 대 한 권장. 이것은 간질 유도를 위해 이 연구에서 사용되는 kainic acid (KA)와 같은 천연 화합물 제형의 경우에 특히 중요합니다.
신뢰할 수 있는 리피도믹 및 전사 프로파일링을 가능하게 하려면 동물 희생 절차는 5분 이내에 동물 군 전체에서 일관되게 수행해야 합니다. 참수 후 혈액을 채취하면 유리 챔버에서 일정한 양의 이소플루란을 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 목적을 위해, 자주 (5 사용 후) isoflurane와 함께 담그고 부정맥과 심계 항진의 발병을 방지하고 플라즈마 샘플링에 대한 적절한 혈압을 보장하기 위해, isoflurane을 사용하여 마취의 기간 동안 10 을 초과하지 않습니다.
생물학적 물질 샘플링 및 취급조건(예: 시간 창 및 생물학적 물질 샘플링 및 취급 순서)을 엄격하게 준수하고 모든 그룹에 대해 동일하게 유지되어야 합니다. 조직 해동의 가변 정도를 피하기 위해 따라서 지질 및 /또는 mRNA 수준의 일관성 전 생체 조직 변화, 사후 샘플링을위한 엄격하게 제어 된 시간과 온도 조건을 유지하는 것이 필수적이다
보관. 조직 해부 또는 펀칭, 후속 샘플 처리 및 분석(섹션 3 및 4 참조). 실험동물군의 크기가 동물 희생, 제거 및 해부를 허용하는 경우, 이러한 각 절차에 대해 여기에 표시된 기간을 변경하지 않고, 사전 스냅 동결 없이 전수금속판(4°C)에서 뇌를 즉시 해부할 수 있다. 실험 그룹의 크기가 이러한 절차에 대 한 실용적이지 않은 경우, 두뇌의 스냅 동결 및 후속 해부는 처리를 위한 비교 및 통제 된 시간을 허용 하는 것이 좋습니다. 여기에 표시된 프로토콜 및 타임 라인 지침을 엄격히 따르는 경우, 냉동 뇌에서 해부된 새로 해부된 뇌 영역과 뇌 영역을 추출하여 얻은 분자 수준 사이에는 불일치가 관찰되지 않았습니다.
엄격하게 통제된 온도 조건하에서 시료 처리를 제외하고, 그룹 내및 그룹 사이 지질 수준의 재현 가능하고 최소한의 가변성을 달성하기 위한 중요한 측면은 항산화제의 제공입니다(섹션 2 및 3 참조). cCB와 같은 신경 활동에 관여하는 많은 지질이 스트레스에 반응하여 빠르게 변할 수 있기 때문에 희생하기 전에 동물의 스트레스 요인 (예를 들어, 혈액 냄새)을 피하는 것이 가장 중요합니다.
지질 추출 및 분석을 위해 추출 당일 내부 표준, 교정 솔루션 및 추출 용매를 신선하게 준비하는 것이 필수적입니다. 교정 곡선 준비와 샘플 추출모두에 동일한 내부 표준을 사용해야 합니다. 또한, 시료 추출, 저장 및 분석을 위해 엄격하게 조절된 온도 조건에 따라 분자의 생체 내 효소 또는 화학적 변화를 최소화하고 제어하는 것이 가장 중요합니다. LC/MRM 분석의 경우, 새로운 지질 세트에 대한 분리, 검출 및 MRM 전환이 최적화된 경우 표적 및 그에 상응하는 내부 표준 및 교정을 추가하거나 제거하여 연구 목표에 맞게 조정할 수 있습니다. 제시된 추출 프로토콜은 기술 적 실패의 경우 또는 복제 분석이 연구에 중요한 경우 중요한 eBC 및 eIC에 대한 두 개의 LC / MRM 복제복제를 제공 할 수 있습니다. PL 추출 프로토콜은 추출당 최소 10개의 분석에 적합한 샘플/추출 량을 렌더링합니다(예: 전구체 이온 및 중립 손실 스캐닝2에 기초한 다중 스캔 실험, 추가 LC/MRM 분석 또는 LC/MRM 복제하여 실행 중 기술적 실패를 보상합니다). 지질 분석은 LC/MRM에 국한되지 않습니다. 사실 이러한 프로토콜중 어느 것으로 얻은 지질 추출물은 단색, 하이엔드 질량 분석 분석을 위해 가능합니다. 이산 영역(3mg 미만)에서 얻은 뇌 펀치 또는 분량을 제외하고, 2-3 mg 미만의 영역의 냉동 분쇄 조직은 복제 분석 및/또는 조직 분말에서 가능한 다른 조사를 위해 여기에 설명된 바와 같이 여러 추출 모듈에 알리인용 및 사용될 수 있다.
일반적으로 사용되는 프로토콜과 비교하여 여기에 설명된 프로토콜의 일반적인 장점은 동물 자원, 소모품 및 분석 비용의 지출 감소에 대한 다화합물 추출 및 분석에 대한 전반적인 시간 효과 및 감도가 증가한다는 것입니다. 중요한 것은, 이중 지질/mRNA 추출 프로토콜은 또한 mRNA 추출의 더 높은 효율을 제공하고 상응하는 표준 프로토콜에 비해 mRNA의 무결성을 제공하고, 동시에 지질 추출7의 효율을 증가시다. 이것은 또한 이중 추출될 때 각 지질 및 mRNA 분획에 대한 감소된 매트릭스 효과 때문일 가능성이 높습니다. 이 때문에, 방법은 뇌 펀치와 같은 높은 공간 해상도 프로파일링에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
그러나, 프로토콜의 현재 제한은 염증지질이 이중 지질/mRNA 추출을 이용하여 분석 및 정량화를 위해 용인되지 않는다는 것이다. 따라서 프로토콜은 추가 개선을 위해 적용됩니다. 이를 위해 조직 및 플라즈마 염증성 지질 및 엔도칸 나비노이드는 신경 염증 과정과 내칸 나비노이드 변조 뉴런 활동을 동시에 조사하는 최적화 된 도구인 공동 추출 및 공동 분석 될 수 있습니다 (eIC 및 eCB의 coextract 참조). 이 후자의 분석에서 인지질을 포함하면 실현 가능할 것으로 예상됩니다.
신경질환에 대한 장래의 다중오믹 접근법을 고려하여 지질 추출 프로토콜(즉, ECB 및 eIC의 공동 추출, PLs 및 eCBs의 공동 추출)을 통해 얻은 단백질 분획의 프로테오믹 분석이 실현 가능할 것으로 예상된다. 그러나, 이것은 듀얼 지질/mRNA 프로토콜을 사용할 때 아직 가능 하지 않습니다. 후자의 경우, 추출의 화학적 환경은 비신천산 분석(BCA)과 같은 표준 단백질 분석을 사용하여 단백질량 결정조차 배제한다. 이러한 한계를 극복하고 이러한 프로토콜에 프로테오믹 프로파일링의 포함을 촉진하기 위한 추가 개발이 계획되어 있습니다.
여기에 설명된 모듈식 프로토콜을 사용하여 급성 간질 발작의 동물 모델에서 eiC, eBC 및 PL의 뇌 지역 지도를 달성할 수 있었다(도 4). 프로토콜은 KA 유도 급성 발작을 가진 처리및 처리되지 않은 마우스에서 eIC 및 신경 활성 변조에 의한 염증 과정의 해마 변조를 보여주었다13. 급성 간질 발작 상태에서 인지질, 엔도칸나비노이드 및 mRNA 변화의 하위 지역 뇌 국소화도 각각 관찰하였다(도 5). 이러한 결과는 뇌 영역 및 하위 지역에서 간질과 같은 복잡한 신경 질환의 변조에 관여하는 광범위한 지질 스펙트럼에 대한 지식을 발전시키는 데 여기에 설명된 방법의 가치와 적용성을 강조합니다. 이 프로토콜은 세포 인구를 위한 프로토콜 및 응용프로그램의 추가 개발이 계속되는 동안 신경학상 질병 조사 및 그 너머에 있는 일반적인 적용성입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 이 기사를 에르멜린다 로마초 박사에게 헌납합니다. 이 원고를 마무리하는 동안 에르멜린다 로마조 박사는 세상을 떠났습니다. 그녀는 의미있는 연구 목적을 달성하기 위해 연구 작업에 과학과 사심없는 참여에 대한 열정의 구현이다. 그녀는 항상 인간의 더 큰 복지에 의미 있는 기여를 꿈꿔주었다. 그녀의 선한 성격은 과학과 삶의 격렬한 길로 인해 결코 타협되지 않았습니다. 그녀는 우리의 마음에 귀중하고 영원히 남아있을 것입니다.
줄리아 M. 포스트는 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서 번역 신경 과학 (FTN)에 대한 초점 프로그램에 의해 투자되었으며, 현재 LB에 SPP-2225 EXIT 프로젝트에 의해 투자된다. 이러한 연구에 대 한 부분 자금 은 리피도믹스 코어 시설에 의해 제공 되었다, 생리 화학 연구소, 그리고 교내 기금 (LB에) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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