Summary
Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.
Abstract
I difetti nella funzione fibroblasta o melanocite sono associati a malattie della pelle, tra cui scarsa funzione di barriera, guarigione difettosa delle ferite, difetti di pigmentazione e cancro. Vitali per la comprensione e il miglioramento di queste malattie sono esperimenti nelle colture primarie di fibroblasto e melanociti. Tuttavia, i protocolli attuali per l'isolamento del melanocite richiedono che gli strati epidermici e dermici della pelle siano trypsinizzati e dissociati manualmente. Questo processo richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativo e contribuisce a rendimenti incoerenti. Inoltre, i metodi per generare simultaneamente colture fibroblaste pure dallo stesso campione di tessuto non sono prontamente disponibili. Qui, descriviamo un protocollo migliorato per isolare melanociti e fibroblasti dalla pelle dei topi nei giorni postnatali 0-4. In questo protocollo, tutta la pelle viene omogeneizzata meccanicamente utilizzando un chopper di tessuto e poi brevemente digerita con collagenae e trypsina. Le popolazioni cellulari vengono poi isolate attraverso la placcatura selettiva seguita dal trattamento G418. Questa procedura si traduce in rendimenti costante di melanocite e fibroblasto da un singolo topo in meno di 90 min. Questo protocollo è anche facilmente scalabile, consentendo ai ricercatori di elaborare grandi coorti di animali senza un aumento significativo dei tempi pratici. Dimostriamo attraverso le valutazioni citometriche di flusso che le colture stabilite utilizzando questo protocollo sono altamente arricchite per melanociti o fibroblasti.
Introduction
La pelle di mammifero è un organo multistrato che protegge il corpo da patogeni estranei e irradiazione ultravioletta (UVR). La pelle svolge anche un ruolo fondamentale nei processi omeostatici come la guarigione delle ferite, la regolazione della temperatura e la produzione di vitamina D1,2,3. La pelle di mammaliana è costituita da tre tipi principali di cellule: melanociti, fibroblasti e cheratinociti. Questi tipi di cellule popolano diversi strati della pelle, con cheratinociti che compongono l'epidermide, fibroblasti che risiedono nel derma e melanociti che si localizzano alla giunzione epidermal-dermica e follicoli piliferi4. Qui, dettagliamo una semplice procedura che consente la generazione simultanea di colture primarie di melanociti e fibroblasti dalla pelle murina.
I melanociti sono cellule che producono pigmenti che si trovano in molte posizioni in tutto il corpo umano, tra cui l'epidermide basale, l'iride, la coclea, il cervello e i follicoli piliferi5. La funzione principale dei melanociti è quella di generare e secernere vesciche contenenti melanina chiamate melanosomi5,6. I melanosomi contengono due classi principali di melanina: eumelanina marrone/nera e feomelanina giallo/rosso6,7. I processi biochimici all'interno del melanocito regolano l'abbondanza relativa di ogni specie di melanina e aiutano a determinare il colore dei capelli, della pelle e degli occhi8,9. La melanina serve anche ad assorbire UVR e proteggere i tessuti esposti al sole dalla mutagenesi10.
La disfunzione melanocite può causare difetti pigmentari e aumentare la suscettibilità al cancro della pelle. Ad esempio, le macchie di pelle iperpigmentate caratteristiche del melasma sono il risultato della sovrapproduzione di melanina focale, mentre le mutazioni genetiche germinali che compromettono i geni coinvolti nella sintesi della melanina portano all'albinismo11,12 . La conoscenza intima della biologia del melanocite è necessaria per sviluppare strategie che correggano tali difetti pigmentari e, in ultima analisi, migliorino il benessere psicosociale degli individui afflitti da queste malattie. I deficit nella produzione di melanina e/o la sintesi preferenziale della feomelanina sono anche associati con un aumento del rischio di cancro della pelle10. Si ritiene che questo rischio risulti deriva dalla protezione UVR ridotta6,13. Così, metodi per migliorare o ripristinare la produzione di eumelanina in melanociti possono ridurre l'incidenza del cancro della pelle in queste popolazioni.
I fibroblasti mesenchymi stabiliscono il tessuto connettivo e il supporto strutturale per tutti gli organi del corpo, compreso lo strato dermico della pelle14. L'escrezione di proteine come collagene, elastina, laminina e fibronectina consentono ai fibroblasti di formare la matrice extracellulare (ECM) che è essenziale per l'integrità del tessuto1,14. I fibroblasti svolgono anche un ruolo essenziale in processi come la guarigione delle ferite, l'infiammazione, l'angiogenesi e la formazione/progressione del cancro1,15,16.
Simile ai melanociti, i difetti nell'attivazione e nella funzione del fibroblasto possono promuovere la tumorigenesi e la malattia. Ad esempio, l'attivazione inappropriata del fibroblasto porta comunemente alla formazione di fibrosi, risultante dalla maggiore deposizione di componenti ECM in eccesso nel tessuto circostante. Come fibroblasti mantengono gran parte dell'integrità strutturale del corpo, fibrosi promuove malattie che colpiscono numerosi tessuti e organi, tra cui fibrosi polmonare idiopatica, sclerosi sistemica, cirrosi epatica e fibrosi cardiaca15. I fibroblasti svolgono anche un ruolo fondamentale nel cancro16. I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono le cellule non maligne più abbondanti nel microambiente di molti tumori. I CAF hanno dimostrato di promuovere la proliferazione tumorale, la progressione e la resistenza terapeutica modulando la rigidità dei tessuti, la produzione di citochine locali e la funzione immunitaria16.
Le colture cellulari primarie forniscono ai ricercatori modelli geneticamente trattabili per identificare e mitigare i difetti del melanocito e del fibroblasto che portano alla malattia. Tuttavia, gli attuali metodi per stabilire le culture melanocite richiedono molto tempo e sono tecnicamente impegnativi. La necessità di provare e la delicata separazione dell'epidermide e del dermide contribuisce alla variabilità nella resa sperimentale e rende difficile eseguire esperimenti su larga scala. Inoltre, attualmente mancano protocolli per isolare simultaneamente melanociti e fibroblasti da tutta la pelle.
Abbiamo sviluppato un metodo per ridurre le fasi di lavorazione, la variabilità e il tempo necessario per stabilire le colture di melanociti e fibroblasti dallo stesso campione di pelle intero. Utilizzando un metodo di omogeneizzazione meccanica seguito da una breve digestione, la nostra strategia riduce significativamente la quantità di tempo pratico necessario per isolare i melanociti primari consentendo l'isolamento simultaneo del fibroblasto. L'aumento della velocità, dell'efficienza e della coerenza di questo protocollo, in combinazione con la capacità di isolare i melanociti dai topi vecchi di 0-4 giorni, offre ai ricercatori la flessibilità necessaria per eseguire una gamma più ampia di esperimenti rispetto a prima possibile.
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Protocol
Ottenere l'approvazione dal comitato istituzionale per l'etica degli animali prima di iniziare questo o qualsiasi altro studio sugli animali. Gli esperimenti condotti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocollo #2012A00000134) della Ohio State University.
1. Preparazione del protocollo
NOT: Le seguenti istruzioni di preparazione del reagente sono appropriate per la generazione di colture di 9 cm2 melanociti e fibroblastda da un singolo topo. Fare riferimento alla guida alla preparazione dei reagenti nella Tabella 1 per gli isolamenti su scala più ampia.
- Preparare 1,5 mL di soluzione di collagene che contiene 50 g/mL di collagene in acido acetico glaciale da 0,1 m.
- In un armadio a flusso laminare, ricoprite un pozzo di un piatto di coltura a 6 pozze mobili con 8 g/cm2 (1,44 mL) Di collagene. Assicurarsi che il pozzo sia completamente coperto dalla soluzione di collagene. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi per 3 h o a 4 gradi durante la notte. Prima dell'uso, lavare il collagene rivestito bene due volte con 1,35 mL di fosfato sterile tampinato salina (PBS) (150 - L di PBS per 1 cm2).
- Assemblare l'elicottero dei tessuti in un armadio a flusso laminare posizionando con attenzione un disco di taglio sulla piattaforma dell'elicottero dei tessuti e fissando una lama sterile al braccio mobile.
- Preparare 3 mL di 1x Antibiotic/Antimycotic Solution diluendo 100x soluzione di riserva antibiotico/antimiocotico in PBS sterile.
- Preparare 3 mL di fresco Skin Digestion Buffer contenente 10% siero bovino fetale, 1% penicillin/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 10 mg/mL collagenase tipo I, 0.25% porcine trypsin e 0.02 mg/mL deoxyribonuclelease I in RPMI 1640.
- Preparare 6 mL di Melanocite Media fresco contenente il 10% di siero bovino fetale, 7% siero di cavallo, 1% penicillina/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 0,5 mM di-butyryl cyclic AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13 acetati (TPA) e 200 pM cholera tossina (CT) in Nutrient Mix F-12 Supporti di Ham.
NOT: Le soluzioni di stock concentrate dbcAMP, TPA e CT possono essere realizzate, rivestite e conservate per >1 anno a -80 gradi centigradi. I supporti di base privi di questi componenti possono essere conservati per un massimo di 1 mese a 4 gradi centigradi. - Preparare 4 mL di Fibroblast Media contenente il 10% di siero bovino fetale, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutamina nel mezzo aquila modificato di Dulbecco. Questo supporto può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
- Preparare 40 mL del 4% di soluzione di paraformaldeide diluindo il 16% di paraformaldeide in PBS. Conservare l'eccesso a 4 gradi centigradi per 1 mese o -20 gradi centigradi per un massimo di 1 anno.
- Preparare una soluzione di scorta di saponin a 1% mescolando 0,5 g di saponina in 50 mL di PBS a 37 gradi centigradi fino a quando la saponina non si è completamente sciolta. Sterilizzare la soluzione per lo stoccaggio a lungo termine utilizzando una siringa da 50 mL dotata di un filtro PES da 0,2 m. La soluzione di riserva di saponin risultante può essere mantenuta a 4 gradi centigradi per 1 mese.
- Preparare in PBS una soluzione Saponin pari allo 0,1% dello 0,1% di Saponin mediante il diluizione di una soluzione di stock di saponin dell'1% in PBS contenente il 3% di albumina del siero bovino (BSA).
- Preparare la soluzione di 1 mL di fattibilità diluindo 1 ll di tintura di vitalità fissabile in 1 mL di PBS.
2. Isolamento melanocito e fibroblasto
- Eutanasia da 0 a 4 giorni maschi e/o femmine C57Bl/6J cuccioli di decapitazione e rimuovere le estremità dai topi eutanasia utilizzando forbici chirurgiche.
- In un armadio a flusso laminare, rotolare brevemente il tronco di ogni topo in una parabola Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Togliere il tronco dall'etanolo e metterlo in un piatto Petri vuoto e sterile.
- Utilizzando forbici chirurgiche, sterilizzate nel 70% di etanolo, fare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco a partire dal collo alla coda. Sbucciare la pelle dal tronco del topo utilizzando pinze sterili.
- Mettere il derma della pelle in un piatto a 6 pozze contenente 3 mL di 1x Soluzione antibiotica / antimicotica e incubare a temperatura ambiente per 2-3 min.
- Accendere l'elicottero di tessuto con le seguenti impostazioni in posizione: spessore Slice: 1 m; Forza lama: il 60% del massimo; Velocità: 50% del massimo.
- Trasferire la pelle, derma lato verso il basso, su un disco di taglio di tessuto sterile e passare la pelle completamente attraverso l'elicottero di tessuto attivato 3 volte.
- Trasferire la pelle omogeneizzata su un tubo conico sterile da 15 mL contenente 3 mL di buffer per la digestione della pelle. Mescolare la sospensione risultante convogliando su e giù 10-15 volte con una micropipetta P1000.
- Far fronte al tubo conico e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 min, invertendo il tubo ogni 3-5 min.
- Pellet le cellule nella pelle omogenea centrifusando il tubo conico in un rotore secchio oscillante a 750 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando una micropipetta P1000, rimuovere lentamente e completamente il buffer di digestione della pelle facendo attenzione a non disturbare il pellet.
NOT: Una porzione di pelle intera può essere salvata in questa fase e utilizzata come controllo per la Fase 3: Conferma della purezza cellulare. Filtrare queste cellule attraverso un colino cellulare di 70 m e quindi iniziare al passaggio 3.5 per un'ulteriore elaborazione. - Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 1 mL di Melanocyte Media pipetting su e giù 15-20 volte con una micropipetta P1000. Aggiungere la soluzione cellulare risultante dropwise a un pozzo non rivestito di un piatto di 6 pozze contenente 1 mL di Melanocite Media.
- Collocare l'omogenea della pelle placcata in un'incubatrice di coltura tissutale impostata a 37 e 5% di CO2. Lasciare che le colture incubano per 40 min.
NOT: Durante questo periodo, alcuni fibroblasti nella pelle omogenea aderiscono al piatto non rivestito mentre i melanociti e i cheratinociti rimangono in sospensione. - Trasferire la coltura supernatante dal piatto non rivestito a un pozzo di un piatto pre-lavato e rivestito di collagene 6 pozzetti. Aggiungere G418 al supporto in modo che la concentrazione finale sia 100 ng/mL.
- Aggiungere 2 mL di Fibroblast Media in un pozzo del piatto non rivestito, ora contenente fibroblasti aderenti.
- Incubare entrambe le colture durante la notte in un'incubatrice di coltura tissutale fissata a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
- Separatamente aspirare i media e gli eventuali detriti da ogni coltura, 16-24 h dopo la placcatura. Lavare ogni piatto due volte con 1 mL di PBS sterile, quindi aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco più 100 ng/mL G418 alla coltura melanocite e 2 mL di supporti fibroblasti freschi alla coltura fibroblasta.
- Dopo che le colture melanocite sono state trattate con G418 per 48 h, lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS sterile e aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco senza G418 alla coltura.
NOT: Poiché i fibroblasti nella coltura melanocite continuano a morire durante il trattamento post-G418, lavare il piatto con PBS sterile per rimuovere le cellule morte e aggiungere supporti melanociti freschi. Le colture di melanociti e fibroblasti devono essere accompagnate quando raggiungono il 70-80% di confluenza.
3. Conferma della purezza cellulare
- Aspirare i mezzi di comunicazione di ogni coltura e lavare con cura ogni piatto con 1 mL di PBS sterile.
- Aggiungete 0,7 mL dello 0,25% di trypsin a ogni coltura e incubate le colture in trypsin a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 1 min.
- Spostare le cellule convogliando la trypsin sul fondo del piatto utilizzando una micropipetta P1000.
- Aggiungere 0,7 mL del supporto appropriato a ogni coltura orpinizzata e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 750 x g per 2 min a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare con cura il supernatante utilizzando una micropipetta P1000.
NOT: I passaggi da 3.1-3.5 possono essere utilizzati per passare le colture melanociti e fibroblaste. Il pellet risultante deve essere risospeso nel supporto appropriato e collocato in un nuovo piatto non rivestito (fibroblasti) o pre-lavato, rivestito di collagene (melanociti). - Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di PBS ghiacciato.
- Enumerare e trasferire 0,5 milioni di cellule in un tubo di microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 mL.
- Ripetere il passaggio 3.5 e quindi risospendere nuovamente le celle in 100 gradi l di soluzione di fattibilità. Incubare la sospensione cellulare per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.
- Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,6 due volte.
- Ripetere il passaggio 3.5, quindi fissare le cellule rispendendo il pellet in 100 - L di ghiaccio freddo 4% Soluzione di paraformaldeide. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.
- Ripetere il passaggio 3.5 due volte, ogni volta ripartendo il pellet in 0,5 mL del 3% BSA in 1x PBS.
- Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare a 100 gradi L di 0,1% Soluzione Saponin. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.
- Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 .L di 0,1% Soluzione Saponin contenente 0,5 g di anticorpo anti-gp100 di coniglio, 0,5 g di anticorpo anti-fibroblasto del coniglio 1 (FSP1) e 0,025 g di anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorpo. Incubare la sospensione per 1 h a temperatura ambiente al buio.
NOT: Mentre l'anticorpo K14 fu acquistato pre-coniugato ad Alexa Fluor 647, gli anticorpi gp100 e FSP1 furono coniugati rispettivamente agli anticorpi CF 555 e CF 488. Anche la colorazione delle popolazioni di controllo dovrebbe iniziare in questa fase. Le popolazioni di cellule di controllo devono essere isolate dalle colture ed elaborate come descritto nei passaggi 3.5-3.12. - Ripetere il passaggio 3.11 due volte per rimuovere qualsiasi anticorpo non associato.
- Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 200-400 - L del 3% di BSA in 1x PBS.
- Passare la soluzione cellulare attraverso un colino di 40 m in un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL e analizzare le cellule tese per citometria di flusso.
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Representative Results
I topi Maschi e Femmine C57Bl/6J sono stati eutanasiati nei giorni postnatali 0-4 e la pelle tronica è stata sottoposta a dissociazione meccanica come descritto sopra. Dopo il taglio, la pelle formava un liquame viscoso privo di qualsiasi segno di tessuto strutturale. La centrifugazione di questo liquame ha portato alla formazione di un grande pellet cellulare nella parte inferiore del tubo conico e di uno strato di adiposo galleggiante sulla parte superiore del supernatante. Questo strato adiposo è stato scartato con il supercotto mentre il pellet cellulare rimanente è stato risospeso e trasferito in un pozzo non rivestito di un piatto di 6 pozzi. L'alta densità delle cellule ha fatto apparire i supporti nuvolosi. Tuttavia, dopo 40 min di incubazione, sono stati osservati conglomerati cellulari e tissutali più grandi nei media e i fibroblasti aderenti potevano essere visti con un microscopio luminoso invertito (Figura 1).
Le cellule non aderenti della coltura del fibroblasto sono state trasferite in un pozzo di un piatto di 6 pozze rivestito di collagene al fine di isolare i melanociti. L'aggiunta di G418 ha ucciso tutti i fibroblasti rimanenti nell'omogofenato, lasciando numerose cellule morte galleggianti nei media per i prossimi 5 giorni (Figura 2A-C). Dopo 4-5 giorni di crescita, i melanociti placcati cominciarono ad assumere un fenotipo dendritico stereotipato con granuli melanocitici (Figura 2C). Questo fenotipo persisteva dopo il passaggio delle impostazioni cultura (Figura 2D). Mentre gruppi di cheratinociti contaminati sono stati inizialmente osservati nelle culture melanociti (Figura 2A), queste popolazioni sono state perse a seguito del successivo passaggio.
Le analisi citometriche di flusso sono state utilizzate per confermare la purezza delle colture primarie di melanociti e fibroblasti. C5N cheratinociti17, giorno 10 colture melanociti primarie e giorno 6 colture fibroblaste primarie sono stati macchiati con: anti-gp100 (melanociti differenziati), anti-Cytokeratin 14 (K14; kerratinocites) e proteina anti-fibroblasto specifico 1 ( FSP1; fibroblasti) (Figura 3). In queste cellule, la colorazione gp100 era specifica per i melanociti primari, mentre la positività dell'FSP1 è stata osservata solo nei fibroblasti (Figura 3A,B). L'espressione di K14 era limitata ai cheratinociti C5N (Figura 3C). Sono state eseguite ulteriori analisi per determinare la purezza delle nostre culture melanocite 1, 2, 3, 4 e 10 giorni dopo l'isolamento (Figura 4). La contaminazione combinata di fibroblasto e cheratinocito non ha mai superato il 25% del totale delle cellule in coltura (Figura4B,C). Tuttavia, aumenti drammatici in gp100 non sono stati osservati fino al quarto giorno di cultura (Figura 4A). Attribuiamo questa osservazione all'espressione ridotta di gp100 nei precursori melanociti (cioè melanoblasti), molti dei quali appaiono completamente differenziati per giorno 10 nella coltura (Figura 4A). In sintesi, questi dati dimostrano che il nostro protocollo di isolamento rapido produce simultaneamente colture arricchite per melanociti e fibroblasti.
| passo # | Reagente | 1 cucciolo | 5 cuccioli |
| 1.1 (inquesto> | Soluzione di collagene | 1,5 mL | 4,5 mL |
| 1.2 (in questo modo) | Dimensioni piastra | 6-bene | 10 cm |
| 1.4 (in questo stato del documento in stato | Soluzione antibiotica / antimicotica | 3 mL | 15 mL |
| 1.5 1. | Buffer di digestione cutanea | 3 mL | 15 mL |
| 1.6 (in inglese) | Media Melanociti | 6 mL | 30 mL |
| 1.7 | Supporti fibroblasti | 4 mL | 20 mL |
Tabella 1: Guida alla preparazione dei reagenti per diverse dimensioni di coorte.
Figura 1 : immagini rappresentative delle colture primarie di fibroblaste murine. Sono mostrate 20 volte le immagini di fibroblasti immediatamente dopo l'isolamento (A), così come 24 (B) e 48 (C) h post-isolamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini rappresentative delle culture melanociti primarie. Sono mostrate 20 volte le immagini delle culture melanocite 1 (A), 2 (B) e 4 giorni (C) dopo l'isolamento. I cheratinociti contaminati sono indicati dalla freccia in 'A'. (D) Immagine rappresentativa delle culture melanocite primarie dopo il passaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Valutazioni citometriche di flusso della purezza della cultura. Istogrammi rappresentativi che mostrano gp100 (A; melanociti differenziati), FSP1 (B; fibroblasti) e K14 (C; cheratinociti) positività nei melanociti primari (giorno 10), fibroblasti primari (giorno 6) e C5N cheratinociti. Dopo l'analisi delle cellule vive, sono stati analizzati 10.000 eventi per ogni popolazione. I controlli a colore singolo sono stati utilizzati per la compensazione e i dati risultanti sono stati visualizzati con il software FlowJo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi del corso temporale della purezza del melanocite. Istogrammi rappresentativi che mostrano la purezza del melanocite 1-10 giorni dopo l'isolamento iniziale. I campioni sono stati macchiati, analizzati e rappresentati graficamente come descritto nella Figura 3. Le popolazioni di controllo positive e negative erano le seguenti: gp100 - melanociti umani (-), fibroblasti murini primari (-); FSP1--fibroblasti murine primari (e) , melanociti umani (-); K14--C5N cellule (-), melanociti umani (-). La positività media e la deviazione standard per almeno tre colture melanocite distinte sono mostrate nell'angolo in alto a destra di ogni grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La cultura in vitro dei melanociti primari e dei fibroblasti ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia e della malattia della pelle. Questo protocollo migliora i precedenti metodi di isolamento dei melanociti riducendo il tempo e l'esperto tecnico necessari per generare colture di melanociti coerenti, consentendo al contempo l'isolamento simultaneo dei fibroblasti cutanei. Un nuovo elemento che consente di risparmiare tempo di questa procedura è che il dermide e l'epidermide non hanno bisogno di essere separati. Invece, le cellule della pelle sono isolate utilizzando la forza di taglio costante e la granularità di un chopper di tessuto meccanico insieme a supporti selettivi e tecniche di placcatura. Riducendo la complessità dell'elaborazione e i tempi pratici, questa procedura consente anche ai ricercatori di condurre esperimenti su larga scala in modo efficiente.
Si consigliano diversi passaggi per migliorare la resa e la coerenza utilizzando questo protocollo. In primo luogo, prima del passaggio 2.4, si consiglia di utilizzare pinze curve per raschiare via qualsiasi tessuto adiposo dal lato dermico della pelle. Questo processo ridurrà la torta grassa formata dopo la centrifugazione. Successivamente, una corretta dissociazione meccanica della pelle è fondamentale per il successo di questo protocollo e può essere migliorata ruotando il disco omogeneizzatore di 60 gradi dopo ogni passaggio della lama. Un altro passaggio chiave consiste nell'assicurare che tutto il buffer del digest dell'interfaccia venga rimosso nel passaggio 2.10. In caso contrario, l'adesione cellulare al piatto e la riduzione significativa della resa. Poiché il pellet non è saldamente apposto sul fondo del tubo conico da 15 mL al punto 2.10, le cellule possono essere facilmente aspirate se il super-natante non viene rimosso lentamente. Se la rimozione accurata del buffer di digestione della pelle è una sfida, si consiglia di lavare il pellet in 2-3 mL di Melanocite Media e quindi ripetere i passaggi 2.9-2.10 prima della placcatura. Infine, quando si rassicura il pellet cellulare nel passaggio 2.11, è importante pipet vigorosamente al fine di rompere eventuali grumi e garantire che le cellule siano distribuite uniformemente sulla superficie del piatto di coltura cellulare. I detriti e le cellule morte saranno osservati nella coltura durante i primi giorni dopo l'isolamento. Queste cellule morte possono ostacolare la crescita della coltura e dovrebbero essere rimosse lavando il piatto con PBS e quindi aggiungendo supporti freschi.
Questo protocollo delinea un metodo per generare colture primarie di melanociti e fibroblasti da un singolo topo. Tuttavia, la procedura può essere regolata in modo efficace per accogliere coorti di topi più grandi (cfr. tabella 1). Per le coorti più grandi, la combinazione di omogeneo cutaneo da 4-5 cuccioli si traduce in un piatto di melanociti confluente 30-40% di melanociti entro 4-5 giorni dall'isolamento. Diverse tecniche possono essere utilizzate per migliorare l'efficienza di questo protocollo quando si lavora con più animali. In primo luogo, in genere eutanasia gli animali in set di quattro, che trattano due animali alla volta. Abbiamo scoperto che la pelle omogeneizzata di due cuccioli può essere combinata ai passaggi 2.7-2.8 aumentando il volume del buffer del digest cutaneo a 6 mL. Per risparmiare tempo, iniziamo a isolare la pelle dalla prossima coppia di cuccioli mentre il primo set è in fase di omogeneizzazione e digestione. Questo approccio assicura che le popolazioni cellulari siano isolate subito dopo l'eutanasia e riduce il tempo di lavorazione richiesto per più animali. Quando si lavora con topi più anziani (cioè, giorni postnatali 2-4), abbiamo scoperto che passare la pelle una quarta volta attraverso l'elicottero del tessuto attivo (passaggio 2.6) migliora l'omogeneizzazione della pelle e la resa cellulare. Utilizzando questa tecnica, non vediamo alcuna differenza dipendente dall'età nella resa del melanocito o del fibroblasto.
Questo protocollo descrive in dettaglio come generare simultaneamente colture fibroblaste e melanociti dallo stesso campione di pelle. Abbiamo osservato che i cheratinociti nella cultura iniziale dei melanociti rimangono rispettati al piatto quando viene eseguita la prova a breve termine insieme al forte dislocamento dei melanociti (vedi passaggi 3.2-3.3). Anche se non abbiamo ottimizzato i metodi di propagazione per queste cellule rimanenti, ipotizziamo che la continua coltura di tali popolazioni aderenti nei media cheratinociti integrata con 100 ng/mL G418 potrebbe tradursi in una popolazione cellulare arricchita.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 a C.E.B.) e Pelotonia (B.M.M.) per il sostegno finanziario. Siamo grati a C. Haines e C. Wormsbaecher che hanno fornito commenti per migliorare il testo del manoscritto. Questo lavoro ha beneficiato della risorsa condivisa Cytometry analitica dell'Ohio State Comprehensive Cancer Center, supportata da NIH P30 CA016058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
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