Summary
Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.
Abstract
Defecten in Fibroblast of melanocyten functie worden geassocieerd met huidziekten, waaronder een slechte barrièrefunctie, defecte wondgenezing, pigmentatie defecten en kanker. Essentieel voor het begrijpen en verbeteren van deze ziekten zijn experimenten in primaire fibroblast en melanocyten culturen. Niettemin vereisen de huidige protocollen voor melanocyten isolatie dat de epidermale en dermale lagen van de huid trypsinized zijn en handmatig worden ontsierd. Dit proces is tijdrovend, technisch uitdagend en draagt bij aan inconsistente opbrengsten. Bovendien zijn methoden voor het gelijktijdig genereren van zuivere fibroblast culturen uit hetzelfde weefselmonster niet direct beschikbaar. Hier beschrijven we een verbeterd protocol voor het isoleren van melanocyten en fibroblasten uit de huid van muizen op postnatale dagen 0-4. In dit protocol wordt de hele huid mechanisch gehomogeniseerd met behulp van een weefsel hakselaar en vervolgens kort verteerd met collagenase en trypsine. Celpopulaties worden vervolgens geïsoleerd door selectieve beplating gevolgd door G418 behandeling. Deze procedure resulteert in consistente melanocyt en fibroblast opbrengsten uit een enkele muis in minder dan 90 min. Dit protocol is ook gemakkelijk schaalbaar, waardoor onderzoekers grote cohorten van dieren kunnen verwerken zonder een aanzienlijke toename van de hands-on tijd. We tonen door flowcytometrische beoordelingen dat culturen die zijn vastgesteld met behulp van dit protocol zijn sterk verrijkt voor melanocyten of fibroblasten.
Introduction
De zoogdier huid is een meerlaagse orgel dat het lichaam beschermt tegen vreemde pathogenen en ultraviolet bestraling (UVR). De huid speelt ook een cruciale rol in homeostatische processen zoals wondgenezing, temperatuur regulering en vitamine D-productie1,2,3. Zoogdier huid bestaat uit drie belangrijke celtypen: melanocyten, fibroblasten en keratinocytes. Deze celtypen vullen verschillende lagen van de huid, met keratinocyten die de epidermis vormen, fibroblasten die zich in de dermis bevinden en melanocyten lokaliseren naar de epidermale-dermale kruising en haarfollikels4. Hier, we detail een eenvoudige procedure die de gelijktijdige generatie van primaire melanocyt en fibroblast culturen van Murine huid mogelijk maakt.
Melanocyten zijn pigment-producerende cellen gevonden op vele locaties in het menselijk lichaam, met inbegrip van de basale epidermis, Iris, cochlea, hersenen en haarfollikels5. De primaire functie van melanocyten is het genereren en afscheiden van melanoin bevattende blaasjes, de zogenaamde melanomen5,6. Melanosomes bevatten twee belangrijke klassen van Melin: bruin/zwart eumelline en geel/rood pheomelanin6,7. Biochemische processen binnen de melanocyten reguleren de relatieve abundantie van elke melendiersoort en helpen bij het bepalen van haar, huid en oogkleur8,9. Melin dient ook om UVR te absorberen en zonblootliggende weefsels te beschermen tegen mutagenese10.
Melanocyte dysfunctie kan pigmentaire defecten veroorzaken en de gevoeligheid van de huidkanker verhogen. De hypergepigmenteerde huidpleisters die kenmerkend zijn voor Melasma zijn bijvoorbeeld het resultaat van focale melinoverproductie, terwijl kiembaan genetische mutaties die genen die betrokken zijn bij melinsynthese, leiden tot albinisme11,12 . Intieme kennis van melanocyt biologie is nodig om strategieën te ontwikkelen die dergelijke pigmentaire gebreken corrigeren en uiteindelijk het psychosociale welzijn van individuen die met deze ziekten worden getroffen verbeteren. Tekorten in Melin productie en/of de preferentiële synthese van pheomelanin zijn ook geassocieerd met verhoogde huidkanker risico10. Dit risico wordt verondersteld te resulteren uit verminderde uvr-bescherming6,13. Daarom kunnen methoden voor het verbeteren of herstellen van de eumelanine-productie in melanocyten de incidentie van huidkanker in deze populaties verminderen.
Mesenchymale fibroblasten vestigen het bindweefsel en de structurele steun voor alle organen van het lichaam, inclusief de huidlaag van de huid14. Uitscheiding van eiwitten zoals collageen, elastine, laminine en fibronectin maken fibroblasten mogelijk om de extracellulaire matrix (ECM) te vormen die essentieel is voor weefsel integriteit1,14. Fibroblasten spelen ook essentiële rollen in processen zoals wondgenezing, ontsteking, angiogenese en kankervorming/progressie1,15,16.
Vergelijkbaar met melanocyten, defecten in fibroblast activering en functie kan tumorvorming en ziekte te bevorderen. Bijvoorbeeld, ongepaste fibroblast activering leidt vaak tot de vorming van fibrose, als gevolg van de verbeterde afzetting van overtollige ECM componenten in het omringende weefsel. Omdat fibroblasten een groot deel van de structurele integriteit van het lichaam behouden, bevordert fibrose ziekten die talrijke weefsels en organen treffen, waaronder idiopathische pulmonale fibrose, systemische sclerose, levercirrose en cardiale fibrose15. Fibroblasten spelen ook een cruciale rol in kanker16. Kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) zijn de meest voorkomende niet-maligne cellen in de micro omgeving van veel tumoren. CAFs is aangetoond dat het bevorderen van tumor proliferatie, progressie en therapeutische weerstand door modulerende weefsel stijfheid, lokale cytokine productie en immune functie16.
Primaire celculturen bieden onderzoekers met genetisch Tractable modellen om melanocyt en fibroblast defecten die tot ziekte leiden te identificeren en te verzachten. Echter, de huidige methoden voor het vaststellen van melanocyten culturen zijn tijdrovend en technisch uitdagend. De behoefte aan trypsinoisatie en delicate scheiding van de epidermis en dermis draagt bij aan de variabiliteit in de experimentele opbrengst en maakt het moeilijk om grootschalige experimenten uit te voeren. Bovendien, protocollen voor het gelijktijdig isoleren van melanocyten en fibroblasten uit de hele huid zijn momenteel ontbreekt in het veld.
We hebben een methode ontwikkeld om de verwerkingsstappen, variabiliteit en tijd te verminderen die nodig zijn om melanocyten en fibroblast-culturen van hetzelfde hele huid monster te maken. Met behulp van een mechanische homogenisatie methode, gevolgd door een korte spijsvertering, vermindert onze strategie de hoeveelheid hands-on tijd die nodig is om primaire melanocyten te isoleren, terwijl gelijktijdige fibroblast-isolatie mogelijk is. De toegenomen snelheid, efficiëntie en consistentie van dit protocol, in combinatie met de mogelijkheid om melanocyten te isoleren van 0-4 dag oude muizen, biedt onderzoekers de flexibiliteit om een breder scala aan experimenten uit te voeren dan voorheen mogelijk was.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
U krijgt toestemming van uw Commissie voor ethische dierenethiek voordat u begint aan deze of andere studie waarbij dieren worden betrokken. Experimenten die in dit protocol zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Ohio State University (IACUC, protocol #2012A00000134).
1. voorbereiding van het Protocol
Opmerking: De volgende instructies voor het bereiden van reagentia zijn geschikt voor het genereren van 9 cm2 melanocyten en fibroblast-culturen met één muis. Raadpleeg de handleiding voor reagens voorbereiding in tabel 1 voor grotere isolaties.
- Bereid 1,5 mL collageen oplossing met 50 μg/mL collageen in 0,1 M ijsazijn zuur.
- In een laminaire flowkast, jas een goed van een 6-well celkweek schotel met 8 μg/cm2 (1,44 ml) collageen oplossing. Zorg ervoor dat de put volledig gedekt is door de collageen oplossing. Incuberen de schaal bij 37 °C gedurende 3 uur of bij 4 °C 's nachts. Was vóór gebruik het collageen-gecoate goed tweemaal met 1,35 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (150 μL PBS per 1 cm2).
- Monteer de weefsel Chopper in een laminaire flowkast door voorzichtig een snij schijf op het weefsel Chopper platform te plaatsen en een steriel blad aan de beweegbare arm te bevestigen.
- Bereid 3 mL 1x antibioticum/Antimycotische oplossing door 100 x antibioticum/antimycotische stamoplossing in steriel PBS te verdunen.
- Bereid 3 ml verse huid digestie buffer met 10% foetaal bovien serum, 1% penicileen/streptomycine oplossing, 1% L-glutamine, 10 mg/ml Collagenase type I, 0,25% varkens trypsine en 0,02 mg/ml deoxyribonuclease I in rpmi 1640.
- Bereid 6 mL verse melanocyte media met 10% foetaal runderserum voor, 7% paarden serum, 1% penicileen/streptomycine oplossing, 1% L-glutamine, 0,5 mM di-butyryl cyclische versterker (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13-acetaat (TPA) en 200 pM cholera toxine (CT) in Nutriënt mix F-12 Ham's media.
Opmerking: Geconcentreerde dbcAMP-, TPA-en CT-voorraadoplossingen kunnen worden gemaakt, aligeciteerd en opgeslagen voor > 1 jaar bij-80 °C. Basismedia zonder deze componenten kunnen tot 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Bereid 4 mL fibroblast-media met 10% foetaal runderserum, 1% penicillaire/streptomycine en 1% L-glutamine in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco. Deze media kunnen maximaal 1 maand worden bewaard bij 4 °C.
- Bereid 40 mL 4% Paraformaldehyde oplossing voor door verdunning van 16% Paraformaldehyde in PBS. Bewaar elk overschot bij 4 °C gedurende 1 maand of-20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
- Bereid een 1% saponine stockoplossing door het mengen van 0,5 g saponine in 50 mL PBS bij 37 °C totdat de saponine volledig is opgelost. Steriliseren de oplossing voor langdurige opslag met behulp van een 50 mL spuit uitgerust met een 0,2 μm PES filter. De resulterende saponine stockoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
- Bereid 200 μL van 0,1% saponine oplossing per muis door verdunning 1% saponine voorraadoplossing in PBS met 3% boviene serumalbumine (BSA).
- Maak 1 ml van de levensvatbaarheid oplossing door 1 μL corrigeerbare levensvatbaar kleurstof in 1 ml PBS te verdunen.
2. melanocyte en fibroblast-isolatie
- Euthanize 0 tot 4 dag-oude mannelijke en/of vrouwelijke C57Bl/6J pups door onthoofding en verwijder de extremiteiten van de geëdoseerde muizen met behulp van chirurgische schaar.
- In een laminaire flowkast, rol de romp van elke muis kort in een steriel Petri schaaltje met 70% ethanol. Haal de kofferbak uit het ethanol en plaats deze in een lege, steriele Petri schaal.
- Met behulp van chirurgische schaar, gesteriliseerd in 70% ethanol, maak een incisie in de huid aan de ventrale kant van de romp vanaf de nek tot de staart. Schil de huid van de kofferbak van de muis met behulp van een steriele Tang.
- Plaats de huid van de dermis-zijde naar beneden in een 6-goed gerecht met 3 mL 1x antibioticum/Antimycotische oplossing en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min.
- Zet de weefsel Chopper met de volgende instellingen op zijn plaats: segment dikte: 1 μm; Blade Force: ~ 60% van het maximum; Snelheid: ~ 50% van het maximum.
- Breng de huid, dermis kant naar beneden, naar een steriele weefsel Chopper schijf en passeren de huid volledig door het geactiveerde weefsel Chopper 3 keer.
- Breng de gehomogeniseerde huid over in een steriele, 15 mL conische buis met 3 mL huid Vergistings buffer. Meng de resulterende suspensie door 10-15 keer met een pipet op en neer te pipetteren met een P1000 micropipetten.
- Dop de conische buis en inbroed het monster in een waterbad van 37 °C gedurende 15 minuten, waarbij de buis elke 3-5 min wordt omgekeerd.
- Pellet de cellen in de huid homogeniseren door de conische buis te centrifugeren in een draaiende emmer rotor bij 750 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een P1000 micropipet, langzaam en volledig verwijderen van de huid spijsvertering buffer wordt voorzichtig niet te storen de pellet.
Opmerking: Een deel van de hele huid kan worden opgeslagen in dit stadium en gebruikt als een controle voor stap 3: bevestiging van cellulaire zuiverheid. Stam deze cellen door een 70 μm celzeef en begin vervolgens bij stap 3,5 voor verdere verwerking. - Breng de celpellet grondig over in 1 mL melanocyte media door pipetteren op en neer 15-20 keer met een P1000 micro pipet. Voeg de resulterende celoplossing druppelsgewijs toe aan een ongecoat goed van een 6-goed gerecht met 1 ml melanocyten media.
- Plaats de vergulde huid homogenaat in een weefselkweek incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2. Laat de culturen inbroed voor 40 min.
Opmerking: Gedurende deze tijd, sommige fibroblasten in de huid homogeneren zal zich houden aan de ongecoat schotel, terwijl de melanocyten en keratinocyten blijven in suspensie. - Breng de cultuur supernatant over van het ongecoate gerecht naar een goed van een voorgewassen, collageen gecoat 6-well gerecht. Voeg G418 toe aan de media, zodat de uiteindelijke concentratie 100 ng/mL is.
- Voeg 2 mL fibroblast-media toe aan een put van de ongecoate schotel, die nu aanhandende fibroblasten bevat.
- Incuberen beide culturen 's nachts in een incubator voor weefselkweek die is ingesteld op 37 °C en 5% CO2.
- De media en eventuele puin van elke cultuur afzonderlijk aspireren, 16-24 h na het bekleden. Was elk gerecht tweemaal met 1 ml steriel PBS en voeg vervolgens 2 ml verse melanocyt Media Plus 100 ng/ml G418 toe aan de melanocyten cultuur en 2 ml verse fibroblast-media in de Fibroblast-cultuur.
- Nadat de melanocyten-culturen zijn behandeld met G418 voor 48 h, moet u de cellen tweemaal wassen met 1 ml steriele PBS en 2 ml verse melanocyt media toevoegen zonder G418 aan de cultuur.
Opmerking: Aangezien fibroblasten in de melanocyten cultuur nog steeds afsterven na G418 behandeling, was het gerecht met steriele PBS om dode cellen te verwijderen en verse melanocyt media toe te voegen. Melanocyte en fibroblast culturen moeten worden doorgegeven wanneer ze 70-80% confluency bereiken.
3. bevestiging van cellulaire zuiverheid
- Aspireren de media uit elke cultuur en wassen zorgvuldig elk gerecht met 1 mL steriele PBS.
- Voeg 0,7 mL 0,25% trypsine toe aan elke kweek en inincuberen de culturen in trypsine bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 minuut.
- Ontdoe de cellen door de trypsine tegen de bodem van het gerecht te pipetteren met behulp van een P1000 micropipet.
- Voeg aan elke trypsinoiseerde cultuur 0,7 mL van de juiste media toe en breng de celoplossing over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 750 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg met een P1000 micropipet.
Opmerking: Stappen 3.1-3.5 kan worden gebruikt voor de passage van melanocyt en fibroblast culturen. De resulterende pellet moet worden geresuspendeerd in de juiste media en geplaatst in een nieuwe, ongecoat (fibroblasten) of vooraf gewassen, collageen-gecoate (melanocyten) schotel. - Respendeer de celpellet in 0,5 mL ijskoude PBS.
- Inventariseren en overbrengen van 500.000 cellen naar een voorgekoelde 1,5 mL micro centrifugebuis.
- Herhaal stap 3,5 en hervat vervolgens de cellen in 100 μL van de levensvatbaarheid oplossing. Inincuberen de celsuspensie gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Herhaal stap 3.5-3.6 tweemaal.
- Herhaal stap 3,5 en bevestig de cellen door de pellet opnieuw op te schorten in 100 μL ijskoude 4% Paraformaldehyde oplossing. Inincuberen de suspensie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Herhaal stap 3,5 tweemaal, telkens wanneer u de pellet in 0,5 mL 3% BSA in 1x PBS resuspenit.
- Herhaal stap 3,5 en breng de celpellet in 100 μL van 0,1% saponine oplossing. Inincuberen de suspensie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Herhaal stap 3,5 en voer de celpellet opnieuw uit in 100 μL van 0,1% saponine oplossing met 0,5 μg konijn anti-GP100 antilichaam, 0,5 μg konijnen anti-fibroblast-specifiek proteïne 1 (FSP1) antilichaam en 0,025 μg muis anti-Cytokeratin 14 (K14) antilichaam. Incuberen de suspensie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
Opmerking: Terwijl het K14 antilichaam werd gekocht pre-geconjugeerd aan Alexa Fluor 647, de GP100 en FSP1 antilichamen werden geconjugeerd aan CF 555 en CF 488, respectievelijk. De kleuring van de controle populaties moet ook bij deze stap beginnen. De celpopulaties moeten worden geïsoleerd uit de cultuur en worden verwerkt zoals beschreven in stap 3.5-3.12. - Herhaal stap 3,11 tweemaal om ongebonden antilichamen te verwijderen.
- Herhaal stap 3,5 en breng de celpellet in 200-400 μL van 3% BSA in 1x PBS.
- Passeer de celoplossing via een 40 μm celzeef in een polystyreen ronde bodem buis van 5 mL en analyseer de gespannen cellen door Flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannelijke en vrouwelijke C57Bl/6j muizen werden op postnatale dagen 0-4 geëjaliseerd en de romp Skin werd onderworpen aan mechanische dissociatie zoals hierboven beschreven. Na het hakken, de huid gevormd een viskeuze slurry ontbreekt enig teken van structurele weefsel. Centrifugeren van deze slurry resulteerde in de vorming van een grote celpellet aan de onderkant van de conische buis en een laag van vetweefsel die bovenop het supernatant zweeft. Deze vetweeflaag werd weggegooid met de supernatant terwijl de resterende celpellet werd geresuspendeerd en overgebracht naar een ongecoat goed van een 6-well gerecht. De hoge celdichtheid zorgde ervoor dat de media troebel werden. Echter, na 40 minuten incubatie werden grotere cellen en weefsel conglomeraten waargenomen in de media en de aanhandige fibroblasten konden gezien worden met een omgekeerde lichtmicroscoop (Figuur 1).
De niet-aanhandige cellen uit de Fibroblast-cultuur werden overgebracht naar een put van een collageen-gecoate 6-well Dish om melanocyten te isoleren. Toevoeging van G418 gedood alle overgebleven fibroblasten in het homogenaat, waardoor tal van dode cellen zweven in de media voor de komende 5 dagen (Figuur 2A-C). Na 4-5 dagen van groei, de vergulde melanocyten begon te nemen op een stereotiepe dendritische fenotype met melanocytische korrels (Figuur 2C). Dit fenotype bleef bestaan na het doorvoeren van de cultuur (Figuur 2D). Terwijl clusters van verontreinigende keratinocyten in eerste instantie werden waargenomen in de melanocyt culturen (Figuur 2A), werden deze populaties verloren bij latere passaging.
Flow cytometrische analyses werden gebruikt om de zuiverheid van de resulterende primaire melanocyten en fibroblast culturen te bevestigen. C5N Mouse keratinocyten17, dag 10 primaire melanocyt culturen en dag 6 primaire fibroblast-culturen werden gekleurd met: anti-GP100 (gedifferentieerde melanocyten), anti-cytokeratine 14 (K14; keratinocyten) en anti-fibroblast-specifieke proteïne 1 ( FSP1; fibroblasten) (Figuur 3). In deze cellen was GP100 kleuring specifiek voor de primaire melanocyten, terwijl FSP1 positiviteit alleen werd waargenomen in fibroblasten (Figuur 3A, B). Expressie van K14 was beperkt tot C5N keratinocyten (Figuur 3C). Er werden aanvullende analyses uitgevoerd om de zuiverheid van onze melanocyten-culturen 1, 2, 3, 4 en 10 dagen na isolatie te bepalen (Figuur 4). Gecombineerde fibroblast en keratinocyten besmetting nooit meer dan 25% van de totale cellen in de cultuur (Figuur 4B, C). Niettemin werden dramatische stijgingen van GP100 niet waargenomen tot de vierde dag van de cultuur (Figuur 4A). We schrijven deze waarneming toe aan de gereduceerde uitdrukking van GP100 in de melanocyten precursoren (d.w.z. melanoblasten), waarvan er vele op dag 10 volledig differentiëren in de cultuur (Figuur 4A). Samengevat tonen deze gegevens aan dat ons Rapid Isolation protocol tegelijkertijd culturen produceert die verrijkt zijn voor melanocyten en fibroblasten.
| Stap # | Reagens | 1 pup | 5 pups |
| 1,1 | Collageen oplossing | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1,2 | Plaatgrootte | 6-well | 10 cm |
| 1,4 | Antibioticum/Antimycotische oplossing | 3 mL | 15 mL |
| 1,5 | Huid spijsvertering buffer | 3 mL | 15 mL |
| 1,6 | Melanocyte media | 6 mL | 30 mL |
| 1,7 | Fibroblast-media | 4 mL | 20 mL |
Tabel 1: reagens voorbereiding gids voor verschillende cohort groottes.
Figuur 1 : Representatieve beelden van primaire muriene fibroblast culturen. Weergegeven zijn 20 x beelden van fibroblasten onmiddellijk na isolatie (a), evenals 24 (B) en 48 (C) h post-isolatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Representatieve beelden van primaire melanocyten. Weergegeven zijn 20x beelden van melanocyten culturen 1 (a), 2 (B) en 4 dagen (C) post-isolatie. Contaminerende keratinocyten worden aangegeven door de pijl in ' A '. D) representatief beeld van primaire melanocyten culturen na het doorgangen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Flowcytometrische beoordelingen van de zuiverheid van de cultuur. Representatieve histogrammen weergegeven GP100 (A; gedifferentieerde melanocyten), FSP1 (B; fibroblasten) en K14 (C; keratinocyten) positiviteit in primaire melanocyten (dag 10), primaire fibroblasten (dag 6) en C5N keratinocytes. Na gating op levende cellen, werden 10.000 gebeurtenissen geanalyseerd van elke populatie. Enkele kleurregelaars werden gebruikt voor compensatie en de resulterende gegevens werden gevisualiseerd met FlowJo-software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Tijd cursus analyse van melanocyten zuiverheid. Representatieve histogrammen tonen de zuiverheid van melanocyten 1-10 dagen na de initiële isolatie. Monsters werden gekleurd, geanalyseerd en gegrapheerd zoals beschreven in Figuur 3. Positieve en negatieve controle populaties waren als volgt: GP100--humane melanocyten (+), primaire muriene fibroblasten (-); FSP1--primaire muriene fibroblasten (+), menselijke melanocyten (-); K14--C5N cellen (+), menselijke melanocyten (-). De gemiddelde positiviteit en standaarddeviatie voor ten minste drie verschillende melanocyt culturen wordt weergegeven in de rechterbovenhoek van elke grafiek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vitro cultuur van primaire melanocyten en fibroblasten heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van huid biologie en ziekte. Dit protocol verbetert de eerdere melanocyten isolatie methoden door het verminderen van de tijd en technische savvy die nodig zijn voor het genereren van consistente melanocyt culturen terwijl het gelijktijdige isolatie van de huid fibroblasten. Een nieuwe, tijdbesparende element van deze procedure is dat de dermis en de epidermis niet hoeven te worden gescheiden. In plaats daarvan worden huidcellen geïsoleerd met behulp van de consistente hakkracht en granulariteit van een mechanische weefsel Chopper samen met selectieve media en plating technieken. Door de verwerkings complexiteit en de hands-on tijd te verminderen, stelt deze procedure onderzoekers ook in staat grootschalige experimenten efficiënt uit te voeren.
We bevelen verschillende stappen aan om het rendement en de consistentie met dit protocol te verbeteren. Ten eerste, voorafgaand aan stap 2,4, adviseren wij het gebruik van gebogen tang om het vetweefsel van de huid te schdelen. Dit proces zal de Vetkoek gevormd na centrifugeren verminderen. Vervolgens is de juiste mechanische dissociatie van de huid essentieel voor het succes van dit protocol en kan het worden verbeterd door de homogenisator schijf ~ 60 ° te draaien na elke doorgang van het blad. Een andere belangrijke stap is ervoor te zorgen dat alle Skin Digest-buffer wordt verwijderd in stap 2,10. Als u dit niet doet, wordt de celhechting op het gerecht belemmerd en de opbrengst aanzienlijk verlaagd. Omdat de pellet in stap 2,10 niet stevig op de bodem van de conische buis van 15 mL is bevestigd, kunnen de cellen gemakkelijk worden aangezuig als het supernatant niet langzaam wordt verwijderd. Als grondige verwijdering van de huid spijsvertering buffer is een uitdaging, raden wij het wassen van de pellet in 2-3 mL melanocyten media en vervolgens herhalen stappen 2.9-2.10 voorafgaand aan het beplating. Ten slotte is het bij het opnieuw opschorten van de celpellet in stap 2,11 belangrijk om krachtig te pipetteren om eventuele klonters te breken en ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld over het oppervlak van de celkweek schaal. In de eerste paar dagen na afzondering worden er resten en dode cellen in de cultuur waargenomen. Deze dode cellen kunnen de groei van de cultuur belemmeren en moeten worden verwijderd door het gerecht met PBS te wassen en vervolgens nieuwe media toe te voegen.
Dit protocol schetst een methode voor het genereren van primaire melanocyt en fibroblast culturen van een enkele muis. De procedure kan echter effectief worden aangepast voor grotere cohorten van muizen (Zie tabel 1). Voor grotere cohorten resulteert het combineren van huid homogenaat van 4-5 pups in een 30-40% Confluent Health 10 cm schaaltje van melanocyten binnen 4-5 dagen geïsoleerd. Bij het werken met meerdere dieren kunnen verschillende technieken worden gebruikt om de efficiëntie van dit protocol te verbeteren. In de eerste plaats euthaneren we meestal de dieren in sets van vier, waarbij twee dieren tegelijk worden verwerkt. We hebben geconstateerd dat de gehomogeniseerde huid van twee pups kan worden gecombineerd in stappen 2.7-2.8 door het volume van de huid Digest buffer te verhogen tot 6 mL. Om tijd te besparen, beginnen we de huid te isoleren van het volgende paar pups terwijl de eerste set homogenisatie en spijsvertering ondergaat. Deze aanpak zorgt ervoor dat de celpopulaties kort na euthanasie worden geïsoleerd en vermindert de verwerkingstijd die nodig is voor meerdere dieren. Bij het werken met oudere muizen (d.w.z. postnatale dagen 2-4), hebben we geconstateerd dat het passeren van de huid een vierde keer door de actieve weefsel Chopper (stap 2,6) de huid homogenisatie en cellulaire opbrengst verbetert. Met behulp van deze techniek, we zien geen leeftijdsafhankelijke verschil in de melanocyt of fibroblast opbrengst.
Dit protocol Details over het gelijktijdig genereren van fibroblast en melanocyt culturen van dezelfde huid monster. We hebben geconstateerd dat keratinocyten in de initiële melanocyyt cultuur blijven gehecht aan het gerecht wanneer korte-termijn trypsinisatie wordt uitgevoerd samen met de krachtige dislodgement van melanocyten (Zie stappen 3.2-3.3). Hoewel we geen geoptimaliseerde propagatie methoden voor deze overgebleven cellen hebben, veronderstellen we dat voortdurende cultuur van dergelijke aanhangers in in Media aangevuld met 100 ng/ml G418 kan resulteren in een verrijkte celpopulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-C.E.B.) en Pelotonia (B.M.M.) voor financiële ondersteuning. We zijn dankbaar voor C. Haines en C. Wormsbaecher die opmerkingen hebben verstrekt om de tekst van het manuscript te verbeteren. Dit werk profiteerde van de Ohio State uitgebreide Cancer Center analytische Cytometry gedeelde resource die wordt ondersteund door NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A.
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K.
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T.
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
