Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية والليفية في وقت واحد من جلد الفئران القديمة 0-4 أيام. يمكن الحفاظ على هذه الثقافات الأولية والتلاعب بها في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، بما في ذلك بيولوجيا خلايا الجلد، والتصبغ، والتئام الجروح والورم الميلانيني.
Abstract
ترتبط العيوب في وظيفة الخلايا الليفية أو الصباغية مع الأمراض الجلدية، بما في ذلك ضعف وظيفة الحاجز، والتئام الجروح المعيبة، وعيوب التصبغ والسرطان. ومن الأمور الحيوية لفهم هذه الأمراض وتحسينها التجارب في الثقافات الليفية الأولية والخلايا الصباغية. ومع ذلك، تتطلب البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الصباغية أن الطبقات الجلدية والجلدية من الجلد يتم علاجها وفصلها يدويا. وتستغرق هذه العملية وقتا طويلا، وتنطوي على تحديات تقنية، وتسهم في عدم اتساق الغلة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توليد الثقافات الليفية النقية في وقت واحد من نفس عينة الأنسجة ليست متاحة بسهولة. هنا، ونحن نصف بروتوكول محسنة لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من جلد الفئران في أيام ما بعد الولادة 0-4. في هذا البروتوكول، يتم تجانس الجلد كله ميكانيكيا باستخدام المروحية الأنسجة ومن ثم هضمها لفترة وجيزة مع الكولاجين والتربسين. ثم يتم عزل مجموعات الخلايا من خلال الطلاء الانتقائي متبوعاً بمعاملة G418. ينتج عن هذا الإجراء غلة الخلايا الصباغية والليفية المتسقة من فأر واحد في أقل من 90 دقيقة. هذا البروتوكول هو أيضا قابلة للتحجيم بسهولة، مما يسمح للباحثين لمعالجة مجموعات كبيرة من الحيوانات دون زيادة كبيرة في التدريب العملي على الوقت. نبين من خلال تقييمات قياس التدفق أن الثقافات التي أنشئت باستخدام هذا البروتوكول غنية بدرجة عالية للخلايا الصباغية أو الخلايا الليفية.
Introduction
جلد الثدييات هو جهاز متعدد الطبقات يحمي الجسم من مسببات الأمراض الأجنبية والتشعيع فوق البنفسجي (UVR). الجلد يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات المثلية مثل التئامالجروح، وتنظيم درجة الحرارة وإنتاج فيتامين (د) 1،2،3. يتكون جلد الثدييات من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الصباغية، الخلايا الليفية والكيراتينية. هذه الأنواع من الخلايا ملء طبقات مختلفة من الجلد، مع الخلايا الكيراتينية التي تشكل البشرة، الخلايا الليفية المقيمة في الأدمةوالخلايا الصباغية توطين إلى تقاطع البشرة الجلدية وبصيلات الشعر 4. هنا، نقوم بتفصيل إجراء بسيط يمكّن الجيل المتزامن من الخلايا الصباغية الأولية والثقافات الليفية من جلد المورين.
الخلايا الصباغية هي الخلايا المنتجة للأصباغ الموجودة في العديد من المواقع في جميع أنحاء جسم الإنسان، بمافي ذلك البشرة القاعدية، القزحية، القوقعة، الدماغ وبصيلا الشعر 5. الوظيفة الأساسية للخلايا الصباغية هي توليد وتفرز الحويصلات التي تحتوي على الميلانين تسمى melanosomes5،6. الميلانين تحتوي على فئتين رئيسيتين من الميلانين: البني / الأسود eumelanin والأصفر / الأحمر فيوميلانين6،7. العمليات البيوكيميائية داخل الخلايا الصباغية تنظيم الوفرة النسبية لكل نوع من أنواع الميلانين وتساعد على تحديد الشعر والجلد ولون العين8،9. الميلانين يعمل أيضا على امتصاص UVR وحماية الأنسجة المعرضة للشمس من الطفرات10.
يمكن أن يسبب خلل الخلايا الصباغية عيوبًا صباغية ويزيد من قابلية الإصابة بسرطان الجلد. على سبيل المثال، بقع الجلد فرط التصبغ مميزة من الكلف هي نتيجة للإفراط في إنتاج الميلانين البؤري، في حين أن الطفرات الوراثية الجرثومية التي تضر الجينات المشاركة في تخليق الميلانين تؤدي إلى المهق11،12 . مطلوب معرفة حميمة من بيولوجيا الخلايا الصباغية لوضع استراتيجيات من شأنها تصحيح هذه العيوب الصباغية وتحسين في نهاية المطاف الرفاه النفسي والاجتماعي للأفراد المصابين بهذه الأمراض. ويرتبط العجز في إنتاج الميلانين و / أو التوليف التفضيلي للفيوميلانين أيضا مع زيادة خطر سرطان الجلد10. ويعتقد أن هذا الخطر ينتج عنانخفاض حماية UVR 6،13. وهكذا, طرق لتعزيز أو استعادة إنتاج eumelanin في الخلايا الصباغية قد يقلل من حدوث سرطان الجلد في هذه التجمعات السكانية.
الخلايا الليفية mesenchymal إنشاء النسيج الضام والدعم الهيكلي لجميع أجهزة الجسم، بما في ذلك طبقة الجلد من الجلد14. إفراز البروتينات مثل الكولاجين والإيلاستين واللامينين والفيبرونكتين تمكن الخلايا الليفية لتشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي هي ضرورية لسلامة الأنسجة1،14. كما تلعب الخلايا الليفية أدوارًا أساسية في عمليات مثل التئام الجروح، والالتهاب، وتكوين الأوعية الدموية، وتكوين/تقدم السرطان1،15،16.
على غرار الخلايا الصباغية، يمكن أن تعزز العيوب في تنشيط الخلايا الليفية والوظيفة الأورام والمرض. على سبيل المثال، تنشيط الأورام الليفية غير المناسبة يؤدي عادة إلى تشكيل التليف، الناجمة عن الترسيب المعزز لمكونات ECM الزائدة في الأنسجة المحيطة بها. كما تحافظ الخلايا الليفية على الكثير من السلامة الهيكلية للجسم، والتليف يعزز الأمراض التي تؤثر على العديد من الأنسجة والأعضاء، بما في ذلك التليف الرئوي مجهول السبب، والتصلب الجهازي، وتليف الكبد والتليف القلبي15. الأورام الليفية تلعب أيضا دورا حاسما في السرطان16. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي الخلايا غير الخبيثة الأكثر وفرة في البيئة الدقيقة للعديد من الأورام. وقد ثبت CAFs لتعزيز انتشار الورم، والتقدم والمقاومة العلاجية عن طريق تحوير تصلب الأنسجة، وإنتاج السيتوكين المحلية ووظيفة المناعة16.
توفر ثقافات الخلايا الأولية للباحثين نماذج قابلة للزراعة وراثياً لتحديد والتخفيف من عيوب الخلايا الصباغية والأورام الليفية التي تؤدي إلى المرض. ومع ذلك، فإن الأساليب الحالية لإنشاء الثقافات الخلايا الصباغية تستغرق وقتا طويلا وصعبة من الناحية الفنية. الحاجة إلى التجريب والفصل الدقيق بين البشرة والأدمة يساهم في تقلب في الغلة التجريبية ويجعل من الصعب إجراء تجارب واسعة النطاق. وعلاوة على ذلك، تفتقر حاليا في هذا المجال بروتوكولات لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية في وقت واحد من الجلد كله.
لقد قمنا بتطوير طريقة للحد من خطوات المعالجة والتباين والوقت اللازم لإنشاء الثقافات الميلانية والليفية من نفس عينة الجلد بأكملها. باستخدام طريقة التجانس الميكانيكية تليها الهضم وجيزة، استراتيجيتنا يقلل بشكل كبير من كمية الوقت العملي اللازم لعزل الخلايا الصباغية الأولية مع تمكين العزلة الليفية المتزامنة. زيادة سرعة وكفاءة واتساق هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع القدرة على عزل الخلايا الصباغية من الفئران القديمة 0-4 أيام، ويوفر للباحثين المرونة لإجراء مجموعة أوسع من التجارب مما كان ممكنا في السابق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحصول على موافقة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية الخاصة بك قبل البدء في هذه الدراسة أو أي دراسة أخرى تشمل الحيوانات. تمت الموافقة على التجارب التي أجريت في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ولاية أوهايو (IACUC، البروتوكول #2012A00000134).
1- إعداد البروتوكول
ملاحظة: تعليمات إعداد الكاشف التالية مناسبة لتوليد 9 سم2 الثقافات الخلايا الصباغية والليفية من فأر واحد. راجع دليل إعداد الكاشف في الجدول 1 للحصول على عزلات نطاق أكبر.
- إعداد 1.5 مل من محلول الكولاجين الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكولاجين في 0.1 M حمض الخليك الجليدي.
- في خزانة تدفق اللامينار، قم بتغليف بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا 6-well مع 8 ميكروغرام/سم2 (1.44 مل) محلول الكولاجين. تأكد من أن البئر مغطى بالكامل من قبل محلول الكولاجين. تحضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قبل الاستخدام، اغسل الكولاجين المغلفة جيدا مرتين مع 1.35 مل من الفوسفات المعقمة المخزنة المالحة (PBS) (150 درجة مئوية من PBS لكل 1 سم2).
- تجميع المروحية الأنسجة في مجلس الوزراء تدفق laminar عن طريق وضع بعناية قرص تقطيع على منصة المروحية الأنسجة وتأمين شفرة معقمة إلى الذراع المنقولة.
- إعداد 3 مل من 1X المضادات الحيوية / مضاد للحشرات الحل عن طريق تخفيف 100X المضادات الحيوية / مضاد للميتوتيك حل الأسهم في PBS المعقمة.
- إعداد 3 مل من الطازجة الجلد الهضم العازلة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات حل، 1٪ L-الجلوتامين، 10 ملغ / مل كولاجيناز نوع الأول، 0.25٪ التربسين porcine و 0.02 ملغ / مل ديوكسيريبونوكليس أنا في RPMI 1640.
- إعداد 6 مل من وسائل الإعلام الميلانيتة الطازجة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 7٪ مصل الحصان، 1٪ البنسلين / العقديات حل، 1٪ L-الجلوتامين، 0.5 مليون متر دي بوتيريل دوري AMP (dbcAMP)، 20 nM tetradecanoylphorbol 13 خلات (TPA) و 200 سم الكوليرا PM (CT) في المغذيات مزيج F-12 هام وسائل الإعلام.
ملاحظة: يمكن إجراء حلول الأوراق المالية المركزة dbcAMP وTPA وCT، وتسعيرها وتخزينها لمدة أكثر من 1 سنة عند -80 درجة مئوية. يمكن تخزين الوسائط الأساسية التي تفتقر إلى هذه المكونات لمدة تصل إلى شهر واحد عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. - إعداد 4 مل من وسائل الإعلام الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات و 1٪ L-الجلوتامين في دولبيكو تعديل النسر المتوسط. يمكن تخزين هذه الوسائط عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد 40 مل من 4٪ بارافورمالدهايد الحل عن طريق تخفيف 16٪ بارافورمالدهايد في PBS. تخزين أي فائض في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
- إعداد محلول مخزون الصابونين 1٪ عن طريق خلط 0.5 غرام من الصابونين في 50 مل من PBS في 37 درجة مئوية حتى السابونين قد حل تماما. تعقيم الحل للتخزين على المدى الطويل باستخدام حقنة 50 مل مزودة بفلتر PES 0.2 ميكرومتر. يمكن الاحتفاظ بمحلول مخزون الصابونين الناتج عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- إعداد 200 درجة مئوية من 0.1٪ سابونين الحل لكل ماوس عن طريق تخفيف 1٪ محلول الأوراق المالية الصابونين في PBS تحتوي على 3٪ الزلال المصل البقري (BSA).
- إعداد 1 مل من محلول الصلاحية عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من صبغة صلاحية قابلة للإصلاح في 1 مل من PBS.
2. عزل الخلايا الصباغية والليفية
- قتل 0 إلى 4 يوم من العمر الذكور و / أو الإناث C57Bl/6J الجرو عن طريق قطع الرأس وإزالة الأطراف من الفئران القتل الرحيم باستخدام مقص الجراحية.
- في مجلس الوزراء تدفق laminar، لفة لفترة وجيزة الجذع من كل فأر في طبق بيتري معقمة تحتوي على 70٪ الإيثانول. إزالة الجذع من الإيثانول ووضعها في فارغة، طبق بيتري معقمة.
- باستخدام مقص الجراحية، تعقيمها في الإيثانول 70٪، وجعل شق في الجلد على الجانب البطني من الجذع بدءا من الرقبة إلى الذيل. قشر الجلد من جذع الماوس باستخدام ملقط معقمة.
- ضع جانب الأدمة الجلدية في طبق من 6 آبار يحتوي على 3 مل من محلول مضاد حيوي/مضاد للحرارة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
- تشغيل المروحية الأنسجة مع الإعدادات التالية في مكان: سمك شريحة: 1 درجة مئوية; شفرة القوة: ~ 60٪ من الحد الأقصى؛ السرعة: ~ 50٪ من الحد الأقصى.
- نقل الجلد، الجانب الأدمة إلى أسفل، إلى قرص المروحية الأنسجة المعقمة وتمرير الجلد تماما من خلال المروحية الأنسجة المنشطة 3 مرات.
- نقل الجلد المتجانس إلى أنبوب مخروطي معقم، 15 مل يحتوي على 3 مل من الجلد الهضم العازلة. امزج التعليق الناتج عن ذلك عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10-15 مرة مع ميكرومازيت P1000.
- قم بغطاء الأنبوب المخروطي واحتضن العينة في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، مما يعكس الأنبوب كل 3-5 دقائق.
- بيليه الخلايا في الجلد التجانس عن طريق الطرد المركزي أنبوب مخروطي في الدوار دلو يتأرجح في 750 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام P1000 micropipette، ببطء وتماما إزالة العازلة هضم الجلد الحرص على عدم إزعاج بيليه.
ملاحظة: يمكن حفظ جزء من الجلد كله في هذه المرحلة واستخدامها كعنصر تحكم للخطوة 3: تأكيد نقاء الخلوية. قم بإجهاد هذه الخلايا من خلال مصفاة خلايا بـ 70 درجة مئوية ثم تبدأ في الخطوة 3.5 لمزيد من المعالجة. - تماما إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام Melanocyte عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 15-20 مرات مع P1000 micropipette. إضافة حل الخلية الناتجة قطرة إلى بئر غير المصقول من طبق 6 جيدا تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام Melanocyte.
- ضع تجانس الجلد المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة التي تم تعيينها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. السماح للثقافات لاحتضان لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: خلال هذا الوقت ، فإن بعض الخلايا الليفية في تجانس الجلد تلتزم الطبق غير المصقول في حين أن الخلايا الصباغية والكيراتينية لا تزال في التعليق. - نقل الثقافة supernatant من الطبق غير المصقول إلى بئر واحد من قبل غسلها، الكولاجين المغلفة 6-جيدا طبق. إضافة G418 إلى وسائل الإعلام بحيث التركيز النهائي هو 100 نانوغرام/مل.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الليفية إلى بئر واحد من الطبق غير المصقول، التي تحتوي الآن على الخلايا الليفية الملتصقة.
- حضانة كلا الثقافتين بين عشية وضحاها في حاضنة زراعةالأنسجة تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- يستنشق بشكل منفصل وسائل الإعلام وأي حطام من كل ثقافة، 16-24 ساعة بعد الطلاء. غسل كل طبق مرتين مع 1 مل من PBS معقمة، ومن ثم إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الميلانيتة الطازجة بالإضافة إلى 100 نانوغرام / مل G418 إلى ثقافة الخلايا الصباغية و 2 مل من وسائل الإعلام الليفية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الليفية.
- بعد أن تم علاج الثقافات الخلايا الصباغية مع G418 لمدة 48 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من PBS المعقمة وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام الخلايا الصباغية الطازجة دون G418 إلى الثقافة.
ملاحظة: كما الخلايا الليفية في ثقافة الخلايا الصباغية لا تزال تموت قبالة العلاج بعد G418، وغسل الطبق مع PBS معقمة لإزالة الخلايا الميتة وإضافة وسائل الإعلام الخلايا الصباغية الطازجة. يجب أن يتم تمرير الخلايا الصباغية والثقافات الليفية عندما تصل إلى 70-80٪ من الملاءمة.
3. تأكيد نقاء الخلوية
- قم بإستنسخ وسائل الإعلام من كل ثقافة واغسل كل طبق بعناية مع 1 مل من PBS المعقمة.
- إضافة 0.7 مل من 0.25٪ تريبسين إلى كل ثقافة واحتضان الثقافات في التربسين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 دقيقة.
- إزالة الخلايا عن طريق الأنابيب التربسين ضد الجزء السفلي من الطبق باستخدام P1000 micropipette.
- إضافة 0.7 مل من وسائل الإعلام المناسبة إلى كل ثقافة trypsinized ونقل حل الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 750 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الـ supernatant بعناية والتخلص منها باستخدام P1000 micropipette.
ملاحظة: يمكن استخدام الخطوات 3.1-3.5 لتمرير الثقافات الصباغية والليفية. يجب إعادة تعليق بيليه الناتجة في وسائل الإعلام المناسبة ووضعها في طبق جديد غير مطلي (الخلايا الليفية) أو غسلها مسبقا، الكولاجين المغلفة (الخلايا الصباغية). - إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من الجليد الباردة PBS.
- تعداد ونقل 0.5 مليون خلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل المبردة مسبقا.
- كرر الخطوة 3.5 ثم قم بإعادة تعليق الخلايا في 100 μL من حل الصلاحية. احتضان تعليق الخلية لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- كرر الخطوات 3.5 إلى 3.6 مرتين.
- كرر الخطوة 3.5، ثم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من الجليد البارد ة 4٪ بارافورمالدهايد الحل. احتضان التعليق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- كرر الخطوة 3.5 مرتين، في كل مرة إعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من BSA 3٪ في 1X PBS.
- كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 درجة مئوية من 0.1٪ محلول الصابونين. احتضان التعليق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من 0.1٪ محلول الصابونين يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة للأرنب gp100، 0.5 ميكروغرام من الأرنب المضادة للفيبلاف البروتين الخاص 1 (FSP1) الأجسام المضادة و 0.025 ميكروغرام من الماوس المضادة للسيتوكيراتين 14 (K14) الأجسام المضادة. احتضان التعليق لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: في حين تم شراء الأجسام المضادة K14 مترافقة مسبقا إلى اليكسا فلور 647، تم الجمع بين الأجسام المضادة gp100 و FSP1 إلى CF 555 و CF 488، على التوالي. وينبغي أيضا أن يبدأ تلطيخ السكان الخاضعين للسيطرة في هذه الخطوة. وينبغي عزل مجموعات خلايا التحكم عن الثقافة ومعالجتها على النحو المبين في الخطوات 3-5 إلى 3-12. - كرر الخطوة 3.11 مرتين لإزالة أي جسم مضاد غير منضم.
- كرر الخطوة 3.5، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 200-400 درجة مئوية من BSA 3٪ في 1X PBS.
- تمرير حل الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب البوليستيرين 5 مل جولة القاع وتحليل الخلايا المتوترة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم قتل فئران C57Bl/6J من الذكور والإناث في أيام ما بعد الولادة 0-4 وتعرض الجلد الترونكال للإنفصال الميكانيكي كما هو موضح أعلاه. بعد التقطيع، شكلت الجلد الطين لزجة تفتقر إلى أي علامة على الأنسجة الهيكلية. الطرد المركزي من هذا الطين أدى إلى تشكيل بيليه خلية كبيرة في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي وطبقة من يعتذي العائمة على رأس supernatant. تم التخلص من هذه الطبقة الدهنية مع supernatant في حين تم إعادة تعليق بيليه الخلية المتبقية ونقلها إلى بئر غير مطلي من طبق 6-جيدا. تسببت الكثافة العالية للخلايا في ظهور الوسائط غائمة. ومع ذلك، بعد 40 دقيقة من الحضانة، لوحظت تكتلات أكبر من الخلايا والأنسجة في وسائل الإعلامويمكن رؤية الخلايا الليفية الملتصقة مع المجهر الضوئي المقلوب (الشكل 1).
تم نقل الخلايا غير الملتصقة من ثقافة الخلايا الليفية إلى بئر واحد من طبق 6-well المغلفة بالكولاجين من أجل عزل الخلايا الصباغية. إضافة G418 قتل أي الخلايا الليفية المتبقية في التجانس، وترك العديد من الخلايا الميتة العائمة في وسائل الإعلام للأيام الخمسة المقبلة (الشكل2A-C). بعد 4-5 أيام من النمو، بدأت الخلايا الصباغية مطلي تأخذ على النمط الظاهري الددرية النمطية مع حبيبات الميلانين (الشكل2C). استمر هذا النمط الظاهري بعد تمرير الثقافة (الشكل2D). في حين لوحظت مجموعات من الخلايا الكيراتينية الملوثة في البداية في الثقافات الخلايا الصباغية (الشكل2A)،فقدت هذه المجموعات عند تمرير لاحق.
وقد استخدمت تحليلات قياس التدفق لتأكيد نقاء الخلايا الصباغية الأولية الناتجة عن ذلك والثقافات الليفية. C5N الماوس الكيراتين17 ، اليوم 10 الثقافات الخلايا الصباغية الأولية واليوم 6 الثقافات الليفية الأولية ملطخة مع: المضادة gp100 (الخلايا الميلانية المتمايزة)، ومكافحة السيتوكيراتين 14 (K14؛ الكيراتينسيتات) والبروتين المضادة للفلية محددة 1 ( FSP1; الخلايا الليفية) (الشكل3). في هذه الخلايا، كان تلطيخ gp100 محددة للخلايا الصباغية الأولية، في حين لوحظت إيجابية FSP1 فقط في الخلايا الليفية (الشكل3A، B). وكان التعبير عن K14 يقتصر على الخلايا الكيراتينية C5N (الشكل3C). أجريت تحليلات إضافية لتحديد نقاء ثقافاتنا الصباغية 1 و2 و3 و4 و10 أيامبعد العزلة (الشكل 4). لم يتجاوز التلوث الليفي والكيراتيني مجتمعة 25% من إجمالي الخلايا في الثقافة (الشكل4B,C). ومع ذلك، لم تلاحظ زيادات كبيرة في gp100 حتى اليوم الرابع في الثقافة (الشكل4A). ونحن نعزو هذه الملاحظة إلى انخفاض التعبير عن gp100 في السلائف الخلايا الصباغية (أي، الميلانين)، وكثير منها يبدو التفريق تماما بحلول اليوم 10 في الثقافة (الشكل4A). وباختصار، تبين هذه البيانات أن بروتوكول العزل السريع لدينا ينتج في وقت واحد الثقافات المخصب للخلايا الصباغية والخلايا الليفية.
| خطوه # | كاشف | 1 جرو | 5 جراء |
| 1.1 | محلول الكولاجين | 1.5 مل | 4.5 مل |
| 1.2 | حجم اللوحة | 6-حسنا | 10 سم |
| 1.4 | المضادات الحيوية / المضادات الحيوية | 3 مل | 15 مل |
| 1.5 | المخزن المؤقت لهضم البشرة | 3 مل | 15 مل |
| 1.6 | وسائل الإعلام الميلانية | 6 مل | 30 مل |
| 1.7 | وسائل الإعلام الليفية | 4 مل | 20 مل |
الجدول 1: دليل إعداد الكاشف لأحجام المجموعات المختلفة.
الشكل 1 الصور التمثيلية للثقافات الليفيةالأولية. تظهر صور 20x من الخلايا الليفية مباشرة بعد العزلة (A) ، وكذلك 24 (B) و 48 (C) ح بعد العزلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الصور التمثيلية للثقافات الميلانية الأولية. تظهر صور 20x من الثقافات الصباغية 1 (A) ، 2 (B) و 4 أيام (C) بعد العزلة. يشار إلى تلوث الخلايا الكيراتينية بواسطة السهم في 'A'. (د) صورة تمثيلية للثقافات الخلايا الصباغية الأولية بعد تمرير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تدفق التقييمات السيتومترية لنقاء الثقافة. الرسوم البيانية التمثيلية التي تظهرgp100 (A ؛ الخلايا الصباغية المتمايزة) ، FSP1 (B ؛ الخلايا الليفية) و K14 (C؛ الخلايا الكيراتينية) الإيجابية في الخلايا الصباغية الأولية (اليوم 10)، الخلايا الليفية الأولية (اليوم 6) والخلايا الكيراتينية C5N. بعد التغرير على الخلايا الحية، تم تحليل 10،000 الأحداث من كل السكان. تم استخدام عناصر تحكم لون واحد للتعويض وتم تصور البيانات الناتجة مع برنامج FlowJo. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تحليل مسار الوقت من نقاء الخلايا الصباغية. الرسوم البيانية التمثيلية التي تظهر نقاء الخلايا الصباغية 1-10 أيام بعد العزلة الأولية. وكانت العينات ملطخة وتحليلها ورسم بياني لها كما هو موضح في الشكل 3. وكانت مجموعات التحكم الإيجابية والسلبية على النحو التالي: gp100-- الخلايا الصباغية البشرية (+)، الخلايا الليفية المورين الأولية (-)؛ FSP1 --الخلايا الليفية الأولية المورين (+)، الخلايا الصباغية البشرية (-)؛ K14--C5N الخلايا (+)، الخلايا الصباغية البشرية (-). يظهر متوسط الإيجابية والانحراف المعياري لثلاث ثقافات خلايا ميلانية متميزة على الأقل في الزاوية العلوية اليمنى من كل رسم بياني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أدت الثقافة في المختبر من الخلايا الصباغية الأولية والخلايا الليفية إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الجلد والمرض. هذا البروتوكول يحسن على طرق عزل الخلايا الصباغية السابقة عن طريق الحد من الوقت والدهاء التقنية اللازمة لتوليد الثقافات الخلايا الصباغية متسقة مع السماح لعزل في وقت واحد من الخلايا الليفية الجلد. وهناك رواية، عنصر توفير الوقت من هذا الإجراء هو أن الأدمة والبشرة لا تحتاج إلى فصل. بدلا من ذلك، يتم عزل خلايا الجلد باستخدام قوة تقطيع متسقة وحبيبات المروحية الأنسجة الميكانيكية جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام الانتقائية وتقنيات الطلاء. ومن خلال الحد من تعقيد المعالجة والوقت العملي، يمكّن هذا الإجراء الباحثين أيضًا من إجراء تجارب واسعة النطاق بكفاءة.
نوصي بعدة خطوات لتعزيز العائد والاتساق باستخدام هذا البروتوكول. أولا، قبل الخطوة 2.4، ونحن ننصح باستخدام ملقط منحني لكشط بعيدا أي أنسجة الدهنية من الجانب الجلدي من الجلد. هذه العملية سوف تقلل من كعكة الدهون التي شكلت بعد الطرد المركزي. بعد ذلك، التفكك الميكانيكي السليم للجلد أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول ويمكن تعزيزه عن طريق تدوير القرص المجانسة ~ 60 درجة بعد كل تمريرة من النصل. خطوة رئيسية أخرى هي التأكد من إزالة كافة "المخزن المؤقت ملخص الجلد" في الخطوة 2.10. عدم القيام بذلك سوف تعوق التصاق الخلية إلى الطبق وانخفاض كبير في العائد. لأن بيليه ليست مثبتة بقوة إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 مل في الخطوة 2.10، يمكن أن يستنشق الخلايا بسهولة إذا لم تتم إزالة supernatant ببطء. إذا كان الإزالة الشاملة للحاجز هضم الجلد هو التحدي، نقترح غسل بيليه في 2-3 مل من وسائل الإعلام Melanocyte ومن ثم تكرار الخطوات 2.9-2.10 قبل الطلاء. وأخيرا، عند إعادة تعليق بيليه الخلية في الخطوة 2.11، من المهم أن pipet بقوة من أجل تفريق أي كتل وضمان أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي على سطح طبق ثقافة الخلية. وسيتم رصد الحطام والخلايا الميتة في الثقافة خلال الأيام القليلة الأولى بعد العزلة. هذه الخلايا الميتة قد تعوق نمو الثقافة وينبغي إزالتها عن طريق غسل الطبق مع PBS ومن ثم إضافة وسائل الإعلام الطازجة.
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتوليد الخلايا الصباغية الأولية والثقافات الليفية من ماوس واحد. ومع ذلك، يمكن تعديل الإجراء بفعالية لاستيعاب مجموعات أكبر من الفئران (انظر الجدول1). بالنسبة للأترابيات الأكبر، يؤدي الجمع بين تجانس الجلد من 4-5 جراء إلى طبق 10 سم من الخلايا الصباغية 30-40% في غضون 4-5 أيام من العزلة. ويمكن استخدام العديد من التقنيات لتحسين كفاءة هذا البروتوكول عند العمل مع العديد من الحيوانات. أولا، نحن عادة قتل الحيوانات في مجموعات من أربعة، وتجهيز اثنين من الحيوانات في وقت واحد. لقد وجدنا أن الجلد المتجانس من اثنين من الجرو يمكن الجمع بين الخطوات 2.7-2.8 عن طريق زيادة حجم الجلد ملخص العازلة إلى 6 مل. لتوفير الوقت، نبدأ عزل الجلد من الزوج التالي من الجرو في حين أن المجموعة الأولى تمر التجانس والهضم. ويضمن هذا النهج عزل مجموعات الخلايا بعد وقت قصير من القتل الرحيم ويقلل من وقت المعالجة اللازم لعدة الحيوانات. عند العمل مع الفئران الأكبر سنا (أي أيام ما بعد الولادة 2-4)، وجدنا أن تمرير الجلد للمرة الرابعة من خلال المروحية الأنسجة النشطة (الخطوة 2.6) يعزز تجانس الجلد والعائد الخلوي. باستخدام هذه التقنية، لا نرى أي فرق تعتمد على العمر في العائد الخلايا الصباغية أو الليفية.
تفاصيل هذا البروتوكول كيفية توليد الثقافات الليفية والخلايا الصباغية في وقت واحد من نفس عينة الجلد. وقد لاحظنا أن الخلايا الكيراتينية في الثقافة الأولية للخلايا الصباغية لا تزال ملتزمة الطبق عندما يتم إجراء التربسينات على المدى القصير جنبا إلى جنب مع التخلص بالقوة من الخلايا الصباغية (انظر الخطوات 3.2-3.3). في حين أننا لم يحسن أساليب الانتشار لهذه الخلايا المتبقية، ونحن نفترض أن استمرار ثقافة مثل هذه السكان الملتصقة في وسائل الإعلام الكيراتينية تكمل هادىنيخ / مل G418 يمكن أن يؤدي إلى سكان الخلايا المخصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون مؤسسة دامون رونيون (جائزة الابتكار #38-16 إلى C.E.B.) وبيلوتونيا (B.M.M.) على الدعم المالي. نحن ممتنون لسي هاينز و C. فورمسبيشر اللذين قدما تعليقات لتحسين نص المخطوطة. استفاد هذا العمل من الموارد المشتركة التحليلية للستومية في مركز ولاية أوهايو، والتي يدعمها NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
