Summary
Aquí presentamos VirWaTest, que es un método simple, asequible y portátil para la concentración y detección de virus de muestras de agua en el punto de uso.
Abstract
Los virus excretados por humanos y animales pueden contaminar las fuentes de agua y representar un riesgo para la salud humana cuando esta agua se utiliza para beber, irrigación de alimentos, lavado, etc. El indicador clásico de bacterias fecales no siempre comprueba la presencia de patógenos virales, por lo que la detección de patógenos vímicos e indicadores virales es relevante para adoptar medidas de mitigación del riesgo, especialmente en escenarios humanitarios y en zonas cuando los brotes virales transmitidos por el agua son frecuentes.
En la actualidad, varias pruebas comerciales que permiten la cuantificación de bacterias indicadoras fecales (FIB) están disponibles para su análisis en el punto de uso. Sin embargo, tales pruebas comerciales no están disponibles para la detección de virus. La detección de virus en muestras de agua ambiental requiere concentrar varios litros en volúmenes más pequeños. Además, una vez concentrado, la detección de virus se basa en métodos como la extracción de ácido nucleico y la detección molecular (por ejemplo, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) de los genomas virales.
El método descrito aquí permite la concentración de virus a partir de muestras de agua de 10 L, así como la extracción de ácidos nucleicos virales en el punto de uso, con equipos simples y portátiles. Esto permite la prueba de muestras de agua en el punto de uso de varios virus y es útil en escenarios humanitarios, así como en cualquier contexto donde no se dispone de un laboratorio equipado. Alternativamente, el método permite concentrar los virus presentes en las muestras de agua y el envío del concentrado a un laboratorio a temperatura ambiente para su posterior análisis.
Introduction
Durante las primeras fases de cualquier emergencia humanitaria, el acceso a suministros de agua potable, saneamiento e higiene es fundamental para la supervivencia de los afectados. Por lo tanto, el control de la calidad del agua es una prioridad para prevenir brotes transmitidos por el agua. Es bien sabido que el agua contaminada es con frecuencia el origen de las enfermedades, pero a menudo es difícil determinar las fuentes de brotes virales como el virus de la hepatitis E (HEV), incluso con la disponibilidad de métodos de laboratorio convencionales. El control de la calidad del agua se basa en la cuantificación de FIB1,2,3,4. Sin embargo, se ha documentado ampliamente que no existe correlación entre la ausencia de FIB y la presencia de patógenosvirales transmitidos por el agua como rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV 5,6. Por lo tanto, el uso de los criterios de calidad del agua basados en la FIB podría dar lugar a una subestimación de los riesgos asociados con la presencia de patógenos virales transmitidos por el agua. La vigilancia de los virus indicadores, como los adenovirus humanos (HAdV), o patógenos específicos sería útil para definir la exposición a patógenos víricas e identificar la fuente potencial de infección humana7,8, 9,10 y en la validación de la eficacia de las medidas de saneamiento11.
Hasta ahora, la detección de virus en estos escenarios dependía de personal cualificado y logística compleja. VirWaTest (virwatest.org) está dirigido al desarrollo de un método simple, asequible y portátil para la concentración y posterior detección de virus a partir de muestras de agua en el punto de uso.
La concentración del virus se basa en el principio de floculación orgánica de muestras de agua de 10 L, mediante la cual los virus se recuperan en volúmenes más pequeños12,13. Los flocs se recogen y se añaden a un tampón que lyses los virus y evita que los ácidos nucleicos de degradación cuando se almacenaron a temperatura ambiente durante no más de 2 semanas.
El método de extracción de ácido nucleico se basa en el uso de partículas magnéticas a las que los ácidos nucleicos se absorben. Se pueden transferir de un tampón de lavado a otro y finalmente al tampón de elución mediante el uso de una pipeta magnética a la que se adhieren las partículas. Las suspensiones de ácido nucleico viral obtenidas se pueden enviar a un laboratorio de referencia donde la detección se puede realizar utilizando métodos moleculares basados en PCR. Para cada extracción de ácido nucleico, se prueban dos cantidades diferentes para descartar la inhibición enzimática originada por la muestra. Alternativamente, con una disponibilidad mínima del equipo, las pruebas de PCR se pueden ejecutar en el punto de uso. Todo el proceso está diseñado para realizarse independientemente de una fuente de alimentación (Figura1).
Un ensayo cuantitativo de PCR para detectar el Vhv, excretado por los seres humanos y encontrado en muestras de aguas residuales en altas concentraciones, se ha adaptado para ser ejecutado en el punto de uso. HAdV se utilizan como indicadores virales fecales humanos. También se ha adaptado un PCR para la cuantificación del bacteriófago MS2 desde que MS2 se utiliza en VirWaTest como control de procesos. El método se puede personalizar para la detección de cualquier virus de interés.
Después del desarrollo, el método VirWaTest ha sido aplicado por los usuarios en dos configuraciones diferentes en la República de Frica Central (RCA) y Ecuador, proporcionando retroalimentación sobre la aplicación del protocolo en situaciones reales.
Hasta nuestro punto de conocimiento, este es el primer procedimiento que permite la concentración y detección de virus en el punto de uso, independientemente de cualquier fuente de alimentación, equipos de gran tamaño y condiciones de congelación/refrigeración. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua con el fin de obtener resultados robustos.
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Protocol
1. Preparación y envasado
NOTA: Los materiales/equipos que se van a embalar se enumeran en la Tabla1. Utilice guantes para manipular los reactivos necesarios para el control del proceso, los reactivos de concentración, los reactivos de extracción de ácido nucleico y los reactivos de detección. Use gafas protectoras para manipular los reactivos necesarios para la extracción de ácido nucleico.
- Control de procesos
- Preparar el cultivo de poblaciones de bacteriófagos MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) que contiene 1 x 1010 PFU/mL en el laboratorio siguiendo el procedimiento ISO 10705-1:199514.
- A continuación, la alícuota de 10 ml de la suspensión por tubo que contiene 1 x 108 PFU en tubos de 10 ml y dejar que el agua se evapore a 37 oC. Utilice un tubo por muestra de agua.
- Además, prepare un tubo que contenga 10 ml de agua destilada estéril por muestra recogida.
- Reactivos de concentración
- Para la solución de leche desnatada prefloculada (PSM), utilice las siguientes cantidades para concentrar cinco muestras de agua de 10 L.
- Preparar un tubo de plástico que contenga 5 g de leche desnatada.
- Prepare una bolsa de plástico con cremallera que contenga 16,66 g de sales marinas.
- Preparar una botella de plástico que contenga 500 ml de agua destilada.
- Prepare los reactivos necesarios para el ajuste del pH. Utilice las siguientes cantidades para ajustar el pH del PSM y de cinco muestras de agua de 10 L.
- Añadir 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a un tubo de plástico de 10 ml.
ADVERTENCIA: El ácido cítrico causa irritación grave cuando entra en contacto con los ojos. Si esto ocurre, enjuague el ojo con precaución durante varios minutos. Si la irritación persiste, consulte a un médico. - Poner 2 g de hidróxido de sodio en un tubo de plástico de 10 ml.
ADVERTENCIA: El hidróxido de sodio puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Si se ingiere, enjuague la boca. No induzca el vómito. Si entra en contacto con los ojos, enjuague con precaución con agua durante varios minutos. Luego, busque consejo médico. - Poner 25 ml de agua destilada estéril en un recipiente de plástico.
- Poner 50 ml de agua destilada estéril en un recipiente de plástico.
- Añadir 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a un tubo de plástico de 10 ml.
- Preparar el sobre acondicionador de muestra utilizado para la floculación, la solución conservante utilizada para preservar los ácidos nucleicos, y el sobre neutralizante para neutralizar el agua y los materiales desechados. Utilice las siguientes cantidades para cada muestra de agua de 10 L que se va a probar.
- Poner 15 g de sales de mar y 8 g de ácido cítrico 1-hidrato en una bolsa de plástico con cremallera para el sobre acondicionador.
- Añadir 2 ml de tampón de lisis (Tablade materiales)y 0,3 ml de agente conservante de ácido nucleico (Tablade materiales)a un tubo de 5 ml.
ADVERTENCIA: El tampón de lysis contiene tiocianato de guanidina y Triton X-100. El contacto con ácido libera gases tóxicos, y es dañino si se ingiere, inhala o entra en contacto con la piel. Si se ingiere, enjuague la boca. No induzca el vómito. Si entra en contacto con la piel, lave con abundante agua. Luego, busque consejo médico. El agente conservante del ácido nucleico causa irritación de la piel y los ojos y es dañino si se ingiere. Si entra en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua durante varios minutos. En cualquier caso, especialmente si se ingiere y se siente mal, busque consejo médico. - Ponga 40 g de detergente en polvo en cuatro bolsas de plástico con cremallera.
ADVERTENCIA: El detergente en polvo causa irritación ocular. Si entra en contacto con los ojos, enjuague con abundante agua durante varios minutos. Si la irritación persiste o si se ingiere, consulte a un médico.
- Para la solución de leche desnatada prefloculada (PSM), utilice las siguientes cantidades para concentrar cinco muestras de agua de 10 L.
- Reactivos de extracción de ácido nucleico
- Poner 50 l de partículas magnéticas (Tablade materiales)y 1 ml de etanol 96% en un tubo de 5 ml que constituyen el tampón de unión.
ADVERTENCIA: El tampón de partículas magnéticas contiene azida sódica, que forma un gas tóxico cuando entra en contacto con ácidos o iones de metales pesados y es tóxico si se ingesta o cuando entra en contacto con la piel. Si se ingieres o en contacto con la piel, enjuaga la boca o la piel con abundante agua y busca consejo médico. El etanol es un líquido y vapor altamente inflamable y causa irritación ocular grave. Mantener alejado del calor, superficies calientes, chispas y cualquier otra fuente de ignición. Si entra en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua. En caso de ingestión de grandes cantidades de agua y/o si se inhala, salga al aire libre. En cualquier caso, busque consejo médico. - Añadir 500 l, 600 ml y 200 ml de los tampones de lavado 1, 2 y 3, respectivamente (Tablade materiales),a tres tubos de 2 ml.
ADVERTENCIA: Los tampones de lavado contienen tiocianato de guanidinio y cloruro de guanidinio, que son dañinos si se inhalan o ingieren e irritan la piel y los ojos. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Si entran en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua. Si se ingiere, enjuague la boca con abundante agua. No induzca el vómito. Siempre busque consejo médico. - Añadir 120 l de tampón de elución (Tablade materiales)a un tubo de 0,5 ml.
- Poner 50 l de partículas magnéticas (Tablade materiales)y 1 ml de etanol 96% en un tubo de 5 ml que constituyen el tampón de unión.
- Reactivos de detección HAdV y MS2
NOTA: Se pueden analizar simultáneamente dos reacciones diferentes de extracción de ácido nucleico en cada ensayo de PCR si se utiliza un termociclador de 8 pozos. Para todos los ensayos de PCR, prepare agua de biología molecular alítica en tubos de 1,5 ml.-
Detección de HAdV
- Preparar una mezcla que contenga 10 ml de imprimación delantera AdF de 22,5 m, 10 ml de imprimación inversa AdR de 22,5 m y 5 ml de sonda AdP de 11,25 m (Tabla 2).
- Agregue 2,5 l de la mezcla a los tubos 1 a 8 de una tira de tubo. Dejar secar a temperatura ambiente, cerrar los tubos y mantenerlos protegidos de la luz.
- Cortar la tira dividiéndola en dos tiras: tubos 1-5 y tubos 6-8.
- Preparar una dilución en serie de suspensiones de ADN que contenga la secuencia de nucleótidos de la región amplificada del VHD. Secado al aire 1 l de suspensiones que contienen 1 x 105, 1 x 107y 1 x 109 GC/ml en tubos 6-8.
NOTA: Mantenga protegidos de la luz los tubos que contienen las imprimaciones, la sonda y las suspensiones secas al aire.
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Detección de MS2
- Preparar una mezcla que contenga 10 ml de imprimación delantera de pecson-2F de 25 m, 10 ml de imprimación inversa de pecson-2R de 25 m y 2,5 ml de sonda PecP-2 de 25 m (Tabla2).
- Agregue 2,25 l de la mezcla a los tubos 1 a 8 de una tira de tubo. Dejar secar a temperatura ambiente, cerrar los tubos y mantenerlos protegidos de la luz.
- Cortar la tira dividiéndola en dos tiras: tubos 1-5 y tubos 6-8.
- Proceda como en el paso 1.4.1.4 pero utilice una suspensión estándar diseñada para MS2 en su lugar.
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Detección de HAdV
2. Concentración viral
NOTA: Utilice guantes en todo momento durante los procedimientos de recogida de muestras, preparación de reactivos, floculación, recogida de flocs y eliminación de residuos. Use gafas protectoras durante el procedimiento de preparación del reactivo.
- Recogida de muestras
- Recoger una muestra de agua de 10 L en un cubo de fondo plano con una tapa. Recopile un mínimo de dos réplicas para cada muestra.
NOTA: Es importante utilizar cubos claros para visualizar el pellet. Si la muestra de agua contiene material suspendido (por ejemplo, arena, algas), deje que se sedimente y, a continuación, recoja el agua sobrenadante en un cubo nuevo. - Registre el volumen recogido, así como la ubicación y la fecha de recogida, para cada muestra de agua.
- Coloque un agitador magnético conectado a una batería debajo de un soporte de cucharón y coloque el cubo que contiene la muestra de agua en su soporte.
NOTA: Busque una superficie plana en un lugar fresco y mantenga los cubos que contienen las muestras de agua de la luz solar directa.
- Recoger una muestra de agua de 10 L en un cubo de fondo plano con una tapa. Recopile un mínimo de dos réplicas para cada muestra.
- Preparación de reactivos
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reactivos de ajuste de pH
- Vierta el polvo de ácido cítrico y los pellets de hidróxido de sodio en las macetas que contengan 25 y 50 ml de agua destilada, respectivamente.
- Agitar suavemente a mano hasta que el ácido cítrico y el hidróxido de sodio se disuelvan por completo.
ADVERTENCIA: No vierta el agua sobre los pellets de hidróxido de sodio. En su lugar, vierta los gránulos de hidróxido de sodio sobre el agua.
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Leche desnatada preflocuada
- Coloque una bolsa de pie en un agitador magnético y vierta 500 ml de agua destilada en ella. Suelte un imán de agitación dentro de la bolsa y encienda el agitador magnético.
- Vierta el contenido de un sobre de sal marina y de un tubo de leche desnatado en la bolsa de pie y revuelva durante 5 minutos a velocidad media para disolverlos.
- Añadir 3 ml de ácido cítrico a la solución de PSM utilizando una pipeta Pasteur para asegurarse de que el pH se encuentra entre 3,4 y 3,6. Mida el pH de la solución PSM utilizando tiras indicadoras de pH. Añadir cantidades más pequeñas de ácido cítrico e hidróxido de sodio a medida que el pH se acerca a 3.5.
- Apague el agitador magnético y asegúrese de que los flocs estén visibles. Utilice una linterna para ayudar a visualizar los flocs.
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reactivos de ajuste de pH
- Floculación
- Suelte un imán de agitación en el agua, ajuste el agitador magnético a la velocidad máxima y enciéndalo. Asegúrese de que el imán de agitación comience a girar.
- Añadir 10 ml de agua destilada a un tubo de control de proceso. Invierta el tubo varias veces para rehidratar el stock viral y verter la solución en el agua.
- Vierta el contenido de un sobre acondicionador de muestra en el agua y revuelva durante 5 min.
- Mida el pH de la muestra de agua utilizando tiras indicadoras de pH. Agregue unas gotas de ácido cítrico o hidróxido de sodio a la muestra de agua para asegurarse de que el pH se encuentra entre 3,4 y 3,6. Añadir cantidades más pequeñas de ácido cítrico e hidróxido de sodio a medida que el pH se acerca a 3.5.
- Agregue 100 ml de la solución PSM utilizando un contenedor de 100 ml.
- Selle el cubo con la tapa, ajuste el agitador magnético a una velocidad mínima y deje el agua agitando durante 8 h.
- Apague el agitador magnético y deje que el agua se descanse durante al menos 5 h para permitir que los flocs se asienten.
- Colección Floc
- Construir un sistema de sifón compuesto por un controlador de pipeta, dos pipetas y un tubo de plástico, para aspirar el agua sobrenadante para descargar el agua en los flocs.
- Conecte una pipeta de 10 ml de extremo de cinta al controlador de pipeta. A continuación, coloque la punta de la pipeta en el tubo de plástico.
- Retire el filtro de una pipeta de punta abierta de 10 ml con pinzas y conecte la pipeta al tubo de plástico.
- Coloque un cubo vacío en el suelo.
- Sumerja la punta de la pipeta de punta abierta en el agua. Asegúrese de mantenerlo cerca de la superficie del agua para evitar perturbar los flocs. Aspirar el sobrenadante de agua hasta que llegue a la pipeta de la cinta.
- Pellizque el tubo de plástico por el extremo unido a la pipeta de la tapa de cinta y despártelo de la pipeta.
- Coloque el tubo en un cubo vacío. Suelte la presión en el tubo para dejar que el agua fluya hacia el cubo vacío.
- Pellizque el tubo de plástico para detener el flujo de agua cuando el nivel del agua está a punto de alcanzar el imán de agitación y alejar la pipeta del cubo.
- Agitar el cubo para resuspender los flocs y verterlos en una bolsa de plástico de pie de 500 ml. Deje que los flocs se conformen con 1 h más.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de agua con una pipeta de 50 ml y un controlador manual de pipetas, evitando molestar a los flocs.
- Aspirar los flocs usando una pipeta de 100 ml y transferirlos a un tubo de centrífuga graduado de 50 ml. Anote el volumen final del concentrado de muestra y transfiera 1 ml de él a un tubo de 5 ml que contenga la solución conservante, utilizando una pipeta Pasteur.
NOTA: Es importante que el tubo de centrífuga se gradúe para que el volumen final de la muestra concentrada se pueda medir con la mayor precisión posible y registrarse. - Realizar la extracción de ácido nucleico en el campo. Alternativamente, guarde la solución conservante que contiene los virus a 20-30 oC durante un máximo de 15 días o envíelos a un laboratorio de referencia para su posterior análisis.
- Construir un sistema de sifón compuesto por un controlador de pipeta, dos pipetas y un tubo de plástico, para aspirar el agua sobrenadante para descargar el agua en los flocs.
- Eliminación de residuos y reutilización de materiales
- Agregue el contenido de un sobre de agente neutralizante al cubo que contiene el agua descartada. Mezclar el agua, y luego, dejarlo quieto durante 30 minutos.
- Deseche el agua tratada como residuo general.
- Coloque las pipetas y el tubo de plástico dentro del cubo. Llene el cubo con agua y vierta el contenido de un sobre de agente neutralizante.
- Lávelos durante al menos 30 minutos para esterilizarlos y enjuáguelos con abundante agua limpia para eliminar cualquier agente neutralizante restante.
3. Extracción de ácido nucleico
NOTA: Use guantes y use siempre gafas protectoras durante el procedimiento de extracción de ácido nucleico.
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Funcionamiento de la pipeta magnética
- Familiarícese con el funcionamiento de la pipeta magnética antes de realizar la extracción.
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Extracción de ácido nucleico
- Organice los tubos que contienen los reactivos necesarios para la extracción en un bastidor, de izquierda a derecha: búfer de unión, tampones de lavado y tampón de elución. Establezca el número adecuado de tubos de acuerdo con el número de muestras o réplicas que se están analizando.
- Transfiera 1 ml de concentrado de muestra al tubo que contiene el tampón de unión, utilizando una pipeta Pasteur desechable. Invierta el tubo de 8x a 10x para homogeneizar la solución.
- Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se mezcla continuamente, ya sea utilizando un orbital alimentado por energía solar o manualmente.
- Recoger las partículas magnéticas utilizando la pipeta magnética y una punta limpia, que se puede reutilizar para los tres tampones de lavado.
- Suelte las partículas magnéticas en el tubo que contiene 500 ml de tampón de lavado 1. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
- Transfiera las partículas magnéticas al tubo que contiene 600 ml de tampón de lavado 2. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
- Transfiera las partículas magnéticas al tubo que contiene 200 ml de tampón de lavado 3. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
- Suelte las partículas magnéticas en el tubo que contiene el tampón de elución y deseche la punta.
- Incubar la solución a temperatura ambiente durante 5 minutos mientras se mezcla continuamente, utilizando el orbital alimentado por energía solar.
NOTA: Mezclar las partículas magnéticas en el búfer de elución es un paso crucial. En caso de falta de un orbital, mezcle continuamente a mano durante el tiempo de incubación. - Sustituya la punta de la pipeta magnética por una nueva y recoja las partículas magnéticas del búfer de elución. Asegúrese de eliminar completamente las partículas magnéticas del tampón de elución, ya que pueden interferir con los métodos de detección molecular.
- Deseche la punta con las partículas unidas a ella. Proceda con el análisis de PCR, envíe el búfer de elución a un laboratorio de referencia o almacene el búfer de elución a 4 oC para su posterior análisis.
4. Detección viral con un termociclador en tiempo real de ocho tubos a batería
NOTA: Use guantes y use siempre gafas protectoras durante el procedimiento de detección de ácido nucleico. Sustituya los guantes por otros nuevos al realizar un nuevo experimento de PCR para evitar la contaminación cruzada.
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PCR cuantitativo HAdV
- Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 2, 4 y 5.
- Añadir 4 l de mezcla de PCR a los tubos 1-5.
- Añadir 14 l de extracción de ácido nucleico de la muestra A al tubo 1 y 14 l de la muestra B al tubo 3.
- Añadir 2 l de ácidos nucleicos extraídos de la muestra A al tubo 2 y 2 l de la muestra B al tubo 4. Cierre la tira de cinco tubos.
- Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 6, 7 y 8.
- Agregue 4 l de esta mezcla a los tubos 6, 7 y 8, y ciérrelos.
- Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione el funcionamiento adecuado (Tabla3).
- Deseche el tubo de agua y mantenga el ácido nucleico extraído en el congelador, si es posible, o, si no, en un lugar fresco protegido de la luz en caso de que sea necesario realizar una segunda prueba.
- Limpie las micropipetas, el bastidor, el material de trabajo y todo el material correctamente con un limpiador de ácido nucleico y deseche la bolsa de plástico que contenga la punta, guantes y tubos usados.
ADVERTENCIA: El removedor de ácido nucleico es un líquido y vapor muy inflamable. No respirar la niebla de pulverización y evitar cualquier contacto del líquido con los ojos o la piel. De lo contrario, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. - Recopilar los resultados y analizar los datos obtenidos.
-
PCR cuantitativo MS2
- Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 2, 4 y 5.
- Añadir 4 l de mezcla de PCR y 0,5 l de enzima transcriptasa inversa a los tubos 1-5.
- Añadir 14 l de extracción de ácido nucleico de la muestra A al tubo 1 y 14 l de la muestra B al tubo 3.
- Añadir 1 l de ácidos nucleicos extraídos de la muestra A al tubo 2 y 1 l de la muestra B al tubo 4. Cierre la tira de cinco tubos.
- Agregue 15,5 l de agua libre de nucleasas a los tubos 5, 6, 7 y 8, y ciérrelos.
- Añadir 4 l de mezcla de PCR y 0,5 l de enzima transcriptasa inversa a los tubos 6, 7 y 8.
- Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione el funcionamiento adecuado (Tabla3).
- Proceda como se describe en los pasos 4.1.8 a 4.1.10.
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Representative Results
Desarrollo de métodos
Este procedimiento ha sido desarrollado en el Laboratorio de Virus Contaminantes del Agua y Alimentos con la colaboración de GenIUL y Oxfam Intermón. Consta de tres pasos diferentes. La primera, la concentración de partículas virales, es una adaptación de un método de floculación de leche desnatada descrito anteriormente12,17,18. El método original fue modificado como independiente de una fuente de alimentación, más simple, y sin pasos de centrifugación.
La recuperación del método de concentración de VirWaTest se probó en muestras de aguas subterráneas con bacteriófagos HAdV y MS2. La recuperación viral del método de concentración y extracción de VirWaTest se estimó en 3,01% a 18,02% para MS2 y de 17,52% a 44,22% para HAdV. Estas recuperaciones se calcularon a partir de los valores obtenidos por PCR cuantitativo durante el desarrollo del método en comparación con las concentraciones iniciales de HAdV y MS2 en las muestras de agua después de escupirlas con concentraciones conocidas de estas poblaciones virales.
La extracción de ácido nucleico magnético VirWaTest se comparó con un mini kit de ARN comercial (por ejemplo, QIAamp Viral RNA Mini Kit), un método de extracción basado en columnas utilizado en el laboratorio, mediante la prueba de 33 muestras de ríos y aguas subterráneas con HAdV y MS2 y por floculación de leche desnatada. Los resultados de la comparación mostraron que la recuperación del método VirWaTest fue mayor en 23/33 casos para HAdV, así como para MS2 (Tabla 4). Una prueba de Wilcoxon mostró valores pde 0.0005569 para HAdV y 0.02791 para MS2. La extracción de ácido nucleico VirWaTest proporciona recuperaciones virales significativamente más altas que la comercial.
Detección de HAdV en muestras de agua ambiental concentradas por el método VirWaTest
Para probar el método desarrollado para la concentración viral en el campo, el equipo de Agua, Saneamiento e Higiene (WASH) de Oxfam, ubicado en Banghi (RCA) en marzo de 2017, recogió y concentró virus de cinco muestras de agua de pozo.
Además, en la zona de Pedernales (Ecuador), que se vio afectada por terremotos en 2016 y 2017, un equipo de Oxfam WASH recogió seis muestras de agua de pozos en febrero de 2017, y sus virus se concentraron con el método de concentración VirWaTest. Los concentrados virales de ambos escenarios fueron enviados al laboratorio de Barcelona para la extracción de ácido nucleico VirWaTest y la cuantificación viral.
En Ecuador, el VHA de origen natural se detectó en seis de las seis muestras analizadas, con valores de concentración que oscilaban entre 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L, mientras que una de las cinco muestras recogidas y concentradas en Banghi (RCA) positivo para el VhV, a una concentración de 3,46 x 102 GC/L (Tabla5).
MS2, añadido a todas las muestras probadas como control de proceso interno, se detectó en todas las muestras analizadas, mostrando que el método se realizó correctamente desde la concentración hasta la detección.
Figura 1 : Método VirWaTest. Descripción general de los pasos de los que se compone el método VirWaTest. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Materiales | Concentración | Extracción de ácido nucleico | Detección |
| Equipo | Stirrer magnético (2 unidades) Batería (2 unidades) Conectores de Batería/Stirrer (2 Unidades) Adaptadores de corriente (2 unidades) Soporte para cucharones (2 unidades) Cuerda (1 Unidad) Imán de agitación (3 unidades) Pinzas (1 unidad) Tubos de silicio (1 unidad) Controlador de pipetas (1 unidad) Marcador (1 Unidad) |
Pipeta magnética (1 unidad) Plataforma rotativa solar (1 unidad) Rack de tubo multitamaño (1 unidad) Temporizador (1 unidad) |
Termociclador (1 unidad) Batería (1 unidad) Computadora Bastidor de tubo (1 unidad) Micropipeta de 0,5 l a 10 l (1 unidad) Micropipeta de 2 l - 20 l (1 unidad) |
| Consumibles y reactivos (por cada 2 muestras/replicaciones de agua) | Cubo (3 unidades) Tiras indicadoras de pH Pipeta de 10 mL con tapa de cinta (2 unidades) Pipeta abierta de 10 ml (2 unidades) Pipeta de 50 mL con tapa de cinta (2 unidades) Pipeta de 100 ml con tapa de cinta (2 unidades) Pipeta Pasteur (4 Unidades) Bolsa de plástico de pie (4 unidades) Contenedor de plástico con 25 ml de agua destilada (1 unidad) Contenedor de plástico con 50 ml de agua destilada (1 unidad) Contenedor vacío de 100 ml (1 unidad) Guantes (6 pares) Control de Procesos (2 Tubos) Tubo con 10 ml de agua destilada (2 unidades) Acido cítrico (1 tubo) Hidróxido de sodio (1 tubo) Leche desnatada (1 tubo) Sobre de ácido cítrico (1 unidad) Agua destilada (1 botella de 500 ml) Acondicionamiento de muestras (2 sobres) Solución conservante (2 tubos) Agente neutralizante (4 sobres) |
Puntas de pipeta magnética (2 unidades) Pipeta Pasteur (2 Unidades) Búfer de enlace (2 tubos) Tampón de lavado 1 (2 tubos) Tampón de lavado 2 (2 tubos) Tampón de lavado 3 (2 tubos) Búfer de elución (2 tubos) Guantes (6 pares) |
Puntas de micropipeta de 10 l (1 caja) Puntas de micropipeta de 20 l (1 caja) DNA qPCR Mix (1 tubo) ARN qPCR Mix (1 tubo) Enzima de transcriptasa inversa (1 tubo) Agua de Biología Molecular (1 Tubo) Tira de tubo HAdV con imprimaciones, sonda y estándar (1 unidad) Tira de tubo MS2 con imprimaciones, sonda y estándar (1 unidad) Eliminador de ácido nucleico Guantes (6 pares) |
Tabla 1: Contenido de VirWaTest. Equipos, consumibles y reactivos que deben prepararse para la concentración, extracción y detección de virus en dos muestras/replicaciones de agua.
| Virus | Imprimaciones | Adhesión a Genbank No. | Posición | Secuencia (5''u20123') | Longitud | Referencia | ||
| Adenovirus humano (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869-u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919-u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890-u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| Bacteriófago MS2 (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344-u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659-u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369-u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabla 2: Oligonucleótidos para experimentos cuantitativos de PCR. Imprimaciones y sonda diseñadas para unirse a secuencias de ácido nucleico de HAdV y MS2.
| Temperatura | hora | Ciclos | Temperatura | hora | Ciclos |
| 95 oC | 12 min | 1 | 55 oC | 15 min | 1 |
| 95 oC | 10 min | 1 | |||
| 95 oC | 15 s | 40 | 95 oC | 15 s | 40 |
| 60 oC | 1 min | 60 oC | 1 min |
Tabla 3: Condiciones térmicas para experimentos cuantitativos de PCR. Temperatura, tiempo y ciclos utilizados para la amplificación de HAdV y MS2.
| Qiagen | VirwaTest | Qiagen | VirwaTest | ||
| Mediana | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| Decir | 1.74 x 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 x 104 | |
| Sd | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 x 104 | 1.63 x 105 | |
| Valor p (Wilcoxon) para HAdV: 0.0005569 | |||||
| valor p (Wilcoxon) para MS2: 0,02791 | |||||
| Virus probado | Muestras probadas | Qiagen | Prueba VirWa | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabla 4: Desarrollo de extracción de ácido nucleico VirWaTest. Valores medios, medios y SD obtenidos al comparar los métodos de extracción Qiagen y VirWaTest en 33 muestras de aguas subterráneas para HAdV y MS2.
| País | Sitio | Muestra | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, Village 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, Village 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Borehole A | 6 | 7,96 x 101 |
| Borehole B | 7 | 1.80 x 102 | |
| Borehole C | 8 | 8.88 x 101 | |
| Agua de pozo A | 9 | 6.06 x 101 | |
| Agua de pozo B | 10 | 1.12 x 102 | |
| Agua de pozo C | 11 | 3.27 x 101 |
Tabla 5: Cuantificación del HAdV utilizando el Método VirWaTest. Resultados cuantitativos de PCR, expresados en GC/litro, para HAdV cuantificados en muestras de agua recogidas y concentradas de RCA y Ecuador.
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Discussion
El método VirWaTest permite la concentración de virus y la extracción de ácido nucleico de muestras de agua en el punto de uso por usuarios no experimentados. Es un protocolo asequible, rápido y simple. La concentración se basa en el principio de la floculación orgánica utilizando leche desnatada, por el cual el bajo pH y las condiciones de alta conductividad hacen que las proteínas de leche desnatadas se acumulen en flocs los virus adsorbe. Cuando el sedimento flocs, es fácil de recoger, lo que permite concentrar 10 L de agua, mientras que la ultracentrifugación tradicional no puede hacer frente a grandes volúmenes de agua.
El método ha sido modificado para ser factible en el punto de muestreo sin utilizar ningún equipo eléctrico, excepto para un agitador magnético a batería. Algunos otros enfoques basados en la filtración de agua se han adaptado a la concentración de virus y también se pueden realizar en el punto de uso. Sin embargo, el material suspendido presente en las muestras de agua a menudo obstruye los filtros; por lo tanto, el pequeño volumen que puede concentrarse con estos sistemas es una limitación grave.
Esta es la primera descripción de un método para concentrar virus de muestras de agua en el punto de uso, independientemente de la turbidez de la muestra. El método de concentración VirWaTest permite procesar varias muestras simultáneamente si se dispone del material adecuado. Por otra parte, la floculación de leche desnatada ha demostrado ser útil para la concentración de bacterias y parásitos19.
La preparación del material adecuado es crucial para realizar el procedimiento correctamente. Considere el número de muestras de agua que se analizarán y prepare los reactivos y el material antes de trasladarse al lugar donde se necesita la prueba para la preparación de los reactivos y el material. Se pueden procesar varias muestras al mismo tiempo si se dispone de la cantidad adecuada de material.
Antes de iniciar la concentración de una muestra de agua, se utilizará una concentración conocida de una población viral para pinchar la muestra como control del proceso. Este método utiliza un stock viral seco que se rehidrata con agua destilada antes de ser añadido a la muestra de agua en el punto de uso. Esto es útil para descartar resultados falsos negativos al final del procedimiento y da una indicación de la ejecución del método.
Los concentrados virales obtenidos con el VirWaTest pueden probarse en el campo aplicando los métodos de extracción y detección de ácido nucleico VirWaTest o, alternativamente, los concentrados pueden enviarse a un laboratorio de referencia a temperatura ambiente. La solución conservante añadida al concentrado permite que los virus permanezcan estables hasta 2 semanas (resultados no publicados).
La extracción de ácido nucleico VirWaTest es un método basado en partículas magnéticas. Es fácil y rápido y permite procesar varias muestras al mismo tiempo y muestra una eficiencia de recuperación equivalente e incluso mejor que los métodos utilizados actualmente para extracciones de ácido nucleico viral. Los ácidos nucleicos pueden enviarse a laboratorios de referencia a temperatura ambiente o, si los usuarios confían en realizar la detección molecular, se puede realizar un ensayo cuantitativo de PCR en el punto de uso de la muestra de agua original.
Además, si hay una pequeña instalación de laboratorio disponible, el protocolo de concentración VirWaTest puede acoplarse a kits de extracción de ácido nucleico estándar que dependen de una centrífuga y métodos estándar basados en PCR que requieren un congelador para mantener los reactivos pero que utilizan termocicladores estándar, que son menos costosos que los que funcionan con baterías.
Sin embargo, dado que a veces no se dispone de una fuente de alimentación, hemos optimizado los ensayos de detección de bacteriófagos MS2 como control de procesos y HAdV como indicador fecal viral, y la metodología se puede personalizar para cualquier otro virus de interés, como la hepatitis virus, RoV, NoV, u otros, para ser ejecutados en el campo sin necesidad de un congelador para el mantenimiento de los reactivos, ni termocicladores convencionales, sino sólo uno a batería. Varios termocicladores a batería están disponibles comercialmente. Alternativamente, si hay una fuente de alimentación disponible, se pueden utilizar otros equipos qPCR convencionales. Si se utiliza un termociclador de ocho tubos, se pueden probar hasta dos extracciones de ácido nucleico (dos muestras diferentes o dos réplicas de la misma muestra) en el mismo ensayo de PCR. Para cada extracción de ácido nucleico, se probarán dos cantidades diferentes para descartar la inhibición enzimática originada por la muestra. La adaptación se basa en la preparación previa de tubos PCR mediante imprimaciones de secado por aire, sondas y suspensiones estándar. Existen varias soluciones qPCR comerciales liofilizadas que podrían utilizarse aplicando el mismo procedimiento que se describe aquí. Hemos descrito una posibilidad que consideramos fácil de realizar.
Los ensayos de comparación realizados durante el desarrollo del método mostraron que los métodos VirWaTest de concentración, extracción y detección son eficientes para la cuantificación de virus en muestras de agua.
El límite de detección (LOD) del procedimiento descrito es variable, ya que el volumen recogido después de la concentración es variable. Además, el LOD puede ser ligeramente diferente para diferentes virus. Si se recoge un volumen de aproximadamente 10 L, el LOD para HAdV sería alrededor de 1 x 102 GC/L viral. Por lo tanto, concentraciones relativamente pequeñas de HAdV pueden ser detectados por el método VirWaTest. En Pedernales (Ecuador), seis de las seis muestras analizadas presentaron HAdV, en concentraciones cercanas al LOD, que oscilaban entre 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L. En Banghi (RCA), se detectó HAdV en una de las cinco muestras analizadas, a una concentración de 3,46 x 102 GC/L. La presencia de HAdV, así como la presencia de MS2 como el proceso de control en las muestras analizadas, muestra que el método es útil para la recuperación de partículas virales de muestras de agua, incluso cuando se realiza por usuarios no experimentados.
Los comentarios obtenidos hasta ahora indican que la concentración viral es un procedimiento fácil de realizar, sin mayores problemas cuando se aplica en el punto de uso de las muestras, aunque se requieren pasos de 8 h y 5 h. Es importante tener en cuenta que estos pasos se producen sin ninguna ayuda humana. Además, se está desarrollando un método más rápido basado en la filtración como alternativa para aguas no retuctuzantes. Sin embargo, la floculación parece ser, hasta ahora, el método único que permite la concentración de muestras que presentan alta turbidez. Los concentrados virales pueden enviarse a cualquier laboratorio del mundo a temperatura ambiente, lo que también facilita la prueba de virus, ya que las áreas de muestreo no siempre tienen buenos servicios de transporte que proporcionan condiciones de refrigeración. Alternativamente, los protocolos de extracción y detección presentados aquí permiten realizar pruebas para la detección viral en el punto de uso de las muestras.
Hasta donde sabemos, este es el primer método reportado como útil para la concentración y las pruebas para la presencia de virus en muestras de agua en el campo. Deberían realizarse nuevos esfuerzos para aplicar el procedimiento a la evaluación de la presencia de patógenos vímicos humanos de interés en varios otros escenarios de crisis humanitarias. Además, los comentarios del usuario serán necesarios para proporcionar información sobre la implementación potencial para que el procedimiento sea más fácil.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
VirWaTest fue un proyecto de investigación financiado por el programa HIF (Humanitarian Innovation Funds) de ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Los autores reconocen a los equipos de WASH que amablemente colaboraron en este estudio. El análisis de muestras en Ecuador fue financiado por Oxfam Ecuador y Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Américas (AMB). BRT.17.01). S. Bofill-Mas es serra-hunter becarios en la Universidad de Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
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