Summary
Denne protokol skitserer en hurtig metode til samtidig generere melanocyt og fibroblast kulturer fra huden af 0-4 dag gamle mus. Disse primære kulturer kan vedligeholdes og manipuleres in vitro for at studere en række fysiologisk relevante processer, herunder hudcelle biologi, pigmentering, sårheling og melanom.
Abstract
Defekter i fibroblast eller melanocyt funktion er forbundet med hudsygdomme, herunder dårlig barriere funktion, defekt sårheling, pigmentering defekter og kræft. Afgørende for forståelsen og forbedring af disse sygdomme er eksperimenter i primær fibroblast og melanocyt kulturer. Ikke desto mindre kræver nuværende protokoller for melanocyt isolation, at hudens epidermal og dermal lag er trypsinseret og manuelt frakoblet. Denne proces er tidskrævende, teknisk udfordrende og bidrager til inkonsekvente udbytter. Desuden er metoder til samtidig generering af rene fibroblast kulturer fra samme vævsprøve ikke umiddelbart tilgængelige. Her beskriver vi en forbedret protokol til isolering af melanocytter og fibroblaster fra huden på mus på postnatale dage 0-4. I denne protokol er hele huden mekanisk homogeniseret ved hjælp af en vævs chopper og derefter kortvarigt fordøjet med kollagenase og trypsin. Cellepopulationer isoleres derefter gennem selektiv plating efterfulgt af G418 behandling. Denne procedure resulterer i konsistente melanocyt og fibroblast udbytter fra en enkelt mus i mindre end 90 min. Denne protokol er også let skalerbar, så forskerne kan behandle store kohorter af dyr uden en betydelig stigning i hands-on tid. Vi viser gennem flow cytometriske vurderinger, at kulturer etableret ved hjælp af denne protokol er meget berigede for melanocytter eller fibroblaster.
Introduction
Pattedyrs hud er et flerlags organ, der beskytter kroppen mod fremmede patogener og ultra violet bestråling (UVR). Huden spiller også en afgørende rolle i homeostatiske processer såsom sårheling, temperaturregulering og D-vitaminproduktion1,2,3. Pattedyrs hud består af tre store celletyper: melanocytter, fibroblaster og keratinocytter. Disse celletyper befolker forskellige lag af huden, med keratinocytter udgør epidermis, fibroblaster bosiddende i dermis og melanocytter lokaliserer til epidermal-dermal Junction og hårsækkene4. Her, vi detaljeret en simpel procedure, der muliggør den samtidige generation af primære melanocyt og fibroblast kulturer fra murine hud.
Melanocytter er pigment-producerende celler findes i mange steder i hele den menneskelige krop, herunder basal epidermis, iris, cochlea, hjernen og hårsækkene5. Den primære funktion af melanocytter er at generere og udskille melanin-holdige vesikler kaldet melanosomer pigmentgranula5,6. Melanosomer indeholder to store klasser af melanin: brun/sort eumelanin og gul/rød pheomelanin6,7. Biokemiske processer i melanocyt regulere den relative overflod af hver melanin arter og hjælpe med at bestemme hår, hud og øjenfarve8,9. Melanin tjener også til at absorbere UVR og beskytte solbeskinnede væv fra mutagenese10.
Melanocyt dysfunktion kan forårsage pigmentære defekter og øge hudkræft modtagelighed. For eksempel, hyper-pigmenteret hud patches karakteristisk for melasma er resultatet af fokal melanin overproduktion, mens kimcelle genetiske mutationer, som kompromitterer gener involveret i melanin syntese føre til albinisme11,12 . Intim viden om melanocyt biologi er nødvendig for at udvikle strategier, der vil korrigere sådanne pigmentære defekter og i sidste ende forbedre den psykosociale velbefindende for personer, som er plaget af disse sygdomme. Underskud i melanin produktion og/eller præference syntesen af pheomelanin er også forbundet med øget hudkræft risiko10. Denne risiko menes at skyldes reduceret UVR-beskyttelse6,13. Således, metoder til at forbedre eller genoprette eumelanin produktion i melanocytter kan reducere forekomsten af hudkræft i disse populationer.
Mesenchymal fibroblaster etablere bindevæv og strukturel støtte til alle organer i kroppen, herunder dermal lag af huden14. Udskillelse af proteiner som kollagen, elastin, Laminin og fibronektin gør det muligt for fibroblaster at danne den ekstracellulære matrix (ECM), der er afgørende for vævs integriteten1,14. Fibroblaster spiller også vigtige roller i processer som sårheling, inflammation, angiogenese og kræft dannelse/progression1,15,16.
Svarende til melanocytter, defekter i fibroblast aktivering og funktion kan fremme tumor og sygdom. For eksempel, uhensigtsmæssig fibroblast aktivering almindeligvis fører til dannelsen af fibrose, som følge af den forbedrede aflejring af overskydende ECM komponenter i det omgivende væv. Som fibroblaster opretholde en stor del af kroppens strukturelle integritet, fibrose fremmer sygdomme, der påvirker talrige væv og organer, herunder idiopatisk pulmonal fibrose, systemisk sklerose, levercirrhose og hjertefibrose15. Fibroblaster spiller også en afgørende rolle i Cancer16. Cancer associeret fibroblaster (CAFs) er de mest udbredte ikke-maligne celler i mikromiljøet af mange tumorer. CAFs har vist sig at fremme tumor proliferation, progression og terapeutisk resistens ved at moduere vævs stivhed, lokal cytokin produktion og immun funktion16.
Primære cellekulturer giver forskere med genetisk Tractable modeller til at identificere og afbøde melanocyt og fibroblast defekter, der fører til sygdom. Men, nuværende metoder til at etablere melanocyt kulturer er tidskrævende og teknisk udfordrende. Behovet for trypsinisering og følsom adskillelse af epidermis og dermis bidrager til variabilitet i forsøgs udbyttet og gør det vanskeligt at udføre store eksperimenter. Endvidere, protokoller til samtidig isolere melanocytter og fibroblaster fra hele huden er i øjeblikket mangler i marken.
Vi har udviklet en metode til at reducere behandlingstrinnene, variabilitet og tid, der kræves for at etablere melanocyt-og fibroblast kulturer fra samme hele hudprøve. Ved hjælp af en mekanisk homogenisering metode efterfulgt af en kort fordøjelse, vores strategi betydeligt nedsætter mængden af hands-on tid, der kræves for at isolere primære melanocytter samtidig muliggør samtidig fibroblast isolation. Den øgede hastighed, effektivitet og konsistens i denne protokol, i kombination med evnen til at isolere melanocytter fra 0-4 dag gamle mus, giver forskerne fleksibilitet til at udføre en bredere vifte af eksperimenter end tidligere muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Få godkendelse fra din institutionelle dyreetiske Komité, før du påbegynder denne eller enhver anden undersøgelse, der involverer dyr. Eksperimenter udført i denne protokol blev godkendt af Ohio State universitetets institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC, protokol #2012A00000134).
1. forberedelse af protokollen
Bemærk: Følgende instruktioner til klargøring af reagens er velegnede til generering af 9 cm2 melanocyt og fibroblast kulturer fra en enkelt mus. Se reagens præparatets vejledning i tabel 1 for større skala isoleringer.
- 1,5 mL kollagenopløsning, der indeholder 50 μg/mL kollagen, klar til 0,1 M iseddike.
- I et laminar flow kabinet, frakke en brønd af en 6-brønd cellekultur skål med 8 μg/cm2 (1,44 ml) kollagen opløsning. Sørg for, at brønden er helt dækket af Kollagenopløsningen. Skålen inkubates ved 37 °C i 3 timer eller ved 4 °C natten over. Før brug vaskes kollagenbelagt godt to gange med 1,35 mL steril fosfat bufferet saltvand (PBS) (150 μL PBS pr. 1 cm2).
- Saml vævs chopper i et laminar flow kabinet ved forsigtigt at placere en hakke skive på vævs chopper platformen og sikre en steril klinge til den bevægelige arm.
- Forbered 3 mL 1x antibiotikum/antimykotisk opløsning ved at fortynde 100x antibiotika/antimykotisk stamopløsning i steril PBS.
- Der forberedes 3 ml frisk hudfordøjelses buffer indeholdende 10% føtal bovin serum, 1% penicillin/streptomycin opløsning, 1% L-glutamin, 10 mg/ml kollagenase type I, 0,25% Porcin trypsin og 0,02 mg/ml deoxyribonuclease i i rpmi 1640.
- 6 mL friske melanocyt-medier, der indeholder 10% føtal bovint serum, 7% heste serum, 1% penicillin/streptomycin opløsning, 1% L-glutamin, 0,5 mM di-butyryl cyklisk forstærker (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbols 13-acetat (TPA) og 200 pM koleratoksin (CT) i Næringsstof mix F-12 skinke medier.
Bemærk: Koncentrerede dbcAMP-, TPA-og CT-stamopløsninger kan laves, aliciteres og opbevares i > 1 år ved-80 °C. Base medier mangler disse komponenter kan opbevares i op til 1 måned ved 4 °C. - 4 mL fibroblast medier, der indeholder 10% føtal bovin serum, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-glutamin i Dulbecco's modificerede Eagle medium, forberedes. Dette medie kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- 40 mL 4% PARAFORMALDEHYD opløsning forberedes ved fortynding af 16% PARAFORMALDEHYD i PBS. Opbevar eventuelt overskydende ved 4 °C i 1 måned eller-20 °C i op til 1 år.
- Forbered en 1% saponin-stamopløsning ved at blande 0,5 g saponin i 50 mL PBS ved 37 °C, indtil saponin er helt opløst. Steriliser opløsningen til langtidsopbevaring ved hjælp af en 50 mL sprøjte med et 0,2 μm PES-filter. Den resulterende saponin-stamopløsning kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Forbered 200 μL 0,1% saponin-opløsning pr. mus ved at fortynde 1% saponin-stamopløsning i PBS, der indeholder 3% bovint serumalbumin (BSA).
- 1 ml levedygtig opløsning forberedes ved fortynding af 1 μL fixable levedygtighed farvestof i 1 mL PBS.
2. melanocyte og fibroblast isolation
- Euthanize 0 til 4 daggamle mandlige og/eller kvindelige C57Bl/6j unger ved hugning og fjerne ekstremiteter fra de aflives mus ved hjælp af kirurgisk saks.
- I en laminar flow kabinet, kortvarigt rulle stammen af hver mus i en steril Petri skål indeholdende 70% ethanol. Fjern stammen fra ethanol og Placer den i en tom, steril Petri skål.
- Ved hjælp af kirurgisk saks, steriliseret i 70% ethanol, lave et snit i huden på den ventrale side af stammen startende fra halsen til halen. Skræl huden fra stammen af musen ved hjælp af sterile pincet.
- Placer huden dermis side ned i en 6-brønd skål, der indeholder 3 mL 1x antibiotikum/antimykotisk opløsning og Inkuber ved stuetemperatur i 2-3 min.
- Tænd vævs chopper med følgende indstillinger på plads: skive tykkelse: 1 μm; Klinge kraft: ~ 60% af maksimum; Hastighed: ~ 50% af maksimum.
- Overfør huden, dermis side ned, til en steril vævs chopper disk og passere huden helt gennem aktiveret væv chopper 3 gange.
- Den homogeniserede hud overføres til et sterilt, 15 mL konisk rør, der indeholder 3 mL Hudfordøjelses buffer. Bland den resulterende suspension ved pipettering op og ned 10-15 gange med en P1000-mikropipette.
- Cap det koniske rør og inkubere prøven i et 37 °C vandbad i 15 min, invertering røret hver 3-5 min.
- Pellet cellerne i huden homogeniseres ved at centrifuger det koniske rør i en svingende skovl rotor ved 750 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af en P1000-mikropipette skal du langsomt og fuldstændigt fjerne hudens fordøjelses buffer, så den ikke forstyrrer pellet.
Bemærk: En del af hele huden kan gemmes på dette stadium og bruges som en kontrol for trin 3: bekræftelse af cellulær renhed. Stamme disse celler gennem en 70 μm celle si og derefter begynde på trin 3,5 for yderligere behandling. - Resuspendér celle pellet grundigt i 1 mL melanocyt-medier ved pipettering op og ned 15-20 gange med en P1000-mikropipette. Tilsæt den resulterende celle opløsning dråbevis til en ubelagt brønd af en 6-brønd skål indeholdende 1 ml melanocyte medier.
- Anbring den belagte hud homogen i en vævskultur inkubator sat til 37 °C og 5% CO2. Lad kulturerne inkubere i 40 min.
Bemærk: I løbet af denne tid, nogle fibroblaster i huden homogenatet vil holde sig til den ubelagte skål mens melanocytter og keratinocytter forbliver i suspension. - Overfør kultur supernatanten fra den ubestrøget skål til en brønd af en forvasket, kollagen-belagt 6-brønd skål. Tilsæt G418 til mediet, således at den endelige koncentration er 100 ng/mL.
- Tilsæt 2 mL fibroblast-medier til en brønd af den ubestrøget skål, der nu indeholder klæbemiddel fibroblaster.
- Inkubér begge kulturer natten over i en vævs kulturinkubator, der er sat til 37 °C og 5% CO2.
- Separat aspirere medierne og eventuelle rester fra hver kultur, 16-24 h efter plating. Vask hver skål to gange med 1 ml steril PBS, og tilsæt derefter 2 ml frisk melanocyt Media plus 100 ng/ml G418 til melanocyt kulturen og 2 ml frisk fibroblast medie til fibroblast kulturen.
- Efter melanocyt kulturer er blevet behandlet med G418 for 48 h, vask cellerne to gange med 1 mL steril PBS og tilsæt 2 mL friske melanocyt medier uden G418 til kulturen.
Bemærk: Som fibroblaster i melanocyt kulturen fortsætte med at dø af post-G418 behandling, vask skålen med sterile PBS at fjerne døde celler og tilføje friske melanocyt medier. Melanocyte og fibroblast kulturer skal være urerne, når de når 70-80% sammenhæng.
3. bekræftelse af cellernes renhed
- Aspirer medierne fra hver kultur og vask omhyggeligt hver skål med 1 mL steril PBS.
- Tilsæt 0,7 mL 0,25% trypsin til hver kultur, og Inkuber kulturerne i trypsin ved 37 °C og 5% CO2 i 1 min.
- Dislodge cellerne ved at pipettere trypsin mod bunden af skålen ved hjælp af en P1000 mikropipette.
- Der tilsættes 0,7 mL af de relevante medier til hver trypsinseret kultur, og celle opløsningen overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 750 x g i 2 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten med en P1000-mikropipette.
Bemærk: Trin 3.1-3.5 kan bruges til passage af melanocyt-og fibroblast-kulturer. Den resulterende pellet skal resuspenderes i de relevante medier og anbringes i en ny, ubestrøget (fibroblaster) eller forvasket, kollagen-belagt (melanocytter) parabol. - Resuspension af celle pellet i 0,5 mL iskold PBS.
- Optæl og Overfør 500.000 celler til et forkølet 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Gentag trin 3,5, og resuspender derefter cellerne i 100 μL levedygtig opløsning. Cellesuspensionen inkubates i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- Gentag trin 3.5-3.6 to gange.
- Gentag trin 3,5, og fastgør cellerne ved at resuspendere pellet i 100 μL iskold 4% PARAFORMALDEHYD opløsning. Inkuber suspensionen i 15 minutter ved stuetemperatur i mørket.
- Gentag trin 3,5 to gange, hver gang opsuspension af pellet i 0,5 mL 3% BSA i 1x PBS.
- Gentag trin 3,5, og resuspender derefter celle pellet i 100 μL 0,1% saponin-opløsning. Inkuber suspensionen i 15 minutter ved stuetemperatur i mørket.
- Gentag trin 3,5, og resuspender derefter celle pellet i 100 μL 0,1% saponin-opløsning, der indeholder 0,5 μg kanin anti-gp100 antistof, 0,5 μg kanin anti-fibroblast-specifik protein 1 (FSP1)-antistoffer og 0,025 μg anti-Cytokeratin 14 (K14) antistof. Suspensionen inkubates i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: Mens K14-antistoffet blev købt præ-konjugeret til Alexa fluor 647, blev de gp100 og FSP1 antistoffer konjugeret med henholdsvis CF 555 og CF 488. Farvning af kontrolpopulationer bør også påbegyndes på dette trin. Kontrol cellepopulationer bør isoleres fra kulturen og forarbejdes som beskrevet i trin 3.5-3.12. - Gentag trin 3,11 to gange for at fjerne ubundet antistof.
- Gentag trin 3,5, og resuspender derefter celle pellet i 200-400 μL 3% BSA i 1x PBS.
- Celle opløsningen passerer gennem en 40 μm celle-si i en 5 mL polystyren rund bund slange og analyserer de anspændte celler ved flow cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mænd og kvinder C57Bl/6j mus blev aflives på postnatale dage 0-4 og alminde huden blev udsat for mekanisk dissociation som beskrevet ovenfor. Efter hakning dannede huden en viskøs gylle, der manglede tegn på strukturelt væv. Centrifugering af denne gylle resulterede i dannelsen af en stor celle pellet i bunden af det koniske rør og et lag af fedtvæv svævende oven på supernatanten. Dette fedtlag blev kasseret med supernatanten, mens den resterende celle pellet blev resuspenderet og overført til en ubelagt brønd af en 6-brønd skål. Den høje densitet af celler fik medierne til at fremstå uklare. Efter 40 minutters inkubation blev der imidlertid observeret større celle-og vævs konglomerater i medierne, og overtrædende fibroblaster kunne ses med et inverteret lysmikroskop (figur 1).
De ikke-vedlige celler fra fibroblast kulturen blev overført til en brønd af en kollagen belagt 6-brønd skål for at isolere melanocytter. Tilsætning af G418 dræbte eventuelle resterende fibroblaster i homogenatet, efterlader talrige døde celler flyder i medierne for de næste 5 dage (figur 2A-C). Efter 4-5 dages vækst begyndte de belagte melanocytter at tage en stereotyp dendritisk fænotype med melanocytisk granulat (figur 2C). Denne fænotype fortsatte efter passaging af kulturen (figur 2D). Mens klynger af kontaminerende keratinocytter blev oprindeligt observeret i melanocyt kulturer (figur 2A), disse populationer blev tabt ved efterfølgende passaging.
Der blev anvendt flowcytometriske analyser til at bekræfte renheden af de resulterende primære melanocyt-og fibroblast kulturer. C5N mus keratinocytter17, dag 10 primære melanocyt kulturer og dag 6 primære fibroblast kulturer blev farvet med: anti-gp100 (differentierede melanocytter), anti-cytokeratin 14 (K14; keratinocytter) og anti-fibroblast-specifikke protein 1 ( FSP1; fibroblaster) (figur 3). I disse celler var gp100 farvning specifik for de primære melanocytter, mens FSP1 positivitet kun blev observeret i fibroblaster (figur 3A, B). Ekspression af K14 var begrænset til C5N keratinocytter (figur 3C). Yderligere analyser blev udført for at bestemme renheden af vores melanocyt kulturer 1, 2, 3, 4 og 10 dage efter isolation (figur 4). Kombineret fibroblast-og keratinocyt-kontaminering oversteg aldrig 25% af de samlede celler i kultur (figur 4B, C). Ikke desto mindre blev der ikke observeret dramatiske stigninger i gp100 indtil den fjerde dag i kulturen (figur 4A). Vi tilskriver denne observation til den reducerede ekspression af gp100 i melanocyt prækursorer (dvs. melanoblaster), hvoraf mange synes at være fuldt ud differentiere efter dag 10 i kulturen (figur 4A). Sammenfattende viser disse data, at vores hurtige isolations protokol samtidig producerer kulturer beriget til melanocytter og fibroblaster.
| Trin # | Reagens | 1 pup | 5 unger |
| 1,1 | Kollagen opløsning | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1,2 | Pladestørrelse | 6-Well | 10 cm |
| 1,4 | Antibiotika/antimykotisk opløsning | 3 mL | 15 mL |
| 1,5 | Hud fordøjelses buffer | 3 mL | 15 mL |
| 1,6 | Melanocyte Media | 6 mL | 30 mL |
| 1,7 | Fibroblast Media | 4 mL | 20 mL |
Tabel 1: reagens Præparations vejledning til forskellige kohorte størrelser.
Figur 1 : Repræsentative billeder af primære murine fibroblast kulturer. Vist er 20x billeder af fibroblaster umiddelbart efter isolation (A), samt 24 (B) og 48 (C) h efter isolation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative billeder af primære melanocyt kulturer. Vist er 20x billeder af melanocyt kulturer 1 (A), 2 (B) og 4 dage (C) efter isolation. Kontaminerende keratinocytter er indikeret med pilen i ' A '. (D) repræsentativt billede af primære melanocyt kulturer efter passaging. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Strømnings cytometriske vurderinger af kultur renhed. Repræsentative histogrammer, der viser gp100 (A; differentierede melanocytter), FSP1 (B; fibroblaster) og K14 (C; keratinocytter) positivitet i primære melanocytter (dag 10), primære fibroblaster (dag 6) og C5N keratinocytter. Efter gating på levende celler, 10.000 hændelser blev analyseret fra hver population. Enkelt farve kontrol blev brugt til kompensation og de resulterende data blev visualiseret med FlowJo software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Time kursus analyse af melanocyt renhed. Repræsentative histogrammer, der viser melanocyt renhed 1-10 dage efter første isolation. Prøverne blev plettet, analyseret og graferet som beskrevet i figur 3. Positive og negative kontrolpopulationer var som følger: gp100--humane melanocytter (+), primære murine fibroblaster (-); FSP1--primære murine fibroblaster (+), humane melanocytter (-); K14--C5N celler (+), humane melanocytter (-). Den gennemsnitlige positivitet og standardafvigelse for mindst tre forskellige melanocyt kulturer vises i øverste højre hjørne af hver graf. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-kulturen af primære melanocytter og fibroblaster har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af hudens biologi og sygdom. Denne protokol forbedrer efter forudgående melanocyt isolation metoder ved at reducere den tid og teknisk kyndige nødvendig for at generere konsistente melanocytter kulturer samtidig give mulighed for samtidig isolering af huden fibroblaster. En roman, tidsbesparende element i denne procedure er, at dermis og epidermis ikke behøver at være adskilt. I stedet er hudceller isoleret ved hjælp af den konsekvente snitning kraft og granularitet af en mekanisk vævs chopper sammen med selektive medier og plating teknikker. Ved at reducere forarbejdnings kompleksitet og hands-on tid, denne procedure giver også forskerne til at udføre store eksperimenter effektivt.
Vi anbefaler flere trin for at forbedre udbyttet og konsistensen ved hjælp af denne protokol. Først, før trin 2,4, anbefaler vi at bruge buede pincet til at skrabe ethvert fedtvæv væk fra hudsiden af huden. Denne proces vil reducere fedt kagen dannet efter centrifugering. Næste, korrekt mekanisk dissociation af huden er afgørende for succesen af denne protokol og kan forbedres ved at rotere homogenisator disk ~ 60 ° efter hvert gennemløb af bladet. Et andet vigtigt skridt er at sikre, at alle Huddigest buffer fjernes i trin 2,10. Hvis dette ikke sker, vil det hæmme celle vedhæftningen til skålen og reducere udbyttet betydeligt. Da pellet ikke er solidt fastgjort til bunden af 15 mL konisk slange i trin 2,10, kan cellerne let aspireres, hvis supernatanten ikke langsomt fjernes. Hvis grundig fjernelse af hudens fordøjelses buffer er en udfordring, foreslår vi at vaske pellet i 2-3 mL melanocyte medier og derefter gentage trin 2.9-2.10 før plating. Endelig, når suspension af celle pellet i trin 2,11, det er vigtigt at pipet energisk for at bryde op eventuelle klumper og sikre, at cellerne er jævnt fordelt på overfladen af cellen kultur parabol. Snavs og døde celler vil blive observeret i kulturen i de første par dage efter isolation. Disse døde celler kan hæmme væksten af kulturen og bør fjernes ved at vaske skålen med PBS og derefter tilføje friske medier.
Denne protokol skitserer en metode til at generere primære melanocyt og fibroblast kulturer fra en enkelt mus. Proceduren kan dog justeres effektivt til at rumme større kohorter af mus (Se tabel 1). For større kohorter resulterer kombinationen af hudhomogeni fra 4-5 unger i en 30-40% flydende 10 cm skål af melanocytter inden for 4-5 dage efter isolation. Flere teknikker kan bruges til at forbedre effektiviteten af denne protokol, når du arbejder med flere dyr. For det første, vi typisk aflive dyrene i sæt af fire, forarbejdning to dyr ad gangen. Vi har konstateret, at homogeniseret hud fra to pup kan kombineres i trin 2.7-2.8 ved at øge mængden af hud Digest buffer til 6 mL. For at spare tid begynder vi at isolere huden fra det næste par unger, mens det første sæt undergår homogenisering og fordøjelse. Denne fremgangsmåde sikrer, at cellepopulationer isoleres kort tid efter eutanasi og reducerer den behandlingstid, der kræves for flere dyr. Når du arbejder med ældre mus (dvs. postnatale dage 2-4), vi har konstateret, at passerer huden en fjerde gang gennem den aktive vævs Chopper (trin 2,6) forbedrer hudens homogenisering og cellulære udbytte. Ved hjælp af denne teknik ser vi ingen aldersafhængig forskel i melanocyt-eller fibroblast-udbyttet.
Denne protokol beskriver, hvordan man samtidig genererer fibroblast og melanocyt kulturer fra samme hudprøve. Vi har observeret, at keratinocytter i den oprindelige melanocyt kultur forbliver overholdt til skålen, når kort tids trypsinisering udføres sammen med kraftige afstødning af melanocytter (Se trin 3.2-3.3). Selv om vi ikke har optimeret formering metoder til disse resterende celler, vi hypotese, at fortsat kultur af sådanne vedblivende populationer i keratinocytproliferation medier suppleret med 100 ng/mL G418 kan resultere i en beriget cellepopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 til C.E.B.) og Pelotonia (B.M.M.) for økonomisk støtte. Vi er taknemmelige for C. Haines og C. Wormsbaecher, der fremsatte kommentarer til at forbedre manuskriptet tekst. Dette arbejde nød godt af Ohio State Comprehensive Cancer Centers analytiske cytometry-delte ressource, som understøttes af NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
